올리브 잎 추출물(OLE)은 칼슘 감지 수용체의 활성화를 통한 바소프레신 ​​유도 아쿠아포린-2 트래프킹 장애

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Vasopressin(AVP)은 수분 투과성을 증가시킵니다.신장아쿠아포린{0}}(AQP2) 밀매의 규정을 통한 수집 덕트. 고혈압 및 부적절한 항이뇨 호르몬 분비(SIADH)를 포함한 여러 장애는 물 항상성의 이상과 관련이 있습니다. 특정 식물성 화합물이 인간의 건강에 유익한 것으로 나타났습니다. 여기에서 올리브 잎 추출물(OLE)의 효과는 시험관 내 및 생체 내 모델을 사용하여 평가되었습니다. 공초점 연구는 OLE가 MCD4 세포와 쥐에서 바소프레신에 의해 유도된 AQP2의 원형질막으로의 전위를 방지한다는 것을 보여주었습니다신장. OLE와 함께 배양하면 AVP-의존적 삼투성 수분 투과 계수(Pf) 증가가 감소합니다. OLE의 가능한 이펙터를 설명하기 위해 세포 내 칼슘이 평가되었습니다. OLE는 칼슘 감지 수용체(CaSR)의 활성화를 통해 세포 내 칼슘을 증가시킵니다.NPS2143 , 선택적 CaSR 억제제는 AVP 의존성 투수성에 대한 OLE의 억제 효과를 폐지했습니다. 생체 내 실험에서는 OLE 처리가 CaSR mRNA의 발현을 증가시키고 AQP{4}}miRNA를 표적으로 하는{5}} AQP의 증가와 병행하여 AQP2 mRNA를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 함께, 이러한 발견은 OLE가 CaSR의 자극을 통해 바소프레신 ​​작용을 길항한다는 것을 시사하며, 이는 이 추출물이 비정상적인 CaSR 신호 전달을 특징으로 하고 신장 수분 재흡수에 영향을 미치는 장애를 약화시키는 데 도움이 될 수 있음을 나타냅니다.

올리브 나무 잎은 특히 지중해 국가에서 여러 질병을 치료하기 위한 전통 요법으로 널리 사용되었습니다. 잎은 일반적으로 인간의 식단에서 추출물 또는 분말로 섭취하여 주입 또는 허브 차를 준비합니다. 화학적 특성 분석에 따르면 올리브 나무 잎에는 대사 증후군, 이상지질혈증 및 고혈압과 같은 특정 질병에 유익한 효과를 발휘할 수 있는 여러 생리 활성 화합물이 포함되어 있습니다. 본태성 고혈압 환자에서 OLE는 혈압을 낮추고 혈당과 칼슘혈증을 약간 감소시켰습니다. 올레유로핀(oleuropein), 하이드록시티로솔(hydroxytyrosol), 티로솔(tyrosol)과 같은 수많은 폴리페놀은 녹색 올리브 잎 추출물(OLE)5에 풍부하게 함유되어 있는 것으로 밝혀졌으며 산화 스트레스를 특징으로 하는 특정 질병의 예방에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 지난 몇 년 동안 다양한 연구 분야의 과학자들 사이에서 올리브 잎 추출물의 잠재적인 유익한 효과에 대한 관심이 증가하고 있습니다. OIE는 세포 내 칼슘 역학을 변경하여 악성 중피종 세포에서 상당한 항증식 효과를 나타냈습니다. Ca2 플러스 채널을 입력합니다. 흥미롭게도 OLE는 혈관 기능의 개선과 관련하여 자발적인 고혈압 쥐(SHR)의 유전성 고혈압에 항고혈압 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다*. 과도한 수분 재흡수는 혈압 상승의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 올리브 잎 추출물로 치료한 고혈압 환자에서 몇 가지 염증 인자의 현저한 감소가 혈압 감소와 관련된 것으로 밝혀졌습니다. 게다가, 과도한 수분 저류는 간경화, 심부전 및 부적절한 항이뇨 호르몬 분비(SIADH)와 같은 여러 장애를 특징으로 합니다. 체수분 항상성은 탈수 상태에서 방출되는 항이뇨 호르몬 바소프레신(AVP)에 의해 엄격하게 제어됩니다. AVP는 basolateral membrane에 국한된 동족 V2R 수용체에 결합합니다.신장따라서 주요 세포는 cAMP 신호 경로를 활성화하여 아쿠아포린{0}}(AQP2) 함유 소포를 세포 내 풀에서 물 재흡수가 일어나는 정점 원형질막으로 전위시킵니다. 분자 수준에서 몇 가지 요인이 신장 수분 균형을 조절할 수 있습니다. 내강 칼슘의 상승된 수준은 칼슘 감지 수용체(CaSR)의 활성화를 통해 단기 바소프레신 ​​의존성 AOP2 트래피킹을 하향 조절합니다1,12. 다른 한편으로, 인간의 소변에서 분리된 조건부 불멸화 신장 근위 세뇨관 상피 세포에서의 CaSR 활성화는 세포질 칼슘의 상당한 증가를 유도하고 아데닐산 cvclase3의 직접 활성제인 포스콜린(FK)에 의해 유발되는 cAMP의 증가를 유의하게 감소시켰습니다. , 신장 집합관 MCD4 세포에서 물 채널 AOP2를 안정적으로 발현하며, CaSR의 자극은 바소프레신에 의해 활성화된 신호 전달 캐스케이드의 중추적 사건인 세린 256에서 AQP2 인산화의 cAMP 의존적 증가를 약화시키고 결국 수분 투과성을 증가시켰습니다. ,15 또한,신장내부 수질 마우스 신장의 조각에서 칼슘 유사 작용성 NPS-R568을 사용한 CaSR의 활성화는 AQP2-타겟팅 miRNA-137를 크게 증가시켜 CaSR 신호 경로와 AQP-137 사이의 긴밀한 상호 작용을 확인했습니다. {4}}의존적 투수성l.17.본 연구에서는 AOP2를 안정적으로 발현하는 신장 집합관 MCD4 세포 및 dDAVP에서 바소프레신 ​​유도 AQP2 기능에 대한 현지 Coratina 품종에서 얻은 올리브 잎 추출물의 효과를 평가했습니다. 추출물을 주입한 처리된 쥐. 우리는 OLE 치료가 이뇨 효과를 부분적으로 설명할 수 있는 신장 세포에서 바소프레신 ​​반응을 방해한다는 증거를 제공합니다. 흥미롭게도 이 효과는 바소프레신 ​​수용체12와 부정적인 상호작용을 하는 것으로 알려진 수용체인 CaSR의 OLE 유도 활성화와 관련이 있는 것으로 보입니다.

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결과

MCD4 세포에서 바소프레신 ​​유도 AQP2 기능에 대한 OLE의 효과. 바소프레신 ​​의존성 AQP2 기능에 대한 OLE의 가능한 관련성을 조사하기 위해,신장바소프레신 ​​수용체 2(V2R)와 인간 AQP2를 안정적으로 발현하는 집합관 MCD4 세포를 실험 모델로 사용했습니다. 공초점 연구(그림 1A)는 AQP2 염색이 정점 원형질막에 국한된 dDAVP 처리된 세포와 비교하여 OLE 처리가 dDAVP 자극에 의해 유도된 AOP2의 막 국소화를 방지하는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰과 일치하게, OLE 처리는 dDAVP에 의해 유도된 시간적 삼투압 반응의 증가를 손상시켰습니다(그림 1B에서 1/t로 표시)(OLE/dDAVP{12}}.70±1.{15}}%, n{16}} 셀 대 dDAVP=206.8±5.49% ,n{21}} 셀;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

OLE를 주사한 쥐의 신장에서 OLE의 효과.

OLE의 작용을 더 조사하기 위해 생체 내 연구가 수행되었습니다. 특히, 쥐에게 3일 동안 하루에 한 번 OLE(250 mg/kg/day)를 주사했습니다. 또는 쥐에게 3일 동안 OLE 및 3{13}}분 동안 dDAVP를 공동 처리했습니다. 쥐의 신장 집합관에서 분리하여 Real-Time PCR로 처리한 CaSR mRNA의 평가(그림 6)는 OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} 쥐 대 CTR{11}}.02±0.17, n{15}} 쥐, p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">신장, Western blotting 분석 및 공초점 연구를 수행했습니다(그림 9). OLE/dDAVP를 주사한 쥐에서 세린 256에서 AQP2의 인산화는 dDAVP 처리된 동물(OLE/dDAVP=0)의 신장 조직에 비해 유의하게 감소했습니다. 77±0.16, n{7}} 쥐 대 dDAVP=2.16±0.25,n{12}} 쥐, p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

논의

칼슘은 과다한 세포 기능을 조절하는 중요한 세포 내 전달자입니다2. 비정상적인 칼슘 신호는 심부전, 암 및 고혈압을 포함한 여러 질병을 유발할 수 있습니다. 다중 세포 내 칼슘 신호를 제어하는 ​​단백질의 발현 및 활성의 특정 제어는 수많은 장애에 성공적으로 대처하는 것으로 입증되었으며 따라서 약물 개발에 매력적입니다. 이 연구는 바소프레신 ​​유도 AQP2 인신매매 및 발현의 미세 조정에 관여하는 CaSR의 자극을 통해 세포내 칼슘 신호를 조절하는 능력을 보여줌으로써 OLE의 작용 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 생리학적 조건에서 AQP2는 체수분 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. AQP2가 정점 원형질막에 위치하도록 유도하는 세포 내 기계의 자극은 부적절한 항이뇨 호르몬(SIADH) 분비, 간경변 및 울혈성 심부전 증후군에서와 같이 비정상적인 수분 보유 및 결과적인 저나트륨혈증을 초래합니다. 다낭성 신장 질환 1 반수체 결핍과 관련된 SIADH 모델에서, 기초 세포내 칼슘 수치는 야생형 마우스의 집합관에서 측정된 수치와 비교하여 유의하게 감소했습니다. 낮은 세포 내 칼슘은 단백질 포스파타제 PP2A를 포함한 특정 효소의 활성을 하향 조절하여 세린 2561에서 AOP2 인산화를 상향 조절합니다. 대조적으로. 칼슘 유사 작용성 NPS-R568로 CaSR을 활성화하면 세포 내 칼슘 농도가 증가하고 PKD1 결핍 세포에서 cAMP 수준이 감소했습니다. 중요하게도, 세포질 칼슘은 칼슘 억제성 아데닐화 사이클라제3를 하향 조절하여 cAMP의 세포내 수준을 미세 조정할 수 있습니다. 실제로 MCD4 세포에서 NPS-R568을 사용한 CaSR의 자극은 아데닐산의 억제를 통해 AQP{23}}pS256을 감소시켰습니다. cyclase4.이 연구에서 OLE 처리는 세포 내 칼슘 농도 증가에 이차적으로 발생하는 cAMP 및 AOP{27}}pS256의 바소프레신 ​​의존적 증가를 방지했습니다. 참고로, 투과성 8-Br-cAMP를 사용하여 cAMP의 외부 소스에 노출하면 V2R 경로에 대한 OLE의 억제 효과가 크게 상쇄되었습니다.

높은 수준의 세포질 칼슘은 세포 사멸과 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 그러나 세포 내 칼슘이 250nM에서 600nM 이상으로 지속적으로 증가하면 신경 생존이 촉진됩니다.4 MCD4 세포에서 0.1 mg/ml의 OLE 치료는 나타나지 않습니다. 세포독성 효과. 이 농도에서 OLE(0.1 mg/ml)는 세포 내 칼슘 수준을 약간 증가시켰습니다. 칼슘 이미징은 OLE를 사용한 급성 자극이 세포가 선택적 CaSR 길항제 NPS2143과 사전 배양될 때 폐지되는 CaSR의 활성화를 통해 세포내 칼슘의 일시적인 증가를 유발함을 보여주었습니다. ROS 생성을 감소시켜 세포 사멸을 유발하는 미토콘드리아 산화 스트레스를 하향 조절했습니다. 또한, 우리의 이전 연구는 CaSR의 기능 획득 변이체의 발현이 AQP237의 ROS 방출 및 S-글루타티오닐화를 감소시키는 것으로 나타났습니다. OLE와의 배양은 항산화 능력을 보여주는 MCD4 세포35에서 ROS 생성을 감소시켰습니다. 그럼에도 불구하고 현재로서는 OLE가 AOP{17}}S-글루타티오닐화에 영향을 미치는지 여부는 불분명합니다. 많은 연구에서 OLE의 주성분인 OLE 또는 oleuropein이 세포 사멸을 억제함으로써 보호 역할을 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 250 및 500 mg/kg의 용량에서 유익한 반응이 얻어졌습니다. 대조적으로, 더 높은 농도에서 OLE 처리는 여러 식물 화합물의 산화 촉진 작용으로 인해 유해한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구에서 쥐에게 CaSR의 상향 조절을 보여주는 3일 동안 250mg/kg의 OLE를 주사했습니다. CaSR의 발현 수준은 수용체의 알로스테릭 활성제로 작용하는 특정 화합물에 의해 증가됩니다. 실제로 Calcimimetics는 인간 혈관 평활근 세포에서 CaSR의 생합성을 증가시켜 혈관 석회화를 감소시켰습니다. 이 경연에서 OLE의 특정 화합물이 CaSR의 알로스테릭 조절제로 기능할 가능성을 배제할 수 없습니다. 다른 한편으로, 바소프레신으로 자극하면 CaSR42의 발현 수준을 증가시키는 데 기여할 수 있는 IL{26}} 방출을 유발할 수 있습니다.

신장에서 CaSR 신호전달의 자극은 아마도 miR{1}} 생성을 통한 AQP2 발현의 하향조절과 관련이 있습니다. miRNA는 중추적인 전사후 조절제입니다. AQP2 발현을 표적으로 하는 여러 바소프레신 ​​의존성 miRNA도 설명되었습니다43. miR-32 및 miR-137을 사용한 형질감염은 mpkCCDc14 세포에서 AOP2의 발현 수준을 유의하게 감소시켰습니다. 흥미롭게도 OLE는 여러 miRNA의 발현 수준을 조절하여 염증 신호를 약화시키고 보호 효과를 발휘할 수 있습니다. 특히, OLE는 다형성 교모세포종 세포에서 의 하향 조절에 관여하는 miR-13745를 비롯한 다양한 miRNA의 발현을 촉진합니다. Akt/mTOR 신호 전달 경로 46. 참고로, 올레유로핀 처리는 칼슘 유도 CAMK 및 AMPK의 활성화를 통해 Akt/mTOR 신호 전달을 방지합니다. NPS-R568을 사용한 CaSR의 활성화는 인간 근위 세뇨관 세포에서 AMPK를 활성화하고 mTOR 활성을 감소시킵니다. 이러한 발견과 일치하게 OLE와의 배양은 세포질 칼슘을 증가시키고 PKA 활성을 하향 조절하며 3D 세포 배양 모델에서 낭종 크기를 감소시킵니다. 함께 이러한 발견은 OLE가 CaSR 신호의 하향 조절과 관련된 세포 내 칼슘 역학의 조절 장애를 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사합니다.

올리브 잎 추출물은 폴리페놀, 섬유 및 미네랄49을 포함한 여러 생리 활성 성분으로 구성됩니다. 현재로서는 하나의 화합물 또는 OLE의 식물성 화합물의 시너지 조합이 세포 내 반응을 조절하는 데 도움이 될 수 있는지 명확하지 않습니다. 본 연구에 사용된 추출물은 가능한 식품 첨가물로 적용되었으므로 하이드록시타이로솔을 포함한 여러 페놀이 신장에서 여과되어 소변으로 회수될 수 있다는 점을 고려하여 추출물 자체의 생리학적 영향을 정의하는 것이 중요합니다50. 추가 연구는 CaSR을 통해 세포 내 칼슘 신호 전달을 능동적으로 조절할 수 있는 특정 성분의 효능을 제공할 것입니다. 결론적으로, 이 연구는 OLE가 CaSR 발현의 감소뿐만 아니라 신호 전달 및 신장 수분 투과성에 영향을 주는 장애를 완화하는 데 유용한 새로운 잠재적 보조제로 간주될 수 있다는 증거를 제공합니다.

재료 및 방법

화학 물질 및 항체.모든 화학 물질과 항생제는 Merck(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. Calcein-AM, Fura{1}}AM, 세포 배양 배지, 태아 소 혈청(FBS) 및 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates는 Thermo Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다.Aquaporin{ {2}}(AQP2)는 인간 AQP2!의 마지막 15개 C-말단 아미노산에 해당하는 합성 펩티드에 대해 생성된 특이적 항체(C-꼬리 Ab)를 사용하여 검출되었습니다. AQP{8}}pS256 항체는 Peter Deen 교수가 친절하게 선물했습니다. 이차 염소 항-토끼 고추냉이 과산화효소 결합 항체는 Merck(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로부터 입수하였다. Alexa에 결합된 2차 염소-항-토끼 항체{14}}는 Thermo Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다.

페놀이 풍부한 추출물 생산 및 화학적 특성화.올리브 잎에서 페놀이 풍부한 추출물의 생산은 Ranieri et al.35에 보고된 대로 수행되었습니다. 블렌더(Waring-Commercial, Torrington, CT, USA)로 밀링한 후 ddH2O 물을 첨가하고(비율 1/2{10}}, w/y) 초음파(CEIA, Viciomaggio, Italy)를 3회 실시했습니다. , 매회 35±5도에서 30분간. 마지막으로 추출물을 여과지로 여과하고 동결건조하여 -20℃에 보관하였다. 얻어진 추출물을 0.45μm 나일론 필터(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)로 여과하여 화학적 특성화에 사용하였다. 총 페놀 함량, 항산화 활성 및 단일 페놀 화합물 식별은 Difonzo et al.에 따라 수행되었습니다. OLE는 Folin-Ciocalteu에 의해 측정된 폴리페놀 함량이 195mg과 동일함을 보여주었습니다. 갈산 등가물(GAE) 및 항산화 활성, ABTS(2,2'-azino-bis(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산 디암모늄염)로 측정, 750μmol TE(Trolox 등가물)에 해당함) .

세포 배양 및 치료.인간 AQP2와 키메라 V2R-Rluc를 안정적으로 발현하는 마우스 피질 집합관 MCD4 세포를 실험 모델로 사용했습니다. 세포는 Dalbec-cos 변형 이글 배지와 5%(y/y) 태아 소 혈청이 보충된 F{8}}의 1:1 혼합물에서 성장했습니다. 1% (y/y)L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신, 5μM 덱사메타손,4{24}}0 ug/ml G418(AQP2 내성용) 및 1 ug/ml 퓨로마이신(V2R-Rluc 내성용) , 37도에서 5% CO의 가습된 대기에서 . MCD4 세포를 기본 조건(CTR) 하에 두거나 0.1 mg/ml O/N의 OLE, 100 nM의 dDAVP를 30분 동안 장기간 처리하거나 OLE 및 dDAVP 또는 NPS2143을 1 μM O/N에서 공동 처리했습니다. .또는 세포를 45분 동안 500μM에서 8-Br-cAMP에 노출시켰고, 단기 실험은 OLE 5분 동안 1mg/ml로, NPS2143을 10μM에서 15분 동안 수행했습니다. 실험은 다른 계대의 세포를 사용하여 3-5 독립적으로 수행되었습니다.

동물 모델 및 치료.모든 절차는 실험 동물의 관리 및 취급에 대한 덴마크 국가 지침 및 국립 보건원의 출판된 지침에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 임상 의학 연구소의 승인을 받았습니다. 오르후스 대학교, 덴마크 법무부에서 발급한 실험 동물 사용 허가서에 따름(승인 번호 2015-15-0201-00658). 시작 체중이 200-225 g인 성인 수컷 Wistar 쥐에 대한 연구가 수행되었습니다. 동물은 표준 설치류 식이(Altromin, Lage, Germany)로 유지되었으며 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 실험 동안, 쥐는 12:12 h 명암 주기, 21±2℃의 온도, 55±2%의 습도로 케이지당 2개의 그룹으로 수용되었습니다. 5마리의 쥐에게 1ng dDAVP(Sigma-Aldrich, Glostrup, Denmark)를 200ul 식염수/동물로 피하 주사하여 처리하였고, 5마리의 비히클 처리된 쥐를 대조군으로 삼았다. 30분 후 쥐를 죽이고 신장을 아래와 같이 처리하였다.

세포 및 IMCD 용해물.세포를 {{0}}mm 접시에서 성장시키고 220mM 만니톨, 70mM 자당, {{10}}을 포함하는 완충액에 재현탁했습니다. 5 M EGTA pH 8.0,0.5 M EDTA pH 8.0,1 M Tris-HCl pH 7.4, 프로테아제(1 mM PMSF, 2 mg/ml 류펩틴 및 2 mg/ml 펩스타틴 A) 및 포스파타제(10 mM NaF 및 1mM 나트륨 오르토바나데이트) 억제제. 대안적으로 약 0.5mm의 신장 절편을 준비하고 1i8mM NaCl, 16mM Hepes, 17mM Na-Hepes, 14mM 포도당, 3.2mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.8mM MgSO4, 및 1.8mM KH2PO4(pH7.4). 신유두는 프로테아제(1mM PMSF, 2mg/mlleupeptin 및 2mg/mlpepstatin A) 및 포스파타제(10mM NaF 및 1mM 나트륨 존재)가 있는 동일한 완충액에서 가위로 잘게 썬 것입니다. orthovanadate) 억제제. 초음파 처리(5초 동안 60kHz) 후, 용해물을 12,{52}} xg에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 수집하여 면역블롯팅 연구에 사용했습니다.

공초점 현미경.공초점 연구는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다1. 간단히 말해서, 세포는 세포 배양 PET 삽입물 상에서 성장하고 상기 기재된 바와 같이 처리하였다. 또는 대조군, OLE, dDAVP 및 OLE에서 dDAVP 처리된 쥐로부터 얻은 신장 절편을 이전에 설명한 대로 면역형광 실험에 적용했습니다. 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 Leica TCS SP2(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland)로 얻었습니다. 겔 전기영동 및 면역블롯팅. 단백질은 12% 얼룩이 없는 폴리아크릴아미드 젤(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.)에서 이전에 설명한 대로 환원 조건에서 분리되었습니다=5,52. 간단히 말해서, 단백질 밴드를 Immobilon-P 멤브레인(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 옮기고 항-AQP2(Pre-C-tail Ab) 및 항-AQP{14}}pS256 항체를 사용하여 면역 블롯팅했습니다. Chemidoc System(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)이 있는 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates를 사용하여 면역반응 신호를 얻었습니다. 밴드는 얼룩이 없는 기술(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Densitometry analysis는 ImageLab(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행하였고 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 분석하였다.

물 투과성 분석.삼투 물 투과성은 이전에 설명된 대로 측정되었습니다43. 간단히 말해서, MCD4 세포는 40-mm 유리 커버슬립에서 성장했습니다. 처리 후 세포에 DMEM/F-12에서 37도, 5% CO에서 45분 동안 10μM 막 투과성 Calcein-AM을 로딩했습니다. Coverslips는 관류 챔버(FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA)에 장착되었습니다. 측정은 단일 세포 형광 측정을 위해 장착된 역 TE{11}}S 현미경(Nikon Eclipse 현미경, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행되었습니다. 및 영상 분석. Calcein-AM-로딩된 샘플은 490 nm에서 여기되었습니다. 등삼투압(140mM NaCl.5mM KCl, 1mM MgCl..1mM CaCl., 10mM 헤페스 설폰산, 5mM 포도당, pH7.4) 또는 고삼투압(135mM 만니톨이 첨가된 등삼투압 용액) 용액에 따른 형광 측정 . Metafluor 소프트웨어(Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada)를 사용하여 수행했습니다. iso 및 hyperosmotic 솔루션으로 세포를 관류 후 시간 경과 형광 데이터가 기록되었습니다. 세포 수축의 시간 경과는 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego , 캘리포니아, 미국).

형광 공명 에너지 전달 측정.세포 내 cAMP 변화를 평가하기 위해 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기술을 적용했습니다. FRET 실험의 경우, 세포는 이전에 표시된 대로 시안색 형광 단백질(CFP)과 cp173Venus-Venus 사이에 내장된 EPAC1의 cAMP-결합 공통 모티프를 포함하는 H96 센서를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염되었습니다. H96 프로브를 인코딩하는 플라스미드는 Dr.K.의 선물이었습니다. 잘링크. ECFP 및/또는 EYFP 발현 세포의 시각화 및 FRET 검출은 도립된 TE{11}}S 현미경(Nikon Eclipse 현미경, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행되었습니다. 각 이미지는 이전에 표시된 대로 수정 및 분석되었습니다.

세포 내 칼슘 측정. 세포 내 칼슘 측정은 이전에 표시된 대로 수행되었습니다. 간단히 말해서, MCD4 세포에 DMEM/F-12에서 37도에서 15분 동안 4 μM Fura{3}} AM을 로딩했습니다. 링거 용액은 140mM NaCl, 5mM KCl 1mM MgCl, 10mM HEPES, 5mM 포도당, 1.8mM CaCl, pH 7.4를 포함하는 실험 동안 세포를 관류하는 데 사용되었습니다. 형광 측정에서 과부하된 세포가 있는 커버슬립을 관류 챔버(FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA)에 장착했습니다. 측정은 도립된 TE{17}}S 현미경(Nikon Eclipse 현미경, Tokyo. Japan)을 사용하여 수행되었으며, 340 및 380 nm에서의 형광 강도의 비율을 플롯팅하고 형광의 변화로 계산했습니다. 특히, OLE(1 mg/ml) 또는 NPS2143(10 μM)을 사용한 자극을 동일한 세포 유형에서 칼슘 매개 작용제 ATP(100 μM)의 최대 용량으로 자극한 후 얻은 것과 비교했습니다. 내부 통제(100%).

세포 내 칼슘 수준은 정상 상태에서 측정되었고 Grynkiewicz57에 의해 설명된 대로 보정되었습니다. OLE 및 NPS2143은 각각 0.1 mg/ml 및 1 uM에서 장기간 사용되었으며, 각 샘플은 1 mM EGTA(Rm.) 존재하에 5 μM 이오노마이신을 첨가한 후 5 5mM CaCl(RMA)의 μM 이오노마이신.

대조군 및 처리된 쥐에서 AQP2 및 CaSR mRNA의 실시간 PCR 분석.대조군 및 처리된 쥐의 신장 유두에서 분리된 내부 수질 집합관(IMCD)에서 mRNA의 상대적 발현을 측정하기 위해 실시간 PCR 실험을 수행하였다. 약 0.5mm의 신장 조각을 만들고 118mM NaCl, 16mM HEPES, 17mM Na-Hepes, 14mM 포도당, 3.2mM KCl, 2.5mM CaCl2,1.8을 함유하는 완충액에서 10분 동안 평형화했습니다. mM MgSO4 및 1.8 mM KH2PO4(pH 7.4). 신장 유두를 실체현미경으로 분리하였다. 그런 다음 대조군과 처리된 쥐의 표본을 Trizol(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 가위로 직접 다졌습니다. SuperScriptVilo Master Mix(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 제조업체의 제안에 따라(25C에서 10분, 42C에서 60분, 85C에서 5분). 실시간 PCR 증폭은 StepOne Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 CaSR, AOP2 및 GAPDH 분석(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)과 함께 TagMan Fast Advanced Master Mix를 사용하여 수행했습니다. ), 제조업체가 지정한 열 사이클링 조건을 설정합니다(20초 동안 95°C, 1초 동안 95°C 및 20초 동안 60°C에서 40주기). 결과는 2-로 표시되었습니다. △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) 처리-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1 값(상대 정량).

대조군과 처리된 쥐에서 miRNA{0}} 평가.대조군 및 처리된 쥐 내부 수질 수집관의 miRNA{{0} 함량은 TagMan Advanced miRNA Assays(has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 평가되었습니다. .US.A), 정량적 PCR을 사용하여 성숙한 miRNA의 고감도 및 특이적 알림을 가능하게 했습니다. 약 0.5mm의 신장 조각을 만들고 118mM NaCl, 16mM HEPES, 17mM Na-Hepes, 14mM 포도당, 3.2mM KCl, 2.5mM CaCl2,1.8mM MgSO4 및 1.8mM을 함유하는 완충액에서 10분 동안 평형화했습니다. KH2PO4(pH7.4).신장유두를 실체현미경으로 분리하였다. 그런 다음 대조군과 처리된 쥐의 표본을 가위로 Trizol(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 직접 절단하여 총 RNA를 추출했습니다. TaqMan 고급 miRNA cDNA 합성 키트(카탈로그 n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 제조업체가 제공한 프로토콜(Poly(A)tailing reaction; ligation reaction; reverse transcription reaction; miR-Amp reaction)에 따라 cDNA 합성을 얻었다. 59-인광체가 포함된 합성 RNA(UUAUUGCUUAGAAUACGCGUAG)는 Thermo Fisher Scientific에 의해 합성되었으며 miRNA 샘플 값을 보간하고 miR{29}} 함량의 정확한 평가(나노그램 단위)를 얻기 위해 보정 곡선을 수행하는 데 사용되었습니다. GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 샘플 16.

통계 분석.모든 값은 평균 ± SEM으로 보고됩니다. 통계 분석은 일원 분산 분석에 의해 수행된 후 *p를 사용한 Newman-Keuls 다중 비교 테스트에 의해 수행되었습니다.<0.05 considered="" statistically="" different="">

진술, 윤리적 승인 및 참여 동의.동물 연구는 실험 동물의 관리 및 취급에 대한 덴마크 국가 지침 및 국립 보건원의 출판된 지침에 따라 수행되었습니다. 오르후스 대학교 임상 의학 연구소의 동물 관리 윤리 위원회는 덴마크 법무부가 발행한 실험 동물 사용 허가서(승인 번호 2015-15-0201-00658)에 따라 연구 프로토콜을 승인했습니다. 저자는 모든 방법이 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었음을 확인합니다. 또한 저자는 연구가 ARRIVE 지침에 따라 수행되었음을 확인합니다.

참고문헌

1. El, SN & Karakaya, S. 올리브 나무(Olea europaea)는 인간의 건강에 잠재적인 유익한 효과를 남깁니다. 뉴트르. 계시록 67, 632-638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. 고혈압 환자의 대사 반응, 간 및 신장 기능 및 염증성 바이오마커에 대한 올리브 잎 추출물의 효과. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM 올리브 폴리페놀, 대사 증후군. 분자

4. Cherif, S. et al. 본태성 동맥성 고혈압의 치료에서 적정한 올레아 추출물의 임상 시험. 제이팜. 벨 51, 69–71(1996).

5. Difonzo, GRA et al. 코르티나 올리브 품종의 녹색 추출물은 항산화 특성과 생물학적 활성을 남깁니다. J. 기능. 식품 31, 8.

6. Herrero, M. et al. 올리브 오일 부산물의 가치 평가를 위한 새로운 가능성. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. 올류로핀이 풍부한 올리브 잎 추출물은 칼슘 역학에 영향을 미치고 악성 중피종 세포의 생존력을 손상시킵니다. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. 자발적인 고혈압 쥐에서 올레유로핀이 풍부한 올리브 잎 추출물의 항고혈압 효과. 식품 기능 7, 584–593.

9. 홀, JE 비신장 혈관 기능 장애보다는 신장 기능 장애. 염분에 의한 고혈압을 매개합니다. 회람 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin 및 아쿠아포린의 규제{1}}. 클린. 특급 네프롤. 17, 751-764.