피부 미백을 위한 무취 글루타티온 마이크로니들 패치

추상적인:

글루타티온은 활성 산소종으로부터 단백질 티올의 산화를 방지하는 천연 노화 방지 물질입니다. 제약 산업에서 감소된 글루타티온(GSH)은 티로시나아제를 억제하는 능력으로 인해 피부 미백에 널리 사용되어 왔습니다.

그러나 열악한 투과성과 악취로 인해 피부에 사용하는 데 제한이 있습니다. 본 논문에서는 히알루론산(HA)으로 제조된 GSH가 함유된 MN(dissolving microneedle) 패치가 피부 침투력을 높이고 GSH의 악취를 감소시키는 것을 보고한다. HA는 무취 GSH 용액을 제조하기 위해 선택되었고 GSH의 캐리어로서 MN 제작에 사용되었습니다. 최대 10%의 GSH를 포함하는 MN 형성 용액으로 준비된 GSH-로딩된 MN(GSH-MN) 어레이는 패턴 균일성이 우수하고 피부에 삽입하기에 적합한 기계적 특성을 보여주었습니다. 로딩 용량이 17.4%인 GSH-MN은 돼지 피부에 삽입한 후 10분 이내에 용해되어 산화되지 않고 로딩된 GSH를 방출합니다. 이 새로운 접근 방식은 기능성 바이오폴리머를 결합하여 특징적인 GSH 냄새를 줄이고 MN 기술을 기반으로 하는 고급 경피 전달을 결합하여 통증 없이 피부 투과를 향상시킵니다. 우리는 이 기술이 많은 코스메슈티컬 분야에서 GSH의 적용을 확장할 수 있다고 믿습니다.

미백을 위해 우리는 Cistanche가 매우 우수한 미백 효과를 가지고 있으며 Cistanche의 페닐에탄올 총 배당체 추출물은 피부 멜라닌 합성의 주요 속도 제한 효소인 티로시나아제의 활성에 상당한 하향 조절 효과가 있음을 발견했습니다. 활성 효과는 피부의 멜라닌 과립 함량을 감소시킬 수 있습니다(Yang Jianhua, et al. West China Pharmaceutical Journal, 2010, 25(05):533-535). Cistanche deserticola 및 정제된 Cistanche deserticola benzene에서 주요 5가지 페닐에탄올 배당체 단량체를 연구했습니다. 일차 배양된 인간 피부 멜라닌 세포의 멜라닌 과립 함량에 대한 총 에탄올 배당체의 영향은 피부 멜라닌 합성에 상당한 억제 효과가 있는 것으로 밝혀졌습니다. Cistanche deserticola의 페닐에탄올 배당체의 자외선 스펙트럼을 스캔한 결과 UVA 및 UVB 영역에서 자외선 조사를 효과적으로 흡수할 수 있음이 밝혀졌습니다(Yang Jianhua, et al. West China Pharmaceutical Journal, 2011, 26(3):{{9 }}); Cistanche deserticola의 페닐에탄올 배당체의 항산화 활성을 조사한 결과, 모두 강력한 소거 자유가 있는 것으로 나타났습니다. Base active는 미백 효과가 있습니다.

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키워드:

글루타티온; 경피 약물 전달; 히알루론산; 미세바늘; 피부 미백.

1. 소개

글루타밀-시스테이닐-글리신의 자연 발생 티올 트리펩타이드인 글루타티온은 세포 산화 환원 반응에서 중요한 역할을 하며 멜라닌 합성 억제, 활성 산소 종으로부터 보호 및 세포 해독에 관여합니다[1,2]. 글루타티온은 체내에서 산화 및 환원 형태로 존재하지만 환원 글루타티온(GSH)은 생물학적 유용성이 높은 화합물입니다[3,4].

예를 들어, 티로시나제 억제를 통해 멜라닌 합성을 억제하는 능력으로 인해 코스메슈티컬에서 피부 미백제로 사용할 수 있습니다[5-7]. 또한 GSH는 면역 촉진제, 금속 중독 해독제, 섬유증, 녹내장 및 관절염과 같은 질병의 치료에도 사용될 수 있습니다[8-11]. 불행하게도, 그것의 낮은 생체 이용률과 불쾌한 냄새는 많은 치료적 적용에도 불구하고 진료소에서 GSH의 사용을 제한합니다.

약용 펩티드는 일반적으로 피하 주사 바늘을 사용하여 비경구 경로로 투여됩니다. 그러나 이 경로는 투여 시마다 의학적 주의가 필요하고 주사시 통증으로 인해 환자 순응도가 낮다[12,13]. GSH를 피부 전체에 전달하기 위해 국소 적용이 사용되었지만 악취가 나고 각질층(피부의 가장 바깥쪽 장벽인 SC)을 통과할 수 없어 사용이 제한됩니다[14].

최근 미세바늘(MNs)을 이용한 경피 전달의 최소 침습 시스템은 특히 위장 pH에 불안정하고 효소 분해에 민감한 펩타이드 및 단백질과 같은 생리활성 제제의 전달에 대해 의료 종사자로부터 큰 관심을 받았습니다[15].

기존 GSH 전달 방법의 한계를 극복하기 위해 탈취 바이오폴리머로 제조한 빠르게 용해되는 MN 패치를 구상하여 GSH의 효능과 환자 순응도를 향상시켰습니다. 히알루론산(HA)과 같은 생체고분자의 높은 생체적합성과 조정 가능한 물리화학적 특성은 MN 재료로서 적합한 후보가 됩니다[16,17]. 또한 다기능 그룹을 가진 바이오폴리머는 가역적 이온 상호 작용, 수소 결합 및 반 데르 발스 힘을 통해 분자와 상호 작용할 수 있으므로 높은 적재 용량과 우수한 흡착 특성에 기여합니다[18]. MN에 적재된 약물의 방출 동역학은 용해 또는 사용된 폴리머의 분해 속도를 통해 제어될 수 있기 때문에 용해 MN 플랫폼은 경피 경로를 통한 약물의 지속적이고 장기적인 방출에 적용될 수 있습니다[19-22].

여기서 우리는 탈취된 바이오폴리머로 제조된 용해성 MN 패치를 사용하여 GSH의 효율적이고 무취인 경피 전달을 위한 새로운 접근법을 보고합니다. 무취 GSH 제형에 대한 여러 바이오폴리머를 스크리닝한 후, HA를 MN용 재료로 선택하여 GSH-로딩된 MN 패치 제조에 사용하였다. 세포 독성 및 티로시나아제 억제 연구에 의해 확인된 바와 같이, HA MN에 로딩된 GSH의 양은 최적의 항멜라닌 생성 효과를 가지며 세포 독성이 더 낮은 것으로 결정되었습니다. GSH-로딩된 HA MN(GSH-HA MN) 어레이는 균일한 질감, 기하학, 원하는 기계적 강도 및 피부 침투 능력에 대해 평가되었습니다. GSH-HA MN 패치를 동물 피부 조직에 적용한 후, 이들의 용해 능력 및 약물 방출 패턴을 연구하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. 재료

환원 글루타티온(GSH), 젤라틴(돼지 피부에서 추출), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) , 코지산(KA)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서, 히알루론산나트륨(100k, HA)은 SNVIA(한국 부산)에서 구입하였다. 콘드로이틴 설페이트(CS)는 Wako Chemicals(Osaka, Japan)에서 구입하였다. -멜라닌 세포 자극 호르몬(-MSH)은 TOCRIS(Bristol, UK)에서 구입하였고, FITC(fluorescein isothiocyanate) 표지된 annexin V를 이용한 세포사멸 검출 키트는 BD Biosciences(Bedford, MA, USA)에서 구입하였다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 성형을 위한 액상 프리폴리머(Sylgard 184A)와 경화제(Sylgard 184B)는 Dow Corning(Midland, MI, USA)에서 구입하였다. 모든 화학 물질은 추가 정제 없이 사용되었습니다. 털을 제거한 돼지가죽은 동네 정육점에서 구입하여 실험에 사용하기 전까지 영하 20도에서 보관하였다.

2.2. 세포 배양

체외 연구에 사용된 인간 각질세포(HaCaT 세포)와 마우스 유래 흑색종 세포주(B16F10)는 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 입수하였다. 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS, Hyclone), 2mM 글루타민(Sigma-Aldrich), 100U/mL 페니실린(Hyclone), 및 100 ug/mL streptomycin(GenDEPOT, Barker, TX, USA), 37 ºC, 5% CO2의 가습 대기.

2.3. 냄새 테스트

GSH 악취에 대한 바이오폴리머의 감소 효과를 평가하기 위해 후각 채점 방법을 수행하였다[4]. 바이오폴리머(소듐하이알루로네이트, 젤라틴, 콘드로이틴설페이트)의 양은 전체 용액의 10 중량%로 고정하였고 GSH는 서로 다른 농도(1.0 퍼센트, 2.{ {9}}%, 2.5% 및 5.0중량%) 탈이온수(Di). 혼합 30분 후, 10명의 지원자로 구성된 테스트 패널은 바이오폴리머와 GSH의 혼합물을 포함하는 용액의 냄새를 맡았습니다. 바이오폴리머가 없는 GSH 용액은 혼합 시료의 유황 냄새를 비교하기 위한 기준으로 사용되었습니다.

각 지원자는 다음 5-점 척도를 사용하여 혼합 용액의 냄새에 대한 인식을 표시하도록 요청받았습니다: 1: 냄새 없음, 2: 인지할 수 있는 냄새, 3: 쉽게 인지할 수 있는 냄새, 4: 강한 냄새, 5: 강한 냄새 .

2.4. 가스 크로마토그래피(GC) 측정

스코어링 결과에 기초하여, 방출된 H2S의 양은 PFPD(Pulsed Frame Photometric Detector)를 사용하는 가스 크로마토그래피(Shimadzu, Tokyo, Japan)에 의해 모든 GSH-HA 제제에 대해 정량화되었다[23,24]. GSH 1%, 2.5%, 5%(중량) 용액을 HA 10%(중량)와 혼합하여 10mL 갈색 진공 바이알에 1mL를 주입하였다. 바이알을 40℃ 오븐에 1시간 동안 보관한 후 꺼냈다. 생성된 가스(100 μL)를 주사기를 사용하여 수집하고 PFPD가 장착된 Shimadzu GC에 주입했습니다. 주요 유황 화합물의 분리는 30m × 0.25mm id 유리 컬럼(DB-1, J&W)에서 90℃, 운반체 흐름(질소) 1mL/분에서 이루어졌습니다. 검출 및 주입 온도는 각각 250 및 150℃였다. 표준 시료를 사용하여 H2S의 양을 측정하였다. PFPD의 민감도는 H2S에 대해 10ppb였습니다. 모든 샘플의 데이터는 표준 곡선의 범위에 있는 것으로 확인되었습니다.

2.5. 세포 독성 테스트

GSH의 세포독성은 MTT assay와 annexin V-FITC 염색을 이용하여 평가하였다. 요약하면, HaCaT 세포(세포 번호: 1 × 104 )를 0.1, 0.25, {{10}}.5로 처리했습니다. , 및 1.0 DMEM 배지에서 GSH의 mg/mL. 24, 48 및 72시간 처리 후, 50 μL의 MTT 용액을 세포에 첨가하고 배지를 흡인하기 전에 1시간 동안 배양하였다. 그 후 100 μL의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 MULTISKAN GO reader(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 540 nm의 흡광도를 측정하여 생존 세포의 백분율을 계산하였다. Apoptosis는 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI)로 동시에 염색하여 측정하였다. HaCaT 세포(1 × 106 )를 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0 mg/mL의 GSH로 처리하였다. 72시간 처리 후, 세포를 수확하고, 트립신화하고, 차가운 PBS로 세척하고, 아넥신 V-FITC 용액 및 PI를 함유하는 1X 결합 완충액으로 염색하였다. 이어서, 세포를 암실에서 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 1시간 이내에 유세포 분석기로 분석했습니다. Becton Dickinson FACSscan 유세포 분석기와 BD FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포사멸 및 생세포를 모두 분석했습니다.

2.6. 세포 멜라닌 함량 및 Tyrosinase 활성 측정

제안된 GSH의 미백 효과는 티로시나제 활성을 억제하는 능력을 측정하여 평가되었습니다. 요약하면, 마우스 유래 B16F10 흑색종 세포를 6-웰 배양 플레이트에 5.0 × 104 세포/웰의 농도로 접종하고 허용했습니다. 밤새 부착합니다. 세포를 {{10}}(blank), 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0 mg/mL GSH 및 10 μM 코지산( KA)를 양성 대조군으로 4시간 동안 처리한 후 -MSH(1 μM)로 72시간 동안 자극하여 티로시나제 활성을 유도했습니다. 배지를 제거한 후, 세포를 500 μL의 1N NaOH에 용해시키고 60℃에서 1시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시켰다. 멜라닌 함량은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 측정했습니다. 티로시나제 활성을 위해, 세포를 1% 트리톤 X-100 5μL 및 0.1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 5μL를 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5) 100μL에서 용해시켰다. 10000g(30분, 4°C)에서 원심분리한 후, 20 μL의 l-3,4-dihydroxyphenylalanine(l-DOPA)이 포함된 상층액을 {{ 44}}웰 플레이트에 놓고 37ºC에서 492nm에서 흡광도를 측정했습니다.

2.7. GSH-MN 패치 제작

총알 모양의 GSH-MN 어레이(10 × 10 MNs/cm2 )는 10% HA 수용액의 용매 주조에 의해 재사용 가능한 PDMS 몰드로 제작되었습니다. 다양한 GSH 농도(0퍼센트, 1.0퍼센트, 2.5퍼센트 및 5.0중량퍼센트)의 용액. 총알 모양의 구멍이 있는 네거티브 PDMS 몰드는 마이크로머시닝[16]으로 제조된 금속 MN 어레이에서 복제되었습니다. MN 형성 용액(HA 또는 HA/GSH 용액 350μL)을 피펫으로 PDMS 몰드에 넣고 진공 상태에서 탈기한 후 40°C에서 12시간 동안 건조했습니다. 건조된 MN 어레이를 몰드에서 부드럽게 벗겨냈습니다. 제작된 MN 어레이의 형태는 디지털(AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan) 및 광학(Eclipse TS100, Nikon, Japan) 현미경을 사용하여 특성화되었습니다. 0, 1, 2.5, 5mg/mL의 GSH를 포함하는 HA MN은 GSH0-HA MN, GSH1-HA MN, GSH25-HA MN으로 명명했습니다. 각각 GSH5-HA MN입니다.

2.8. 골절 테스트

단일 HA MN 및 GSH가 로드된 HA MN(GSH0-HA MN, GSH1-HA MN 및 GSH2.5-HA MN)은 시아노아크릴레이트 접착제(Loctite 4{{ 7}}1, Loctite Corp, Dublin, Ireland) 만능 시험기(UTM, A&D 5000H, A&D Sales Corp, 대구, 한국)의 하단 그립에 있는 장착 스터브를 고정합니다. 기계적 테스터의 상부 그립을 0.1mm/min의 속도로 MN 팁을 향해 축 방향으로 아래로 이동했습니다. 항복력은 프로브 변위 속도의 함수로 측정되었으며 뉴턴(N)으로 표시되었습니다.

2.9. 피부 삽입 시험

피부 삽입 시험은 MN의 침투 능력, 가능한 왜곡 정도 및 삽입 중 가능한 조직 변형을 확인하기 위해 수행되었습니다. GSH0-HA MN, GSH1-HA MN 및 GSH2.5-HA MN은 UTM의 상부 그립이 있는 부착물을 통해 금속 표면에 시아노아크릴레이트 접착제로 고정하고 기계 시험기의 바닥에 놓인 절제된 돼지 피부(3 × 3cm2, ~2mm 두께)에 10mm/min의 힘을 가합니다[25]. 돼지 피부는 메스를 이용하여 피하지방층을 제거한 후 사용하였다.

2.10. 용출 시험

GSH2.5-HA MN을 여러 미리 결정된 시점(3, 5, 7 및 10분)에 돼지 피부(3 × 3cm2)에 적용했습니다. MN 패치를 제거한 후 광학현미경(Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 MN 팁의 용해 높이를 측정하였다.

GSH2.5-HA MN 패치의 펀치 마크를 확인하기 위해 0.5mg의 염료(Rhodamine B)를 2.5%(중량 기준) 혼합 GSH 용액 1mL에 첨가하여 MN을 준비했습니다. . 이어서, 염료가 혼합된 용액을 이용한 MN 어레이 제작은 상기와 동일한 방법으로 제작하였다. MN 어레이로부터 형성된 펀치 마크, 돼지 피부로 번역되는 동안의 위치 및 조직 편향 정도를 디지털 현미경(AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan)에서 분석하였다. 삽입 후 MN의 형태 변화를 광학 현미경으로 검사했습니다.

2.11. 적재 용량 및 캡슐화 효율

HA MN에 로드된 GSH의 양을 결정하기 위해 GSH{{0}}HA MN 및 GSH2.5-HA MN의 MN 팁을 각각 절단하여 PBS(pH 7.4 ) 24시간 동안. MN 팁의 GSH 양은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, e2695, Waters, USA)를 사용하여 10 µL의 시료 용액을 SunFire C18 컬럼(100Å, 5 µm, 4.6 × 250mm, 워터스). HPLC는 아세토니트릴 물(5:95)과 0.8mL/분의 유속으로 이동상으로 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 작동되었습니다. HPLC 데이터를 기반으로 로딩 용량(LC)과 캡슐화 효율(EE)은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다. 로딩 용량(백분율)=men mtot × 100 (1). 캡슐화 효율(백분율)=men min × 100 (2)

여기서 men은 MN 팁의 캡슐화된 약물 양을 나타내고, most는 MN 팁의 총 질량이며, min은 MN 형성 용액의 약물 양을 나타냅니다[26].

2.12. 체외 GSH 피부 침투 시험

GSH2.5-HA MN 패치에서 방출된 감소된 GSH의 피부에 걸친 생체외 투과 동역학을 조사하기 위해 정적 확산 프란츠 셀 테스트를 수행하여 GSH2를 통한 시간 의존적 GSH 방출 속도를 계산했습니다.{ {5}}참조 GSH-HA 솔루션과 함께 피부를 통한 HA MN 및 확산. GSH2.5-HA MN 패치 및 350 µL GSH2.5-MN 제작에 사용된 HA 용액을 절제된 Sprague-Dawley(SD) 쥐 피부(~2mm 두께)에 적용했습니다. 프란츠 확산 셀의 도너 챔버와 수용체 챔버 사이에 각각 배치됩니다. 쥐의 피부에 GSH2.5-HA MN 패치를 삽입한 후 하이드로콜로이드 접착 패치(NeoDerm Roll, EVERAID, Yangsan, Korea)를 MN backing에 도포하여 약물을 전달하였다. 사이드 암이 있는 수용체 챔버는 22mL의 신선한 PBS 버퍼(pH 7.4)로 채워지고 37ºC로 유지되었습니다[27]. 각 시점(0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 및 48시간)마다 프란츠 세포 수용체 챔버에서 샘플 1밀리리터를 빼내고 동일한 양의 신선한 PBS(pH 7.4)로 다시 채웠습니다. ). GSH2.5-HA MN 패치는 1시간 후 쥐 피부에서 제거되었습니다. MN 팁에서 방출되어 쥐의 피부를 통해 투과된 GSH의 양은 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 HPLC로 분석했습니다. GSH는 385 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였고 약물의 농도는 mg으로 표시하였다.

2.13. 통계 분석

모든 결과는 평균±표준편차(SD)로 표현되며 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 분석됩니다. 유의 수준은 p < 0.05로 설정되었습니다.

3. 결과 및 논의

3.1. 탈취 가능한 폴리머 선택을 위한 스크리닝 테스트

악취 강도에 기초하여, 유리 GSH 및 GSH-바이오폴리머 제제의 자동 분해로부터 H2S 방출을 평가하기 위해 1-5의 척도를 사용하여 스코어링 분석을 수행하였다. 실험은 무작위로 선택된 남녀의 건강한 지원자 10명을 포함하여 수행되었습니다. 강한 냄새는 더 많은 양의 H2S 방출과 관련이 있었고 그 반대의 경우도 마찬가지였습니다. 젤라틴(4.75 ± 0.2) 및 CS-GSH(3.25 ± 0.95)의 모든 농도(1.0–5.0중량%) HA-GSH(1.5 ± 0.35)가 GSH 단독(2.75 ± 0.61; 그림 1a)보다 낮은 점수를 받은 반면 제형은 더 높은 점수를 받았습니다. GSH 단독과 비교하여 젤라틴-GSH 및 CS-GSH 제제의 높은 점수는 방출된 H2S의 냄새에 더하여 특유의 냄새 때문이었습니다.

나중에, 악취 점수에 기초하여 방출된 H2S(ppm 단위)의 정량적 추정은 상이한 농도에서 GSH-HA 제제에 대해 GC에 의해 수행되었습니다. 방출된 H2S의 양은 최소 1.0퍼센트 및 2.5퍼센트(0.55 ± 0.01 및 {{13} }.49 ± 0.03ppm) 및 최대 5.0퍼센트(1.03 ± 0.{{27} }1ppm)의 GSH 함유. 모든 농도에서 값은 GSH 단독보다 낮은 것으로 나타났다(0.59 ± 0.03, 0.75 ± 0.04, 1.15 GSH의 1.0%, 2.5% 및 5%에 대해 각각 ±0.05, 그림 1b). 이 결과의 이유는 HA의 치환된 Na 플러스가 보충 그림 S1에 표시된 반응식을 통해 GSH의 티올 그룹과 반응하기 때문입니다. 악취 감소는 H2S 생성 감소로 인한 것임을 확인하였다(보충 그림 S1)[28,29]. 이러한 결과는 HA가 젤라틴 및 CS에 비해 더 나은 탈취 효과를 나타내므로 본 연구에서 MN 제조에 선택되었습니다. 방출된 H2S에 대한 HA의 최대 탈취 능력은 1.0%, 2.5% 및 5.0% GSH-HA 제형에서 관찰되었기 때문에(그림 1b), 이 세 가지 농도가 MN 제조를 위해 선택되었습니다.

3.2. GSH가 세포독성 및 Tyrosinase 활성에 미치는 영향

MTT 분석은 GSH가 HaCal에 세포 독성이 있는지 여부를 결정하는 데 사용되었습니다. FACS(Fluorous-activated cell sorter) 분석은 annexin V를 이용하여 수행되었는데, 세포 표면 PI에 특이적이고 강한 바람을 불어 세포 사멸 또는 괴사 세포 사멸이 관찰되었는지 여부를 확인했습니다(30GSH0 .2-1.0 mg/mL은 비히클 처리된 세포와 비교하여 72에서 생존 세포의 비율을 크게 변화시키지 않았다(그림 2a) HaCaT 세포에 대한 GSH의 세포 독성 효과는 흐름에 의해 확인되지 않았다. annexin V를 사용한 세포측정 분석. HaCaT 세포를 0, 0.1, 0.25, 0.5 또는 1 mgmL GSH에 72시간 동안 노출시킨 결과 농도 의존적 ​​세포 사멸 유도(그림 2b,c) GSH에 노출된 경우 세포 사멸 세포가 크게 증가하지 않았습니다(7.90 + 1.02-13.99 + 0.37% ) 비히클 처리된 세포와 비교하여 살아있는 세포의 비율 감소(88.38 + 1.02-80.81 + 0.67%)(4.85 + 0.72% 및 90.47 + 0.93%) 그림 2b,c) 이러한 결과는 GSH가 인간 케라티노사이트에 독성이 없으며 인간 피부에 안전하게 사용될 수 있음을 시사합니다.

Tyrosinase는 멜라닌 합성을 담당하는 효소입니다. GSH의 미백효과는 멜라닌 생성 억제율과 멜라닌 생성에서 티로시나제 속도 제한 효소의 활성을 측정하여 평가하였다. B16F10 세포를 10 uM KA 및 GSH(0.1–1.0 mg/mL)로 4시간 동안 전처리한 다음 -MSH(1 µM)로 72시간 동안 자극했습니다. GSH 처리는 -MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 상당히 억제했습니다(그림 3a). 이 발견에 의해, -MSH-유도 티로시나제 활성(GSH 미처리의 345.60 ± 18.29%)은 1 mg/mL GSH 처리에서 207.34 2020 ± 2.78%로 크게 감소했습니다(그림 3b).

3.3. GSH가 탑재된 HA MN의 제작 및 기계적 특성

최소한의 침습적 방식으로 피부에 GSH를 전달하기 위해 점수 테스트 및 가스 크로마토그래피 데이터로 확인된 H2S 감소 능력을 기반으로 HA를 MN 재료로 선택했습니다(그림 1). HA 및 GSH를 포함하는 MN 형성 용액은 GSH-로딩된 HA MN(GSH-HA MN) 어레이의 준비에 사용되었습니다. 총알 모양의 캐비티가 있는 PDMS 몰드를 사용하여 솔벤트 캐스팅 방법을 통해 어레이를 준비했습니다. GSH-MN 어레이(100 MNs/cm2)는 높이 770 ± 5 µm, 밑면 직경 172.25 ± 2.5 µm, 팁 직경 7.8 ± 2.5 µm, 각도 40 ± 2.5°의 균일한 패턴을 나타냈습니다. (그림 4a). MN의 형상은 적용 부위에서 통증 및 모세혈관 출혈을 피하기 위해 최소한의 혈관 또는 신경 손상으로 SC 층의 침투 및 GSH의 경피 전달을 보장하도록 결정되었습니다. GSH-HA MN의 균일한 특징은 2.5% GSH를 포함하는 MN 형성 용액을 사용하여 MN을 준비했을 때 얻어졌지만 일부 구부러진 MN은 GSH의 고농도(5%)로 준비했을 때 관찰되었습니다(보충 그림 S2).

GSH-HA MN의 기계적 특성은 압축 모드에서 조사되었습니다. UTM의 바닥면에 시아노아크릴레이트 접착제로 부착된 단일 MN은 0.1mm/min의 속도로 기계의 상단 그립을 사용하여 부착된 평평한 금속판에 의해 축 방향으로 압축되었습니다(그림 4a–c). . 항복력 또는 재료가 탄성을 잃는 데 필요한 힘은 0.25, 0.39 및 0.4{{1{{17}로 결정되었습니다. }}}} 편차가 ±0인 N.0GSH0-HA MN, GSH1-HA MN 및 GSH2의 경우5-HA 각각 MN(그림 4d). 삽입력은 0.36 ± 0.003, 0.39 ± 0.015, GSH0-HA MNs, GSH{{30 }}HA MN 및 GSH2.5-HA MN. 항복력과 삽입력 모두 골절, 왜곡 또는 조직 변형 없이 돼지 피부에 MN을 삽입하기에 충분한 것으로 나타났습니다.

3.4. GSH-HA MN의 체외 용해 테스트

바이오폴리머의 용해 시간은 모든 제제의 약물 방출 패턴과 작용 개시를 결정합니다. GSH의 방출에 필요한 시간을 예측하기 위해 인간 피부와 구조적으로 유사한 돼지 피부에 단일 MN(GSH, 5-HA)을 삽입했습니다. 현미경 분석은 MN의 시간 의존적 용해를 보여주었다. GSH-MN을 피부에 12분 동안 적용한 후 MN 팁이 완전히 용해되어 빠른 방출 패턴이 시작되었습니다(그림 5a,b). GSH 5-HA MN 패치의 피부 침투를 확인하기 위해 로다민 염료가 적재된 MN 패치(1.5 x 1.5 cm)를 돼지 피부에 20 N의 삽입력으로 1분 동안 적용했습니다. 염료가 적재된 MN 패치를 제거한 후 각 바늘에 해당하는 염료 반점 배열을 관찰하여 GSH 5-HA MN이 피부에 삽입되었음을 확인했습니다(그림 5c).

적재 용량은 운반체에 적재할 수 있는 최대 약물량을 말하며 적재 효율을 결정합니다. GSH-HA MN 패치의 적재 용량은 MN 팁의 적재된 약물(GSH)의 질량을 GSH-HA MN 팁의 총 질량으로 나눈 값으로 정의됩니다. 로딩 효율을 확인하기 위해 GSH가 로딩된 MN 팁을 절단하여 PBS(pH 7.4)에 녹이고 팁에 로딩된 GSH의 양을 HPLC로 분석하였다. 100 MN 팁의 GSH 로딩량은 {{10}}.29 ± {{20}}.03 GSH1-HA MN 패치 및 GSH2.5-HA MN 패치의 경우 각각 mg 및 0.56 ± 0.03 mg. GSH-MN 팁(100 MN, 2 ± 0.2 mg)의 총 질량을 고려할 때 적재 용량은 11.26 ± 1.24% 및 21.33 ± 1.13%인 반면 캡슐화 효율은 8.36 ± 0.92% 및 6.34 ± 0.34%인 것으로 나타났습니다. GSH1-HA MN 및 GSH2.5-HA MN(표 1). MN 형성 솔루션의 HA:GSH 중량비(10:1 또는 10:2.5)와 MN 패치의 GSH 로딩 용량 사이의 유사한 값은 MN 패치에서 GSH의 균일한 분포를 시사합니다.

3.5. GSH-HA MN 패치의 Ex Vivo 피부 투과 테스트

GSH,5-HA MN에서 GSH 방출의 시작 및 지속 시간을 추정하기 위해 SD 쥐의 피부를 모의 생리학적 조건에 두어 48시간 동안 Franz 세포 연구를 수행했습니다(그림 6). GSH 5-HA MN은 초기에 상대적으로 빠른 선형 릴리스 동역학을 보여주었습니다.12시간 후 시간이 지남에 따라 방출 속도가 느려집니다.

MN 적용 후 피부를 통해 투과된 GSH 양은 실험의 초기 12시간 동안 ~1.4mg이었고 48시간 동안 ~1.6mg에 도달했습니다. MN 팁에 적재된 양보다 많은 양의 GSH가 배송되었습니다. 이 양에는 GSH2.5-HA MN 팁에 로드된 GSH뿐만 아니라 약물 저장소로 기본 레이어에 통합된 GSH도 포함됩니다. 반면 GSH-HA 용액은 GSH의 피부 투과율이 좋지 않아 소량(~0.2 mg)으로 천천히 전달되었다. 카르복시메틸셀룰로스 및 트레할로오스로 제조된 MN을 사용한 인간 성장 호르몬의 경피 전달은 MN 적용 후 짧은 tmax(~30분)를 나타내었고 SC 주사의 것과 유사한 약동학적 프로파일을 나타내었으므로 [19], GSH-HA 패치는 흡수 특성은 전신 GSH 전달에 적용할 수 있습니다. 체외 연구에 따르면 1mg/mL GSH 처리는 멜라닌 생성과 티로시나제 활성을 유의하게 억제했습니다. 피부의 간질액의 작은 부피(~150μL/cm2)를 고려할 때[31], HA MN 패치(1.6mg GSH/1cm2 MN 패치)에 의해 국소적으로 전달된 GSH는 MN 용해 과정에서 항산화제로 작용할 수 있습니다. MN에 적재된 GSH의 방출 동역학은 MN 물질의 가교 밀도에 의해 제어될 수 있기 때문에[32,33], 팽윤성 MN 플랫폼은 최소한의 부작용으로 효과적인 GSH 전달에 유리할 것입니다.

4. 결론

탈취력(점수)과 GC 결과를 바탕으로 GSH의 무취 경피 전달을 위한 생분해성 MN 패치를 개발하기 위해 HA를 선택했습니다. HA는 GSH의 악취를 젤라틴과 CS보다 더 효율적으로 가렸습니다. HA-MNs 패치(GSH2.5-HA)는 손상 없이 피부를 관통할 수 있는 충분한 내구성을 가지고 있었습니다. HA-MNs 패치(GSH1-HA 및 GSH2.5-HA)에서 GSH의 릴리스는 각각의 실험에서 볼 수 있듯이 주어진 기간 동안 균일한 것으로 나타났습니다. 세포 독성 및 티로시나제 억제 연구는 1mg/mL의 GSH 농도가 피부 미백 목적에 안전하고 효과적인 것으로 나타났습니다. 전반적으로, 개발된 HA MN 패치가 GSH 또는 유해하거나 수용할 수 없는 관능 특성을 가진 약물의 경피 전달을 위한 유망한 플랫폼으로서의 실현 가능성은 이 연구에서 주장된 실험 데이터를 기반으로 입증되었습니다.

보충 자료:

그림 S1: 악취 감소에 대한 히알루론산 나트륨의 효과, 그림 S2: GSH5 -HA MN 어레이 이미지.

저자 기여:

개념화, YL, Y.-SJ 및 SYY; 방법론, YL, SHK, K.-YS 및 SK; 데이터 큐레이션, CK 및 HL 쓰기 - 원본 초안, YL, SK, SYY; 검토 및 편집, SK, Y.-SJ, K.-YS 및 SYY; 감독, SYY 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

자금 조달:

본 연구는 과학기술정보통신부(NRF-2018R1A4A1025623)의 지원으로 한국연구재단(NRF)과 한국연구재단(NRF)을 통한 국가창의연구사업의 지원을 받아 수행되었습니다. 미래창조과학부(NRF-2017R1D1A3B03035360)에서 자금을 지원합니다.

이해 상충:

SYY는 무취 GSH 화장품을 개발하는 회사(SNVIA)에 라이센스를 부여한 특허 발명가입니다. 이 잠재적인 이해 상충은 부산대학교에서 관리합니다.

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이예찬 1명, Sujeet Kumar 1명, 김수현 2명, 성금용 1명, 이혜선 1명, 김채린 1명, 정영숙 2명,*, 양승윤 1명,*

1 부산대학교 생명산업융합연구원 바이오소재과학과 밀양 50463.

2 부산대학교 약학대학, 부산 46241, Korea.

접수: 2019년 12월 31일; 수락: 2020년 1월 22일; 게시일: 2020년 1월 27일

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