오메가{0}} 지방산은 SIRT1/3을 상향 조절하고 탈아세틸화를 통해 PGC{3}}를 활성화하며 5/6 신장 절제술 쥐 모델에서 Nrf1 생산을 유도합니다
Mar 10, 2022
소개
신장다양한 대사 경로, 수분 및 전해질 균형, 혈압 조절, 여러 호르몬 생성을 포함한 여러 기능 조절에 관여합니다. 이러한 기능은 막대한 에너지를 소모하기 때문에신장미토콘드리아가 풍부하다[1]. 미토콘드리아는 건강한 미토콘드리아 개체군을 유지하기 위해 라파마이신(mTOR) 및 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK) 매개 영양소 감지 경로의 기계적 표적 조절을 통해 다양한 대사 조건에 적응할 수 있습니다. 현재까지 미토콘드리아에 대한 연구 중 미토콘드리아 생합성에 대한 연구는 소수에 불과하다. 미토콘드리아 생합성과 관련된 대부분의 연구는신장조직 [3,4], 및 연구신장주로 급성과 관련이 있습니다.신장 손상(AKI) 동물 모델, 근위 세뇨관 세포 및 당뇨병성 신병증 [5-7]. 미토콘드리아 생물발생은 비당뇨병 만성에서 미토콘드리아 기능장애의 발병기전과 연결될 수 있지만신장병 (CKD), 이 주제에 대한 연구도 매우 제한적입니다. CKD와 미토콘드리아 생합성은 심혈관 질환과 관련이 있습니다[8,9]. 미토콘드리아 생합성을 개선하면 CKD의 심장 보호에 도움이 될 수 있습니다. 오메가-3 지방산(FA)이 미토콘드리아의 생합성을 촉진한다는 연구는신장조직 [3,10]. 최근 연구에 따르면 심혈관 및 신경퇴행성 질환이 있는 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성에서 오메가{2}} FA의 유망한 역할이 입증되었습니다[11]. 따라서 본 연구에서 우리는 미토콘드리아 생물 발생을 조사하는 것을 목표로 하였다.신장5/6 신장 절제술(Nx) 쥐의. 또한 이 모델을 사용하여 미토콘드리아 생합성에 대한 오메가{2}} FA의 효과를 평가했습니다.
키워드:핵 호흡 인자 1; 핵 인자 적혈구계 2-관련 인자 2; 시르투인 1; 시르투인 3; 오메가{5}} 지방산; 신장, 신장
2. 결과
2.1. 신장 기능 및 조직학적 소견의 변화
대조군과 비교하여 Omega{0}} FA로 처리한 Nx 및 Nx 그룹에서 혈중 요소질소(BUN) 수치가 유의하게 증가했습니다(대조군 17.7 ±1.5, Nx 그룹 77.7 ±28.4, tit 오메가-3 FA 그룹 63.9 土 17.0 mg/dL, p = 0.{{20}}07). Nx와 Omega{16}} FA로 처리한 Nx 간에 유의한 차이가 없었지만, BUN 수치는 Omega{17}} FA로 처리된 Nx에서 수치적으로 더 낮았습니다. 세 그룹 간의 혈청 크레아티닌(sCr) 수치는 BUN(대조군, 0.4번째 0.U; Nx 그룹, 1.3 土 0.6; 오메가{25}} FA, 1.0 ± 0.3 mg/dL, y=0.008). 대조군과 비교하여 Nx 그룹에서 PAS 염색을 사용하여 심한 세뇨관 확장 및 위축이 관찰되었습니다(보충 그림 S1). 또한, 결과는 Omega{33}} FA로 처리된 Nx가 Nx 그룹보다 세뇨관 간질 변화가 적은 것으로 나타났습니다. 그만큼신장 기능세 그룹의 조직학적 변화는 이미 이전 연구에서 보고되었습니다[12].
22 미토콘드리아 생합성과 관련된 요인의 변화
2.2.1. Nrf1 및 Nrf2 식.Nx 그룹은 대조군에 비해 핵 호흡 인자 1(Nefl) 및 핵 인자 적혈구계{1}}관련 인자 2(Nrf2)의 발현 수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 그러나 Omega{4}} FA를 처리한 Nx군에서는 Nx군에 비해 Nrf1과 Nrf2의 발현량이 유의하게 증가하였으나 대조군 수준에는 미치지 못하였다(Oigure P, Supplementary Figure St) . 이러한 결과는 Nrf1 mRNA 정량적 실시간 PCR 분석에서도 발견되었습니다(보충 그림 S3).
2.2.3. PGC-1 활성과 관련된 인자의 표현: pAMPK, SIRT1/3.대조군과 비교하여 오메가{0}} 그룹으로 처리된 Nx 및 Nx는 인산화된 AMPK(호박 대 AMPK의 비율) 수준이 현저히 낮았습니다(그림 3A). 또한, Nx 그룹은 대조군에 비해 상당히 낮은 수준의 시르투인 1(SIRT1) 발현을 나타냈습니다(그림 3B, 보충 그림 S6). 그러나 Omega{6}} FA 첨가 후 SIRT1 발현은 상대적으로 증가하였으나 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 이러한 결과는 SIRT1 mRNA 정량적 실시간 PCR 분석에서 발견되었습니다(보충 그림 S7). 반대로, Sirtuin 3(SIRT3) 발현은 대조군에 비해 Nx 그룹에서 유의하게 감소하였고, 이는 Omega{13}} FA 그룹으로 처리된 Nx에서 유의하게 회복되었습니다(그림 3C).
2.2.4. Keap1, mTOR, FoxO1 및 FoxO3 발현, 대조군과 비교하여 Kelch-like EC H-associated protein 1(Keap1) 및 Forkhead box protein O1 및 O3(FoxO1/3)의 발현은 Nx 그룹에서 유의하게 증가 . Omega{14}} FA 그룹으로 처리된 Nx에서 Keap1 및 FoxO1/3의 발현 수준은 Nx 그룹에 비해 유의하게 감소했습니다(그림 4C,E,F). 대조군과 비교하여 mTOR의 발현은 Nx군에서 유의하게 감소하였다. 그러나 Omega{19}} FA 그룹으로 처리된 Nx에서 mTOR 발현은 회복되었지만 대조군 수준에는 도달하지 못했습니다(그림 4B).
2.2.5. 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 함량, 대조군에 비해 Nx 그룹에서 mtDNA의 유의한 감소가 관찰되었습니다. 그러나 mtDNA의 감소량은 Nx 처리 오메가{4}} Nx 그룹에서 유의하게 회복되었습니다(보충 그림 S9).
3. 토론
인산화 및 탈아세틸화를 통해 활성화되는 PGC{0}}는 미토콘드리아 생합성 및 에너지 생산의 주 조절자입니다. 우리는 CKD 모델에서 PGC-1의 발현과 탈아세틸화의 감소를 발견했습니다. 감소된 PGC{2}} 탈아세틸화가 CKD에서 기능 장애 미토콘드리아 생물 생성 및 감소된 에너지 생산에 기여하는 주요 기전이라는 점은 주목할 만합니다. AMPK는 트레오닌 또는 세린 잔기를 인산화하여 PGC-1를 활성화합니다[13,14]. AMPK는 또한 AMP/ATP 비율이 높을 때 인산화 시 활성화됩니다. 그러나 AMPK는 높은 AMP 수준에 대한 감지 장애로 인해 CKD에서 비활성화되는 것으로 알려져 있습니다[15,16]. 이전 연구와 유사하게, 우리는 AMPK 인산화가신장Nx 그룹의 조직. pPGC-1/PGC{1}}는 Nx 그룹에서 어느 정도 증가하는 것으로 보이지만 PGC{{3} 감소로 인해 PGC-1 인산화 수준이 증가할 가능성은 없습니다 }} 표현. 또한 Omega-3 FA 그룹을 처리한 Nx도 Nx 그룹과 유사한 결과를 보였으며 이는 Omega-3 FA 투여가 AMPK 및 PGC의 인산화에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다{{6} } . 탈아세틸화는 PGC-1의 전체 시퀀스에서 발생할 수 있으며 SIRT1과 3은 탈아세틸화 과정에서 중요한 역할을 합니다[13,14]. Omega{12}} FA 투여 후 PGC{13}}, SIRT1, 3의 발현량이 증가하여 탈아세틸화된 PGC{16}}를 정상 대조군과 동일한 수준으로 구출 . Omega{19}} FA 그룹으로 처리된 Nx에서 입증된 Nrf1 및 Nrf2의 발현 수준의 구조는 SIRT1 및 3 발현 수준의 증가와 직접적으로 관련되어 있으며, 이는 추가로 PGC의 탈아세틸화로 이어졌습니다{19}} {22}} .
CISTANCHE는 신장/신장 기능을 향상시킵니다.
미토콘드리아에 대한 최근 연구신장병유전적 또는 약리학적 개입을 통한 PGC{0}} 또는 SIRT 발현 수준의 증가가 개선됨을 보여주었습니다.신장 손상AKI 동물 모델에서 [5–7,17,18]. 근본적인 메커니즘은 FA 산화 또는 항산화 반응의 개선 효과를 포함합니다. 이전 연구에서는 오메가{4}} FA 투여가 미토콘드리아 FA 베타 산화를 개선하고 5/6 Nx 쥐 모델에서 항산화 효과를 나타냈다고 보고했습니다[19]. 오메가{9}} FA가 근육 세포, 대식세포 및 신경 세포에서 PGC{10}}, Nrf1 및 SIRT1의 발현을 증가시킨다는 보고도 있습니다[3,10,11]. CKD 모델에서 오메가{16}} FA가 미토콘드리아에 미치는 영향은 아직 보고되지 않았으므로 본 연구에서는 오메가{17}} FA가 CKD 모델을 사용하여 미토콘드리아 생합성 관련 분자 및 mtDNA를 복구하는 데 효과적임을 입증했습니다. 공부하다.
mTOR와 AMPK는 모두 미토콘드리아 생합성에 관여하지만 영양 상태에 따라 역할이 다릅니다. 라파마이신 복합체 1(mTOC1)의 표적인 mTOR는 아미노산이나 포도당과 같은 에너지 자극을 통해 활성화될 수 있으며 동화 과정과 미토콘드리아 생합성으로 이어지는 경로를 유발할 수 있습니다. 반대로, AMPK는 저산소증 및 영양 결핍을 통해 활성화될 수 있으며, 이는 이화 과정 및 미토콘드리아 생합성의 활성화를 유도하고 mTOC1을 통한 에너지 소비를 억제합니다[2]. 이 연구에서 우리는 CKD 모델에서 pAMPK/AMPK의 감소뿐만 아니라 mTOR의 감소도 입증했습니다. 또한 오메가{4}} FA 투여는 mTOR 발현을 거의 회복시켰지만 pAMPK/AMPK 감소는 회복하지 못했습니다. 따라서 오메가-3 FA는 mTOR 발현을 증가시켜 미토콘드리아 생합성 감소를 완화할 수 있습니다.신장CKD 동물 모델의 그러나 mTOR가 CKD 환자에서 감소하는지 여부와 오메가{0}} FA 치료를 통한 mTOR 발현의 증가가 미토콘드리아 건강과 CKD 진행에 어떤 영향을 미치는지 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
FoxO1 및 3은 PGC{2}} 프로모터에 결합하여 전사를 향상시킵니다[20,21]. 그러나 이 연구에서 FoxO1과 3은 Omega-3 FA 그룹을 처리한 대조군과 Nx에서 Nx 그룹에서 증가하고 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서 FoxO1 및 3의 발현은 오메가 FA 투여를 통해 CKD에서 PGC를 감소시키거나 PGC를 증가시키는 보상 반응과 관련이 있다고 가정합니다. Nrf2는 세포 산화 환원 항상성과 미토콘드리아 생합성에서 중요한 역할을 합니다. Nrf2 분해와 관련된 세 가지 유비퀴틴 리가제 시스템이 있습니다(Keap1, -transducin repeats-포함 단백질 및 E3 ubiquitin ligase 윤활막) [22]. 본 연구에서는 대조군에 비해 Nx군에서 Nrf2의 유의한 감소와 Keap1의 유의한 증가를 보였다. d 그러나 Omega{22}} FA군으로 처리된 Nx에서는 Keap1의 발현이 확인되었다. 감소하고 Nrf2는 증가했습니다. 결과는 CKD 쥐 모델에서 오메가{25}} FA 투여의 개선된 항산화 효과가 미토콘드리아 생합성을 향상시킬 수 있는 Keap1 발현 및 Nrf2 분해의 감소와 관련이 있을 수 있음을 시사합니다. 본 연구에서 얻은 결과를 바탕으로 CKD 환경에서 FoxO1/3과 Nrf2의 인과관계와 오메가{31}} FA 투여의 영향을 밝히기 위한 추가 연구가 필요합니다.
CISTANCHE는 신장/신장 감염을 개선할 것입니다
Nrf2의 분자량은 이 연구와 다른 최근 연구에서 68kDa(킬로달톤) 영역에서 발견되었습니다[23,24]. 그러나 이전 연구에서는 Nrf2의 생물학적으로 적절한 분자량이 95-110kDa라는 증거를 제시했습니다[25,26]. 우리는 또한 생물학적으로 관련된 Nrf2로 의심되는 밴드를 발견했습니다(보충 그림 S8). 생물학적으로 중요한 Nrf2의 분자량을 찾기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이전 연구에서 5/6 Nx 후 28일째 미토콘드리아의 변화가 보고되어 베타 산화, 산화적 인산화 및 내막 구조 단백질과 관련된 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 나타내었지만 결과가 없었습니다. PGC{16}} 표현식 [27,28]과 관련이 있습니다. 이 연구에서 우리는 쥐에서 5/6 Nx 후 45일째에 변화가 관찰됨에 따라 미토콘드리아 생합성 관련 분자와 미토콘드리아 생합성을 반영하는 mtDNA가 만성 단계에서 조절됨을 확인했습니다. 조직학적 및 생물학적 개선에도 불구하고 오메가{23}} FA 치료는 기능 회복을 가져오지 않았습니다.신장Nx 모델에 비해 따라서 오메가{0}} FA가 회복에 효과적인지 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.신장 기능미토콘드리아 기능을 향상시킬 수 있는 효과를 유도함으로써. 이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 호흡 사슬에서 구연산 합성 효소 활성과 과산화물 형성을 평가하지 않았습니다. 둘째, 우리는 Omacor의 어떤 FA 성분이 미토콘드리아 생합성 관련 분자에 주로 영향을 미치는지 실험하지 않았습니다. 셋째, 우리는 미토콘드리아 생합성 관련 분자를 개선하는 명확한 메커니즘을 입증하지 못했습니다. 우리는 산화 스트레스와 오메가{3}} 지방산 자체를 대사 화합물로 감소시키는 항염증 효과가 메커니즘과 관련이 있을 수 있다고 제안합니다.
4. 재료 및 방법 미토콘드리아 생물 발생
4.1. 동물과 실험적 디자인Japan SLC, Inc.(Shizuoka, Japan)에서 구입한 수컷 Sprague-Dawley 쥐({1}}주령)에 대한 연구가 수행되었습니다. 모든 쥐는 가짜 대조군 또는 5/6 Nx를 받았습니다. 동물과 관련된 모든 절차는 동아대학교 동물병원 동물관리위원회(DIACUC-14-4)의 승인에 따라 수행되었습니다. 쥐는 표준 조건에서 유지되었고 수돗물과 표준 식단에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모든 쥐를 다음 그룹에 할당했습니다. 그룹 1(가짜 대조군, n=6), 식염수를 유지한 대조군 쥐(위 세척에 의해 1mL/kg/일); 그룹 2(Nx 그룹, n=6), 식염수를 유지한 Nx 래트(위 세척에 의해 1mL/kg/일); 그룹 3(오메가{14}} FA 그룹), 오메가{15}} FA로 처리된 Nx 쥐. 오메가{16}} FA(Omacor, 300mg/kg/day, 위관 영양법, Pronova Biocare, Sandefjord, 노르웨이)의 용량 및 투여 경로는 이전 연구를 기반으로 결정되었습니다[19]. Omacor는 해양에서 유래한 오메가{20}} FA이며 Omacor 1g에 460mg의 에이코사펜타엔산(EPA)과 380mg의 도코사헥사엔산(DHA)으로 구성되어 있습니다. Omacor는 일반적으로 심근경색증 및 고중성지방혈증 치료 후 2차 예방을 위해 처방된다[29]. 두 가지 오메가{25}} FA(EPA와 DHA)는 약학적으로 준비된 Omacor의 주요(84%) 및 활성 성분입니다.
사소한 구성 요소를 극복하는 구성(16%). 우리는 임상 연구에서 심혈관 질환의 위험을 감소시키기 때문에 항염증 및 산화 스트레스 감소 기능이 있는 오메가{1}} FA 보충제로 Omacor를 선택했습니다[30]. 쥐에게 고르게 먹이를 주고 체중을 매일 관찰했습니다. 쥐는 수술 후 15주 동안 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있었고 디에틸 에테르 마취 하에 안락사되었습니다. 사망 시 대동맥 혈액 샘플을 수집한 다음 3000rpm에서 10분 동안 원심분리했습니다. 변경 사항을 식별하려면신장 기능, BUN 및 sCr 수준은 자동 분석기(Roche, Germany)를 사용하여 측정되었습니다.
4.2. 조직병리학적 검사.포르말린 고정신장조직을 파라핀에 포매하고 조각(4 µm)으로 자르고 과요오드산-Schiff로 염색했습니다. 조직병리학적 변화는 Aperio ScanScope(Aperio Technologies, Vista, CA, USA)로 관찰되었습니다.
4.3. RNA 분리 및 정량적 Real-Time PCR 분석.총 RNA는 다음에서 추출되었습니다.신장TRIzol 시약을 사용하여 조직. 그런 다음 M-MLV cDNA 합성 키트(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 1 μg의 total RNA를 단일 가닥 cDNA로 전환시켰다. Primer3 및 mfold 소프트웨어를 사용하여 각 유전자 서열에서 프라이머를 설계했습니다. 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 cDNA를 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭했습니다: rat PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sense), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(안티센스); 쥐 Nrf{10}} GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(센스), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(안티센스); 쥐 SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(센스), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(안티센스); 쥐 SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG-30(센스), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(안티센스); 쥐 -액틴, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30(센스), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG-30(안티센스). Real-time PCR은 ABI 7500 기기(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)와 함께 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다.
CISTANCHE는 신장/신장 통증을 개선합니다
4.4. 웨스턴 블로팅 및 면역침강.Western blotting은 약간 수정하여 이전에 설명한 대로 분석되었습니다[10].신장조직을 용해 완충액(PRO-PREP 단백질 추출 용액)으로 균질화하고, 인큐베이션(4℃에서 30분)하고, 원심분리(4℃에서 20분 동안 14,{4}} rpm)하였다. 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 결정되었습니다. 동일한 단백질 샘플을 7.5-15% SDS-PAGE에 로드하고 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼습니다. 그런 다음, 각 항체로 단백질을 면역블롯팅하였다. PGC{12}} 및 SIRT1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 입수했습니다. AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, FoxO1, FoxO3a 및 mTOR에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. Nrf2, Keap1(단량체) 및 -actin에 대한 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA) 및 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 면역 침전을 위해 총 500µg의 단백질을 PGC{22}} 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 및 protein A/G plus-agarose bead(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 그리고 4 ºC에서 밤새 혼합되도록 두었습니다. 그런 다음 면역 침전물을 SDS-PAG 전기영동을 사용하여 분리하고 아세틸-리신(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 및 포스포세린(MerckMillipore, Burlington, MA, USA) 항체를 사용하여 면역블롯팅했습니다. 그 후 막을 상온에서 60분 동안 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 단백질 수준은 -actin(ImageJ 버전 1.48q)에 의해 표준화되었습니다. Super Signal West Pico 강화 화학발광 기질(Thermo Scientific, Hudson, NH, USA)을 사용하여 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 및 면역침전 분석을 수행하고 LAS{32}} Plus(Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 검출했습니다.
4.5 mtDNA 함량 측정qPCR을 사용하여 mtDNA의 상대적 함량을 결정했습니다. 반응은 3ng의 총 DNA를 주형으로 사용하고 다음 프라이머를 사용하여 SYBR Green 화학을 통해 반응을 수행했습니다. 안티센스); 쥐 p-액틴, 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA(센스), C-CGTCTC-CGGAGTCCATCAC f(안티센스). 핵 DNA에 대한 mtDNA 함량은 [31]에 보고되었습니다.
4.6 통계 분석통계 분석은 SPSS 18.{1}} 소프트웨어(IBM Corp., Armonk, NYP USA)를 사용하여 수행되었습니다. 결과는 평균 土 SD로 표시됩니다. 그룹에 대한 평균은 Tukey의 다중 비교에 이어 분산 분석에 의해 비교되었습니다. p e 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
5. 결론
결론적으로, 미토콘드리아 생합성과 관련된 매개체 발현의 유의한 조절이 CKD 쥐 모델에서 관찰되었습니다. Omega{0}} FA는 Nrf1 및 Nrf2를 상향 조절하여 미토콘드리아 생물 생성을 개선할 수 있습니다. 이 보호 메커니즘은 PGC-1 발현의 증가와 PGC-1의 탈아세틸화를 통해 시작될 수 있으며, 이는 SIRT1/3 생산 증가에 의해 유발됩니다(그림 5). 그림 5. CKD에서 미토콘드리아 생합성에 대한 오메가-3 FA의 효과. 굵은 검은색 화살표는 CKD 쥐 모델에서 미토콘드리아 생합성과 관련된 매개체의 발현을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 오메가{10} FA 투여 후 매개체의 발현을 나타냅니다. 위/아래 화살표는 매개체 발현의 증가 및 감소를 나타냅니다.
