올리브 잎(Olea Europaea L) 추출물 로딩 지질 나노 입자: Box-Behnken 통계 설계, 시험관 내 특성화 및 항산화 및 항미생물 활성 평가에 의한 처리 매개변수 최적화
Jun 10, 2022
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추상적인:본 연구는 천연 폴리페놀인 올레유로핀(oleuropein)과 같은 항산화제 및 항균제가 많이 함유된 올리브 처마 추출물 분말(OLP)의 고체 지질 나노입자(SLN)를 제조하고 평가하는 것을 목적으로 하였다. OLP와 관련된 주요 문제는 환경 조건으로 인한 불안정성과 이에 따른 생체 활성 저하였습니다. 이 문제를 극복하기 위해 SLN은 약물을 보호하고 항산화 및 항균 활성을 향상시키기 위해 고온 균일 한 후 초음파 처리 기술로 설계되었습니다. Compritol 888ATO와 같은 지질 및 tween 8{11}}과 같은 계면활성제는 SLNS의 개발 및 안정화에 사용되었으며 최적화는 Box-Behnken 통계 설계(3x3)에 의해 수행되었습니다. 최적화된 배치(F9)는 입자 크기, 포획 효율, PDI 및 제타 전위 277.46nm, 80.48%, 0.275. 및 -23.18mV입니다. 최적화된 제형(F9)은 1차 방출 속도론(R²=0.9984)으로 최대 24시간까지 지속 방출 패턴을 나타내었고 약물 방출 메커니즘은 Fickian 확산 유형(n=0 .441). 안정성 연구에서 SLN 제형이 안정적임을 알 수 있었습니다. 최적화된 제형에 대한 항산화 및 항균 연구를 수행한 결과 SLN이 그람 양성(Staphylococcus aureus) 및 그람 음성(Pseudomonas aeruginosa) 박테리아에 대해 개선된 라디칼 소거 활성 및 항균 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 개발된 SLN이 OLP의 전달을 보호할 수 있고 적합하다는 결론이 내려졌습니다.
키워드:올레아 유로파에아, 올레유로핀,고체 지질 나노 입자, 올리브 잎 추출물,항산화 활성, 항균 활성
1. 소개
쌍떡잎식물 참나무과(Dicotyledons Oleaceae)는 올리브 나무를 비롯한 낙엽수 약 30속으로 이루어져 있으며 약 600여 종이 관련되어 있다. Oleaceae 구성원은 아시아의 국소 및 아온대 이유로 잘 자랍니다. 올리브 나무(Olea europaea) 오일은 과일, 잎 등의 다른 부분에서 추출하여 정기적으로 섭취하면 많은 건강상의 이점이 있습니다. 전통적으로 그것은 다양한 유형의 발열 및 신체와 관련된 기타 문제를 치료하기 위한 민간 요법으로 사용되었습니다2).
올리브 잎 추출물은 항고혈압, 저혈당, 항균, 저요산 등과 같은 여러 치료 활성을 나타냈습니다. HIV-1 감염에 대한 항바이러스 활성이 입증 및 보고되었습니다. 또한 올리브 식물에서 추출한 올레유로핀(전형적인 세코이리도이드)은 항염 작용뿐만 아니라 강력한 항산화 작용과 함께 저콜레스테롤 및 저혈당 활성을 나타냈다. oleuropein의 분해 산물 즉. hydroxytyrosol은 또한 잠재적인 자유 라디칼 소거 작용과 함께 위에서 언급한 모든 활성을 나타냈습니다5.바이오플라보노이드올리브 식물과 관련된 이러한 모든 치료 활동을 연관시키면 건강 분야에서 중요한 기여자가 됩니다. 4).
이 프로젝트에서 저자는 올리브 잎 추출물의 항균 및 항산화 특성에 관심이 있습니다. 올리브 추출물의 항균 활성은 p-hydroxybenzoic acid, cyclotrisiloxane hexamethyl, Cyclopentasiloxane octamethyl, Cyclopentasiloxane desmethyl, vanillic, caffeic, protocatechuic, syringic, gallic acid 등으로 인한 것입니다. 기타 성분 oleuropein, quercetin, tyrosol, 올레아놀산은 또한 항균 활성을 담당합니다. 이러한 모든 물질의 항균 가능성은 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 레트로바이러스 및 기타 기생충에 대해 여러 연구자에 의해 이전에 보고되었습니다.
Cistanche 캔 안티 에이징
과일과 잎과 같은 천연 항산화 물질의 식이 섭취는 많은 주목을 받고 있으며 인간의 건강에 긍정적인 영향을 미치고 있습니다. 많은 역학 연구의 결과, 폴리페놀이 풍부한 식품의 섭취가 관상동맥 질환(CHD)의 발병률을 감소시키는 것으로 나타났습니다. MI(myocardial infarction), IS(ischemic stroke) 등과 같은 CHD는 죽상경화증과 관련이 있습니다." 최근 연구에서는 산화적 손상이 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 병인학적 요인임을 조사하였고, 특히 산화 스트레스 이론에 따르면, 저밀도지단백(LDL)의 산화적 변형은 동맥경화증의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 이러한 과정을 억제하는 것이 중요한 치료적 접근으로 여겨진다. , Verbascoside(ac-toeside 또는 Kalinin이라고도 함), ligstroside, apigenin-7-glucoside, di-cosmetic-7-glucoside, luteolin, catechin 등은 올리브 잎에서 얻어지며 항산화 작용을 나타냅니다. Hydroxytyrosol은 특허받은 항산화 특성을 가진 주요 올리브 잎 올레유로핀입니다.
이 활성 외에도 올리브 잎 추출물은 항염",12), 항암8.14), 항바이러스5), 저혈당4), 고지혈증17, 항혈소판 응집과 같은 다른 약리학적 활성을 나타냈다. EFSA(Euro-pean Food)와 같은 기관 Safety Agency)와 EMA(European Medicine Agency)는 올리브 잎 추출제의 치료적 적용 가능성을 평가했으며 주요 적용 가능성과 함께 올리브 잎 추출 제품은 대기 조건(온도, 빛 및 산소)에서 불안정성 문제를 겪고 있습니다. 생물학적 조건뿐만 아니라 불량한 생체 활성을 나타냅니다20,21).시스탄체를 사다안정성을 향상시키기 위해 올리브 잎 추출물의 다양한 활성을 탐색하기 위해 다양한 나노 기반 제형이 개발되었습니다. 이러한 제형에는 나노 에멀젼(W/O 및 여러 유형)2), 봉입 복합체, 분무 건조 제품?4), 정전기 압출25, 양극성 복합체), 나노 리포솜2{10}}, 나노 에멀젼, 마이크로 -캡슐화, PLA 나노입자2 및 NLC0 그래서 이러한 단점을 조절하기 위해 지질 나노 입자가 등장했습니다. 지질 나노 입자, 특히 고체 지질 나노 입자(SLN)는 더 나은 포획 효율, 제어된 입자 크기, 생체 적합성, 생분해성 및 준비 용이성과 같은 많은 이점을 제공합니다. 더욱이, SLN의 제조에 사용되는 지질은 포획된 약물과 함께 항염 활성에 대해 약간의 상승 작용을 갖는다. 현재까지 올리브 잎 추출물 제품의 안정성을 향상시키기 위해 항균 및 항산화 특성을 탐구하기 위해 고체 지질 나노 입자(SLN)를 기반으로 한 제형이 개발되지 않았습니다.
따라서 연구의 목적은 "올리브 잎(Olea europaea L.) 추출물 분말(OLP)용 고체 지질 나노 입자(SLNs) 개발. 활성 성분은 에탄올을 이용한 올리브 잎 추출에 의해 분리되었다. 용매는 건조하여 제거하여 건조 분말 제품을 얻습니다. 올리브 잎 추출물 파워(OLP)는 SLN(OLP-SLN)에 통합되었으며 Box-Behnken을 사용하여 전문 설계 소프트웨어(모델 8.0.7.1)로 최적화되었습니다. 약물(OLP) 대 지질 비율, 계면 활성제 농도(%, Tween 80) 및 균질화 속도(rpm)와 같은 세 가지 요소를 독립 매개 변수로 사용하고 입자 크기, 포획 효율 및 다분산 지수(PDI)와 같은 요소를 사용했습니다. 형태학적 연구, DSC 연구, 체외 방출 연구, 안정성 연구를 위해 최적화된 제형을 평가하였으며, 마지막으로 항균 및 항산화 활성을 평가하여 항균 및 항산화 가능성을 확인하였다. 개발된 S의 LN 제제.
2 재료 및 방법
올리브 잎은 지역 정원에서 얻었습니다. 신선한 잎을 말려서 가루로 내어 추출하였다. 귀중한 ATO5, compritol 888 ATO와 같은 다양한 지질은 Gattefosse(독일)에서 조달했습니다. 글리세릴 모노스테아레이트(GMS), 팔미트산, 스테아르산 트윈 80 등은 Central Drug House ltd(인도 뉴델리)에서 구입했습니다.2, 2-Diphenyl-1-Picryl hydroxyl-hydrate free radicals(DPPH ) Merck(Darmstadt, Germany)에서 조달했습니다. 아스코르브산, 인산이수소칼륨, 아세트산암모늄, 메탄올, 수산화나트륨, 폴록사머 188, 에탄올, 영양 한천 및 투석 백(M.Wt cutoff 12,000 kD)은 Sigma Aldrich(St Louis, 미국). 연구에 사용된 다른 모든 화학 물질은 분석 등급입니다.
2.1 페놀 성분의 추출
올리브의 신선한 잎은 추출을 위해 건조되고 가루로 만들어졌습니다. 활성 성분은 용매(에탄올:물, 4:1 v/v)의 도움으로 전원에서 추출되었습니다. 충분한 양의 분말(250 mg)을 추출 플라스크에 취하고 용매(1000 mL) 에탄올:물, 4:1 v/)을 첨가하고 혼합물을 24시간 동안 계속 교반하였다. 이 단계 후, 물리적 혼합물을 여과하고 용매를 40도에서 증발 건조시켜 분말을 얻었다.
2.2 SLN 준비 및 최적화: 예비
스크리닝 연구 및 제형 변수 사전 최적화 적합한 지질, 계면 활성제, 균질화 속도 및 시간, 초음파 처리 시간 등의 선택을 위해 사전 연구가 수행되었습니다. 적합한 지질의 선택은 지질의 약물 용해도에 따라 결정되고 계면활성제의 선택은 계면활성제 내 지질의 용해도에 따라 달라집니다.
해당 지질(100mg)을 바이알에서 융점(약 10도 이상) 이상으로 녹인 후 약물(OLP)을 지속적으로 흔들면서 혼합했습니다. 연한 연한 색의 모양은 끝점을 나타냅니다. 적합한 계면활성제를 선택하기 위해 유사한 실험을 수행했습니다.
2.3 실험적 설계
본 연구에서는 최적화를 위해 3가지 요인과 3가지 수준을 가진 전문 설계 소프트웨어의 BBD를 적용하였다. 이 연구에서 약물 대 지질 비율(A,1:3-1:6), 계면활성제 농도(B, 퍼센트, 1.5-4.5 퍼센트), 균질화 속도(C ,rpm,3000-6000 2시간 동안의 rpm은 독립 매개변수로 취했고, par-title 크기(nm, Y1), 포획 효율(%,Y2) 및 PDI(Y3)는 종속 매개변수로 취했습니다. 이 디자인을 적용하는 목적은 위의 세 가지 독립적인 매개변수를 최적화하고 최적의 입자 크기, 최대 포획 효율 및 가능한 최소 PDI를 달성하는 것이었습니다. 데이터는 BBD15)에 대한 전문가 설계 소프트웨어에 적합했습니다. 유사한 조성(5개의 중심점)을 갖는 5개의 배치로 총 17개의 배치가 생성되었다(표 1). 2차 다항식 방정식은 다양한 독립 매개변수가 입자 크기, 포획 효율 및 PDI에 미치는 영향을 입증하는 데 사용되었습니다.
2.4 SLN의 개발
OLP가 장착된 SLN은 고온 균질화에 이어 초음파 처리 방법으로 제조되었습니다. 다른 OLP-로딩된 SLN 배치의 구성은 표 1에 나와 있습니다. 먼저 지질(compritol 888 ATO)을 융점의 약 10도 정도로 녹이고 원하는 양의 OLP를 추가했습니다(1:{6} }:6 약물 대 지질 비율). 한편, 필요한 양(1.{9}}.5%)의 계면활성제를 탈이온수에 용해시키고 이 상의 온도를 지질상의 온도와 동일하게 유지하였다. 그런 다음 수상을 지질 상에 점진적으로 통합하고 가변 속도 링(rpm, 3000-6000 rpm, 2시간)에서 고온 균질화하여 코스 SLN 분산을 얻었다. 얻어진 에멀젼은
냉각한 다음 초음파 처리기(Probe type, Vibra-Cell'VCX 130; Sonics, CT, USA)를 사용하여 100% 진폭에서 10분 동안 초음파 처리하여 최종 SLN 분산을 얻습니다. 분산액을 유리 바이알에 수집하고 추가 연구를 위해 냉장고에 보관했습니다. 유사하게, 빈 SLN은 API(약물) 없이 개발되었습니다.
2.5 OLP-SLN의 특성화
2.5.1 입자 크기, PDI 및 제타 전위 평가
다양한 배치의 평균 입자 크기 및 다분산 지수(PDI)의 측정을 위해 제타 사이저 기계(Malvern, nano ZS 90, Malvern Instruments, UK)를 사용하는 광자 상관 분광법(Photon Correlation Spectroscopy, PCS)이 사용되었습니다. 온도는 25도, 산란각은 90도로 유지하였다.시스탕원래 OLP-SLN 분산액의 희석을 위해 탈이온수를 사용했습니다. 표면 전하를 나타내는 제타 전위는 약 20V/cm27의 전기장 강도에서 동일한 기기의 도움으로 결정되었습니다.
2.5.2 형태학적 연구
구리 그리드 코팅된 탄소를 사용하는 투과전자현미경(TEM, Fei electron optics, Japan)을 사용하여 준비된 OLP가 장착된 SLN(최적화된 배치 F9)의 형태와 모양을 조사했습니다. OLP-SLN 샘플을 염색하기 위해 phosphotungstic acid 염색(2% w/w, 지속 시간 20-30초)을 사용한 음성 염색을 수행한 후 실온에서 건조했습니다. 마지막으로, 샘플은 TEM에 의해 검출되었습니다.
2.5.3 포획 효율 평가
포집 효율(EE)은 OLP-SLN 분산액에 존재하는 포집되지 않은 약물의 양을 조사하여 결정되었습니다. 이를 위해 원심분리 기술이 사용되었습니다. 측정된 양(10 mL)의 OLP-SLN을 원심분리관에 취하여 냉각 원심분리기(Remi, India)를 사용하여 12000rpm에서 15분간 침전시켰다. 포획되지 않은 약물의 존재는 230 nm에서 UV-visible spectrophotometer(Model 1800, Shimadzu. Japan)로 분석하였다. 약물 포집율은 다음 공식(수식 1)에 의해 결정되었습니다.
2.5.4 시차주사열량계(DSC) 연구
이 연구의 목적은 시차 주사 열량계(Mettler, Toledo, USA)를 사용하여 다양한 제형, 즉 순수 OLP, compritol 888 ATO 및 최적화된 OLP-SLN 제형(F9)의 열 거동을 평가하는 것입니다. 각 샘플을 알루미늄 팬에 포장하고 불활성 분위기(질소)에서 기준으로 빈 밀봉 팬을 사용하여 20-350도(속도 10도/분)의 온도 범위에서 스캔했습니다. DSC 곡선을 얻고 해석했습니다. . 2.5.5 약물 방출 연구(%)
최적화된 배치(F9)의 약물 방출 연구는 투석막을 사용하는 Franz 확산 셀에 의해 수행되었습니다. 투석막을 적용하기 전에 0.35% w/v 아황산나트륨 용액을 8{5}}도에서 1-2분 동안 처리한 후 HSO({{ 13}}.2% ,v/v) 증류수에 12시간 동안 보관합니다. 염수 인산염 완충액(pH 7.4)을 수용체 구획에 채우고 SLN 분산액(F9,1 mL)을 공여자 구획에 채웠다. 실험은 연속 교반(50 rpm)으로 37±0.5도에서 수행되었습니다. 미리 정해진 시간 간격으로 수용체 구획에서 분취물(1 mL)을 채취하고 각 샘플에 존재하는 약물의 양을 UV-가시광선 분광 광도계로 검출했습니다. 230나노. 최적화된 SLN에서 적절한 방출 동역학은 방출 데이터를 0으로 피팅함으로써 검출되었고, 먼저 표 2에 주어진 Higuchi 모델 및 Korsmeyer-Peppas 모델 및 R(상관 계수) 값이 결정되었습니다. R-값이 가장 높은 모델을 최적화 모델로 간주했습니다8).
이 기사는 J. Oleo Sci에서 발췌했습니다. 70, (10) 1403-1416 (2021)
