해마 세타 진동의 광유전학적 주파수 스크램블링은 해마 시공간 코드 3부에서 작업 기억 검색을 분리합니다.
Nov 06, 2023
MS 뉴런의 광유전학적 속도 조절은 비생리학적 세타 동시성을 유발합니다
놀랍게도 세타 진동의 속도와 관련된 8Hz 광유전학적 자극은 NPOR 작업에서 에피소드 메모리의 인코딩 또는 검색과 DNMT 작업의 공간 작업 메모리 검색 중에 적용될 때 성능이 저하되었습니다. 해마 생리학에 대한 페이싱 세타의 영향을 더 이해하기 위해 우리는 8Hz 광유전학 자극 전과 동안 세타 진동의 위상 잠금을 분석했으며(보충 그림 7a) 이러한 자극이 자극 시대에 걸쳐 위상 동기화가 증가한다는 것을 발견했습니다(보충 그림 7b). 또한, 우리는 등쪽 CA1(격막 측두엽 축을 따라 전극 사이 ~1mm 거리(보조 그림 7c))에 걸쳐 세타 진동의 상호 상관을 분석했으며 8Hz에서 페이싱 세타 리듬이 두 전극 사이의 상호 상관을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 보충 그림 7d).
유전학은 유전적 유전과 변이를 연구하는 과학이며, 기억은 큰 관심을 끄는 측면입니다. 그렇다면 유전학과 기억력은 어떤 관계가 있을까요? 이 기사에서는 유전적 관점에서 기억과 관련된 문제를 탐구할 것입니다.
우선 우리는 유전적 유전자가 인간의 신체적, 지적 발달의 기초가 되며, 이 유전자의 우월성이 사람의 기억력에 영향을 미친다는 것을 알고 있습니다. 최근 연구에 따르면 사람의 IQ와 기억력은 유전적 요인의 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 연구에 따르면 유전 유전자는 지능과 기억에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 그러므로 어떤 사람들은 더 강한 기억력을 가지고 태어나는 반면, 어떤 사람들은 기억력을 향상시키기 위해 열심히 노력하고 훈련해야 합니다.
둘째, 환경적 요인도 기억력 발달에 중요한 요인이다. 우리는 유전적 유전자의 지원이 필요할 뿐만 아니라 과학적 훈련과 좋은 생활 습관을 통해 기억력을 향상시켜야 합니다. 예를 들어, 우리는 매일 운동하고, 충분한 수면을 취하고, 식사 일치 원칙을 따르는 등 뇌 기능과 기억력을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
마지막으로, 일반 사람들은 기억력 발달에 유전적 요인이 미치는 영향을 지나치게 강조하지 않습니다. 유전적 요인이 절대적이지 않기 때문에 사람의 기억력과 지능은 노력과 훈련을 통해 스스로 향상될 수 있습니다. 우리는 항상 긍정적이고 지속적인 학습 태도를 유지해야 하며, 기억력 잠재력을 끊임없이 탐구하고 개발해야 합니다. 그래야만 우리가 더 똑똑해지고 더 큰 성취감을 가질 수 있다고 믿습니다. 정리하자면, 유전과 기억의 관계는 매우 가깝지만, 유전적 요인을 지나치게 강조해서는 안 되며, 자기계발과 훈련을 통해 기억력과 지능을 지속적으로 향상시켜야 합니다.
기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. Cistanche Deserticola는 많은 독특한 효과를 지닌 전통 중국 약재이기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그 중 하나는 기억력을 향상시키는 것입니다. 다진 고기의 효능은 산, 다당류, 플라보노이드 등 포함된 다양한 활성 성분에서 비롯됩니다. 이러한 성분은 다양한 방식으로 뇌 건강을 증진할 수 있습니다.
논의
Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >세타 리듬을 제어하고 해마 생리학 및 기억에서의 역할을 평가하기 위해 1초 미만의 분해능으로 MS 뉴런의 광유전학적 자극을 수행하는 동안 1,000개의 뉴런. 중요한 것은 흥분성 옵신과 스크램블 또는 8Hz 자극을 사용하여 각각 해마 세타를 일관되고 강력하게 폐지하거나 속도를 높일 수 있다는 것입니다.
억제성 옵신 또는 약리학적 화합물(예: muscimol)을 사용하는 MS 억제와 비교하여, 우리의 접근 방식은 MS-PV 세포의 활성 수준을 유지하면서 두 가지 반대 상태(진행 대 폐지세타)의 대상 내 비교를 가능하게 합니다. 우리는 정보 이론적 접근법과 함께 공간적 및 시간적 해마 코드를 풀 수 있는 단서 선형 트랙 작업을 결합했습니다. 이 방법은 임의의 임계값에 대한 필요성을 완화하여 칼슘 이미징 분석에 대한 표준화된 접근 방식을 가능하게 합니다. CA1 피라미드 뉴런의 상당 부분이 시공간 코드의 혼합을 표현하는 반면, 우리는 특히 장소, 시간 또는 이동 거리에 맞게 조정된 뉴런에 대한 분석에 중점을 두었습니다.
CA1에서 공간 코딩이 광범위하게 연구되었지만 최근 시간 및 거리 코드가 더 많은 관심을 얻었습니다. 임시 코드는 시각적 공간 단서를 클램핑하여 추출하거나 가상 현실 패러다임에서 일반화된 선형 모델을 사용하여 분석적으로 추출했습니다. 여기에서는 신호 전환 작업과 함께 자유롭게 움직이는 동물의 실제 시공간 및 다중화 코드를 분석할 수 있는 정보 이론 접근 방식을 사용하여 공간적, 시간적 및 거리 코드를 풀기 위한 접근 방식을 제안합니다. 대량의 CA1 피라미드 뉴런은 가속도, 속도 및 방향과 같은 자체 동작 신호 외에도 이전에 보고된 대로 위치, 거리 및 시간의 다중화된 정보를 인코딩합니다.
우리는 주파수 스크램블링과 8Hz 광유전학적 자극이 각각 세타 리듬을 대폭 폐지하거나 속도를 조절하고 CA1 피라미드 세포의 하위 집단에서 전반적인 활동을 감소시키는 동시에 장소 세포 활동에 큰 변화를 일으키지 않는다는 것을 발견했습니다. 이는 약리학적 억제를 사용한 이전 보고서와 유사합니다. 해마에 대한 MS 또는 중격 입력의 46,47 또는 광유전적9,48 속도. MS 뉴런은 해마 진동의 주요 동인으로 알려져 있기 때문에 우리는 MS 자극이 세타 리듬이 감소된 조건에서 시간 또는 거리 세포 활동의 방해와 연관될 것으로 예상했지만 세타가 폐지되거나 속도가 조절되면 변화가 발생하지 않았습니다. 또한, 8Hz로의 해마 진동 속도는 이전에 보고된 공간 코드의 품질 변화로 이어지지 않았으며 행동 패러다임에서 관찰된 시간 코드를 변경하지 않았습니다.
시간(장소는 아님) 세포가 내측 내후각 피질(MEC) 입력에 직접적으로 의존할 수 있다고 보고되었지만61, 최근 실험 증거에 따르면 MEC 병변이 해마 시간 세포 생리학에 어떠한 변화도 일으키지 않는 것으로 나타났습니다62. 특히 최근 조사에서는 MS의 광유전적 속도가 내후각피질의 격자 세포 공간 코드를 방해하지 않는 것으로 나타났으며63, 이는 MS 활동이 해마 형성 내의 공간 코드에 직접적으로 관여하지 않는다는 것을 더욱 시사합니다. 우리의 결과와 함께 이는 시간 코드가 내후각 피질63(1) 내에서 MS 종속 계산의 결과이거나 해마 자체(2) 내에서 본질적으로 생성될 수 있음을 나타냅니다.
초기 연구에서는 MS가 시간 세포를 유지하고 작업 기억을 지원하는 데 필수적인 역할을 한다는 사실이 밝혀졌지만, 최근 실험적 증거에 따르면 작업 기억 성능에 대한 시간 세포의 정확한 기여도는 이전에 생각했던 것보다 적을 수 있습니다. MS-PV 뉴런은 주파수 스크램블링 광유전학적 자극 동안 상당한 활동 수준을 유지할 가능성이 높기 때문에(억제 접근법과 대조적으로), 우리의 결과는 이전에 가정된 작업 기억을 지원하는 데 있어 정확한 시간에 맞춰진 중격 활동의 역할을 강력하게 뒷받침합니다. 검색 중에 광유전학적 자극을 사용할 때 메모리 성능이 감소하는 것을 관찰했지만 DNMTS 작업의 인코딩 단계 중 자극은 DNMTS 작업의 메모리 감소와 관련이 없습니다. NOPR 작업의 인코딩 또는 검색 단계에서 8Hz로 세타 진동을 페이싱하면 메모리 검색이 손상되었습니다. 우리의 전기생리학적 분석은 그러한 자극으로 인해 등쪽 CA1의 먼 영역이 비생리학적 위상 잠금과 함께 동일한 위상에 동반된다는 것을 추가로 보여줍니다. 우리는 위상 변화와 기억 성능 사이의 인과 관계를 직접적으로 조사하지는 않았지만, 스파이크 타이밍과 위상 세차 또한 장소 코딩을 그대로 유지했음에도 불구하고 변경된 작업 기억 기능과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다64. 더욱이, 세타진동에 대한 피라미드 뉴런의 위상 고정은 이전에 기억 성능을 예측하는 것으로 나타났습니다.
특히, 시간 및 거리 조정 속성을 설정하는 우리의 접근 방식의 한 가지 제한 사항은 실험 타임라인에 자극 조건을 추가할 때 광표백 가능성을 높이는 일반 선형 트랙보다 4배 더 많은 샘플링이 필요하다는 것입니다. 우리는 공간 코드가 동일한 세션 내에서 광유전학적 자극에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 발견했지만 감도가 향상된 센서를 포함하는 최신 이미징 하드웨어는 광표백을 방지하고 더 긴 녹음 세션을 허용하여 자극과 함께 시간 및 거리 셀을 샘플링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 우리는 하나의 변수만 유의미하고 구체적으로 인코딩하는 뉴런 풀이 결합 뉴런의 수에 비해 적기 때문에 이러한 매우 구체적인 뉴런에 대한 샘플링 요구 사항이 훨씬 높다는 것을 발견했습니다.
우리는 MS의 조작이 운동 속도를 변경하지 않으며 반대로 운동 속도가 세타 주파수를 결정한다는 실험적 증거를 제공합니다. MS 자극 중에 장소 및 시간 코드가 보존되었음에도 불구하고 세포의 일부(~6%)가 직접 변조되었으며 행동 분석에서 관찰된 기억 장애를 설명할 수 있습니다. 해마의 PV 개재뉴런은 이전에 기억 강화66,67 조절에 필수적인 미세회로의 일부인 것으로 보고되었으며, 우리의 광유전학적 조작은 이들 세포 일부의 침묵과 연관될 수 있습니다. 더욱이, 우리는 세타 이외의 주파수 대역의 변화를 관찰하지 못했지만 세타 진동을 스크램블링할 때 CA1 피라미드 뉴런 스파이크 타이밍이 급격하게 변경될 수 있다는 점을 배제할 수는 없지만 8Hz 자극은 해마 활동의 증가를 초래하지 않는 것으로 나타났습니다. 작업 기억 성능에 대한 자극 패턴. 우리가 관찰한 기억 장애는 비콜린성일 가능성이 높습니다. 첫째, 면역조직학적 실험에서 MS의 ChAT 뉴런에서 ChrimsonR의 발현이 사실상 없음을 발견했습니다. 둘째, 우리의 광유전학적 자극은 해마 잔물결의 변화와 관련이 없었습니다. 이전 보고서에서는 ChAT 뉴런은 리플주파수 감소와 관련이 있습니다45,57. MS VGLUT2 뉴런의 ChrimsonR 형질감염은 이러한 뉴런의 활성화가 우리가 관찰하지 못한 운동 활동 68의 직접적인 증가와 연관되어 있기 때문에 가능성이 낮습니다.
CA1 피라미드형 스파이크의 정확한 시간적 배열이 MS 자극이 기억에 미치는 영향을 적어도 부분적으로 설명할 수 있지만 대체 메커니즘을 고려해야 합니다. 특히 해마와 내후각 피질 외에도 MS PV뉴런은 비장후피질로 투사하며3 여기에서 관찰된 기억 장애 중 일부를 담당할 수 있습니다.
요약하자면, 칼슘 영상, 광유전학 및 전기생리학을 사용하여 우리는 MS 자극을 통해 세타 리듬의 속도를 조절하거나 폐지할 수 있음을 발견했습니다. 이러한 자극은 일시적인 기억과 작업 기억의 회복을 손상시킵니다. 이러한 효과는 비콜린성이었고 해마 파동 활동을 방해하지 않았습니다. 마지막으로, 해마 뉴런의 작은 부분이 MS의 광유전학적 자극에 직접적으로 반응하는 반면, 장소, 시간 및 거리 세포는 세타 진동의 조작에 의해 파괴되지 않았습니다. 이러한 결과는 해마에 대한 MS 입력이 기억에서 필수적인 역할을 하는 반면 CA1 피라미드 뉴런의 다중화된 코드는 그러한 기능의 직접적인 기질이 아닐 수 있음을 시사합니다.
행동 양식
동물
모든 절차는 McGill University Animal CareCommittee와 Canadian Council on Animal Care(프로토콜 2015-7650)의 승인을 받았습니다. 총 n=41 수컷(n=20) 및 암컷(n=21) 8~16주령, B6;129P2 PV-Cre 마우스(Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320)이 이 연구에 사용되었습니다. n=5 마우스는 광유전학과 칼슘 이미징을 결합하는 데 사용되었습니다. n=3 마우스는 칼슘 이미징, 광유전학 및 전기 생리학적 제어를 위해 이식되었습니다. n=4 생쥐가 전기생리학 연구에 사용되었습니다. n=29 마우스를 형질감염시키고 행동 분석을 위해 이식했습니다. 마우스를 22도 및 40% 습도에서 12-시간 명암 주기로 먹이와 물을 자유롭게 섭취하면서 개별적으로 사육했습니다. 모든 실험은 명암 주기의 명암 부분 동안 수행되었습니다.
아데노 관련 바이러스 벡터
Adeno 관련 바이러스 AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40(Addgene# 100834, University of Pennsylvania Vector Core에서 입수)을 모든 칼슘 이미징 실험에 사용했습니다. 혈청형 dj의 아데노 관련 바이러스(AAV)(8개의 서로 다른 AAV 혈청형에서 생성된 하이브리드 캡시드) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato는 오리건 주 포틀랜드에 있는 오리건 보건 과학 대학의 벡터 코어 시설에서 얻었습니다. 그는 하우스키핑 유전자이지만 콜린성 세포에서 형질감염을 관찰하지 않았습니다("결과" 및 그림 2b-e 참조). ChrimsonR 서열이 없는 eYFP 구성은 대조군(이 원고에서는 YFP 대조군이라고 함)으로 사용되었습니다.
수술 절차
마우스를 이소플루란(5% 유도, 0.5-1% 유지)으로 마취하고 정위 프레임(David Kopf Instruments)에 배치했습니다. 체온은 가열 패드로 유지하고 눈은 젤로 수분을 공급했습니다(Optixcare). , 카프로펜(10 ml/kg)을 피하 투여하였다. 두개골에서 모든 결합 조직을 완전히 제거하고 후속 주입 또는 임플란트를 위해 치과용 드릴을 사용하여 작은 개두술을 수행했습니다.
바이러스 주사. 모든 바이러스 주입은 Nanoject III(Drummond) 주입기에 연결된 유리 피펫을 사용하여 수행되었습니다. 500 AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato(또는 eYFP 제어) nl은 참조 마우스 정위 아틀라스69(Bregma로부터의 거리)를 기준으로 다음 좌표에서 1 nL/s의 속도로 MS에 전달되었습니다. mm): 전후(AP) 0.85, 내측(ML) 0, 배측(DV) −4.50, ML 평면에서 5도 각도 사용. 수술 후, 회복될 때까지 동물을 모니터링하였다.
광섬유 임플란트. 주사 후 2주 후에, 동일한 수술 절차에 따라 이식을 위해 마우스를 마취시켰습니다. 세라믹 페룰(Thorlabs)이 있는 A200μm 직경의 광섬유가 동일한 좌표에 이식되었습니다. C&B-Metabond®(Patterson Dental)를 사용하여 임플란트를 제자리에 접착했습니다. 광유전학적 자극 동안 빛 방출을 차단하기 위해 치과용 시멘트 위에 검정색 매니큐어를 발랐습니다.
전극 임플란트. 7개의 텅스텐 미세 전극 배열(~1 MΩ임피던스)이 Stratumpyramidale(pyr), Stratum Radiatum(rad) 및 Stratum lacunosummoleculare(lm)에 걸쳐 있는 등쪽 CA1에서 낮아졌습니다. 전두엽 피질과 소뇌 위의 뼈에 배치된 나사는 각각 접지 및 기준 역할을 했습니다. 전극, 접지 및 기준 배치 후 임플란트를 두개골에 영구적으로 고정하기 위해 치과용 시멘트를 적용했습니다.
칼슘 이미징을 위한 임플란트. 우리는 다음 좌표를 사용하여 해마 CA1에 AAV5.CamKII.GCaMP6f바이러스(1 nl s−1에서 200 nL)를 주입했습니다: 브레그마에서 전후(AP) − 1.86 mm, 내측(ML) 1.5 mm, 배측 (DV) 1.5mm. 주사 후 2주 후에 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 두개골을 깨끗이 제거했습니다. ㅏ<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.
동시 칼슘 이미징 및 전기생리학적 기록. 해마 세타에 대한 GRIN 임플란트의 효과와 미니 스코프와 광유전학적 여기광 사이의 누화를 제어하기 위해 우리는 GRIN 렌즈에 텅스텐 마이크로 전극을 부착했습니다. 이를 위해 우리는 먼지가 없는 환경에서 저배율 현미경 아래에 GRIN 렌즈를 수평으로 배치했습니다. 텅스텐 미세전극은 미세 조작기를 사용하여 GRIN 렌즈의 상단 가장자리에 부드럽게 배치되었습니다. 우리는 계획된 이식 좌표에 따라 전극의 원하는 돌출부(~50μm, 준비 과정의 현미경 사진을 찍은 후 디지털 방식으로 추가 평가)를 추정하기 위해 기준 단위로 알려진 GRIN 렌즈 직경을 사용했습니다. 소량(~50μL)의 초강력 접착제를 전극이 제자리에 있는 GRIN 렌즈의 상단 가장자리에 증착하고 다음 접착제 층을 적용하기 전에 ~10분 동안 건조되도록 두었습니다. GRIN 렌즈에 부착된 전극을 유지하기 위해 5개의 얇은 층이 사용되었습니다. 위에 설명된 프로토콜을 사용하여 이러한 GRIN 전극 어셈블리를 이식한 후, 돌출된 와이어를 부드럽게 구부려 Kwik-Sil을 대체하는 수동 흡입 피펫의 배에서 회수한 보호 캡(1~1.5cm 높이) 아래에 숨겼습니다.
생체 내 행동 절차
습관화. 플러깅 절차(광섬유, 미니스코프 및 전기생리학적 사전 증폭 테더)에 대한 점진적인 습관화를 통해 마우스를 일주일에 걸쳐 ~5분 동안 부드럽게 다루었습니다. 그런 다음 동물을 물에 따라 일정을 잡았습니다(하루 2시간 접근).
미니스코프 녹음. 미니스코프(V3)는 오픈 소스 지침(miniscope.org)을 사용하여 조립되었습니다. 이미징 데이터는 CMOS 이미징 센서(Aptina, MT9V032)를 사용하여 수집되었으며 경량 동축 케이블을 통해 다중화되었습니다. 데이터는 USB 호스트 컨트롤러(Cypress, CYUSB3013)를 통해 연결된 데이터 수집(DAQ) 상자를 사용하여 수집되었습니다. 동물 행동은 환경 위에 장착된 소비자용 웹캠(Logitech)을 사용하여 기록되었습니다. 칼슘 및 행동 데이터는 소스 DAQ 맞춤형 획득 소프트웨어인 miniscope.org를 사용하여 기록되었습니다. DAQ는 행동 및 칼슘 이미징 데이터의 정확한 시간적 정렬을 가능하게 하기 위해 해당 타임스탬프와 함께 15-분 기록 세션에 대한 1000프레임의 비압축.avi 파일로 30Hz에서 행동 및 세포 이미징 스트림을 동시에 획득했습니다.
생체 내 전기 생리학적 기록. 수술 후 회복 1주와 테더링 설정에 대한 습관화 1주 후 이식된 마우스의 LFP가 기록되었습니다. 이식된 전극으로부터 기록된 모든 신호는 디지털 기록 시스템(Neuralynx, USA)을 사용하여 22kHz에서 디지털화되기 전에 테더 프리앰프에 의해 증폭되었습니다. 각 채널 신호의 녹음은 후속 분석을 위해 레이저 다이오드의 비디오 녹음 및 TTL 신호와 함께 저장되었습니다.
광유전학적 자극. 레이저 다이오드 광섬유 광원(Doric Lenses)을 사용하여 광섬유 코드(직경 200μm)를 통해 레이저 자극을 전달했습니다. PM100D 콘솔 및 S130C 슬림 포토다이오드 센서라이트(Thorlabs)가 포함된 파워 미터 번들을 사용하여 광도를 보정하고 파장을 보정했습니다. 모든 페이싱 자극(8Hz 포함)은 5ms 사각 펄스를 사용하여 수행되었습니다. 스크램블된 광 자극을 적용하기 위해 Arduino 마이크로컨트롤러를 사용하여 레이저 다이오드 드라이버의 아날로그 입력에 직접 공급되는 백색 잡음 발진 신호를 생성했습니다. 무작위로 선택된 주파수 자극을 수행하기 위해 표준 5초 ON, 5초 OFF 프로토콜을 사용했지만 각 자극 에포크마다 Arduino 마이크로컨트롤러를 사용하여 세타 대역에서 자극 주파수를 무작위로 선택했습니다. 행동 중에 광유전학적 자극을 적용할 때 패치코드와 마우스 페룰 임플란트 사이의 접합부 주위에 느슨한 열 수축 튜브 조각을 장착하여 가시광선 방출을 제한했습니다. 광도는 광섬유 임플란트-코드 어셈블리의 끝 부분(수술 배치 전)에서 측정하고 적절한 파장에 대해 보정된 공칭 전력으로 표시됩니다.
행동 분석
순차 톤 선형 트랙. 생쥐는 물에 따라 일정이 잡혀 있었고 오후 6시부터 8시까지 하루 2시간 동안만 물에 접근할 수 있었습니다. 공간적, 시간적, 거리 코드를 풀기 위해 우리는 중간 회색 레고® 블록을 사용하여 134cm 길이의 선형 트랙을 만들었습니다. 미로의 구조를 영구적으로 수정해야 합니다. 초전기 센서는 선형 트랙의 각 끝에 배치되었으며 Arduino 마이크로 컨트롤러에 연결되었습니다. 각 감지는 순차적으로 새로운 신호음을 발생시켜 보상 전달 진행 상황을 나타냅니다. apiezo 스피커를 사용하여 다음 톤이 사용되고 전달되었습니다. 2000Hz에서 1초 경고음, 3000Hz에서 250ms 경고음, 4000Hz에서 연속 톤. 마지막 연속 신호음이 발생하면 보상(물 중 10% 자당)이 15mL Falcon 튜브 캡에 있는 선형 트랙의 시작 끝 부분에 전달되었습니다. 다음 신호음이 발생하기 전에 달리는 방향을 변경하면 오류로 간주되어 보상 전달이 발생하지 않습니다. 성과는 올바른 시행 횟수(오류 없음)를 총 시행 횟수로 나누어 측정했습니다.
새로운 물체 위치 인식. 첫째 날, 쥐는 벽에 시각적 신호(큰 흰색 수평 및 수직 격자)가 포함된 45 x 45cm 어두운 회색 열린 필드를 10분 동안 자유롭게 탐색하도록 허용되었습니다. 둘째 날에는 두 개의 동일한 물체(도우미 베이스)가 10분 동안 제시되었습니다. 셋째 날에는 두 물체 중 하나의 위치가 바뀌는 동안 생쥐가 동일한 열린 필드를 탐색하도록 허용되었습니다. 잠재적인 공간 선호 편향을 제어하기 위해 객체의 초기 위치와 변위된 위치를 모두 무작위화했습니다. 생쥐는 3일간의 테스트 기간 동안 동일하게 유지되는 무작위 테스트 순서를 부여했습니다. 행동은 비디오 카메라(Logitech)로 녹화되어 오프라인으로 분석되었습니다. 행동 분석은 유전자형과 치료에 대해 맹목적으로 수행되었습니다. 개체 탐색은 마우스가 개체의 1cm 이내에 코를 갖는 시대로 정의되었습니다. RI는 다음과 같이 계산되었습니다.
샘플 작업과의 자동 지연 불일치. 마우스는 물을 섭취하도록 일정을 잡고 지속적인 T-미로에서 지연된 비일치 샘플 작업에 대한 훈련을 받았습니다. 간단히 말해서, 각 시험은 샘플과 테스트의 두 단계로 나누어졌습니다. 샘플 단계에서 한쪽 팔은 차단되었고 마우스는 반대쪽 팔을 탐색하도록 강제되었으며, 여기서 50μL의 10% 자당 물 보상을 받았습니다. 샘플 단계를 완료한 후 마우스는 시작 구획에서 지연(10초)을 받았습니다. 그런 다음 테스트 단계에서 두 팔을 모두 탐색할 수 있었지만 반대쪽(탐사되지 않은) 팔만 미끼를 사용하여 마우스가 샘플 단계와 테스트 단계 사이에서 위치를 번갈아 가며 수행해야 했습니다. 마우스는 연속 10일 동안 하루에 10번의 시도(샘플 + 테스트)를 받았고 일일 성공률은 올바른 시도 횟수를 총 시도 횟수로 나누어 계산했습니다.
사후 조직학적 분석
행동 테스트가 완료된 후, 쥐를 케타민/자일라진/아세프로마진(각각 100, 16, 3mg/kg, 복강내 주사)의 혼합물로 깊게 마취시키고 PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드(PFA)를 심장을 통해 관류시켰습니다. 뇌를 추출하여 4도의 PFA에서 밤새 후고정한 다음 PBS에서 4도에서 추가로 24시간 동안 세척했습니다. 뇌와 절편은 사용할 때까지 30% 에틸렌 글리콜, 30% 글리세롤, 40% PBS 용액에서 동결 보호되었습니다. 각 뇌는 vibratome을 사용하여 50μm로 절편되었습니다. 모든 절편은 서로 다른 분석을 허용하기 위해 4개의 서로 다른 1.5mL 튜브에 순차적으로 수집되었습니다. (전극 위치, 면역조직화학).
면역조직학. 각 분석을 위해 수집된 뇌 절편(25% 샘플링)의 한 튜브를 사용하여 절편을 PBS에서 3 x 5분 동안 세척하여 동결 보호 용액을 제거했습니다. 섹션을 4도에서 PGT(0.45% 젤라틴 및 PBS 내 0.25% 트리톤)와 함께 밤새 배양했습니다. 다음으로 슬라이스를 1차 항체(1:200 염소항-콜린-아세틸 또는 1:200)와 함께 배양했습니다. - Millipore의 전이효소 또는 PGT의 Sigma-Aldrich의 1:500 마우스 항-PV단클론성 IgG1을 실온에서 각각 48시간 또는 2시간 동안 처리합니다. 10분, 20분, 30분 동안 세척한 후 절편을 PGT에서 2차 항체[Alexa 488과 결합된 1:2000 당나귀항염소 또는 Alexa 488(Life Technologies)과 결합된 1:500 염소 항마우스 IgG1]과 함께 배양했습니다. 45분 PBS에서 10분, 20분, 30분 세척 후 절편을 유리 슬라이드에 올려 놓고 DAPI가 포함된 Fluoromount 마운팅 매체로 영구적으로 커버슬립했습니다. 조직학적으로 임플란트 배치가 확인된 마우스만 이 연구에 포함되었습니다. GRIN렌즈의 경우 렌즈 표면은 다음과 같아야 했습니다.<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.
데이터 분석
Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >선형 트랙에서는 5 cm s−1).
행동을 자동으로 추적합니다. 쥐의 위치, 속도, 머리 방향에 대한 정보를 추출하기 위해 DeepLabCut70,71을 사용했습니다. 간단히 말해서, 우리는 쥐의 귀, 코, 몸, 꼬리 밑부분을 감지하는 모델을 훈련했습니다. 머리 방향은 측정 가능 여부에 따라 각 귀 또는 코와 몸 사이의 각도를 사용하여 추정되었습니다. 위치 데이터는 선형 보간법을 사용하여 칼슘 이미징 샘플링 빈도로 보간되었습니다. Δd/Δt(여기서 d는 거리이고 t 시간임)를 계산하여 속도를 추출한 후 시그마=33 ms를 사용하여 가우스 필터를 적용하여 감지 아티팩트를 제거하여 결과를 평활화했습니다. 속도 신호는 운동 활동 기간을 식별하고 해당 기간에 대한 활동의 장소, 시간 및 거리 변조를 계산하는 데 사용되었습니다.
칼슘 영상 분석. 칼슘 이미징 데이터 분석은 MATLAB 2020a 및 Python 3.8.4를 사용하여 수행되었습니다. Miniscope Analysis 파이프라인(https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalytic)을 사용하여 비디오 녹화를 분석했습니다. 간단히 말해서 NoRMCorre72를 사용하여 고정(회전 및 이동) 모션 보정을 적용했으며 연결하기 전에 비디오를 공간적으로 다운샘플링(3x)했습니다. gSig=3 픽셀(가우스 커널 너비), gSiz=20 픽셀(대략적인 뉴런 직경), 배경_모델=매개변수를 사용하여 CNMFe51을 사용하여 칼슘 추적을 추출했습니다. '링', 공간_알고리즘='hals', min_corr=0.8(최소 픽셀 상관 임계값), min_PNR {{17 }} (최소 피크 대 잡음 비율 임계값).
고주파 변동을 제거하기 위해 원시 칼슘 추적을 필터링하고 이진화했습니다. 간단히 말해서, 정규화된 칼슘 신호 진폭이 두 표준 편차를 초과하고 1차 도함수가 0보다 높을 때 뉴런이 활성인 것으로 간주되었습니다(자세한 내용은 참조 52 참조). 방법론52). 특정 변수에 맞춰 조정된 뉴런을 추출하기 위해 위치, 시간 및 거리를 비닝했습니다(위치: 3cm 빈, 시간: 1s 빈, 거리: 3cm 빈). 이진화된 신호로부터 우리는 신경 활동의 프록시로 사용하는 세포가 활성 상태일 P Að Þ의 한계 가능성을 계산했습니다. 더 중요한 것은 비닝된 변수를 사용하여 활동 가능성 또는 '변수 상태에 따라 활성 상태가 될 확률' PA j Si를 도출한다는 것입니다.
여기서 M은 가능한 행동 상태의 총 개수이고 P(Si∩Aj)는 동물이 활동 수준 j(0 또는 1)와 동시에 bin I에 있을 확률입니다. 얻은 MI 값의 중요성을 평가하기 위해 무작위 순환 순열을 사용하여 1000개의 섞인 대체를 생성했습니다. 순환 순열을 선택한 이유는 신경 활동과 행동 사이의 시간적 관계를 제거하는 동시에 칼슘 과도 현상의 시간적 구조를 유지하여 보다 보수적인 결과를 얻을 수 있기 때문입니다(결과의 유의성 값을 부풀리는 모든 데이터 포인트의 완전한 무작위화와는 대조적). 섞인 서로게이트는 체계적으로 정규 분포되지 않았기 때문에 p-값(pN)이 각 bin의 실제 데이터보다 큰 섞인 분포의 데이터 포인트 수를 순열 수로 나눈 값에 해당하는 비모수적 접근 방식을 사용했습니다52. 73.
광유전학적 자극에 의한 세포의 조절을 결정하기 위해 우리는 유사한 접근법을 사용했지만 뉴런 활동과 이진화된 자극 신호 사이의 MI를 계산했습니다(따라서 행동 상태로 처리됨). 그런 다음 동일한 순환 셔플링 절차를 사용하여 통계적 유의성을 추출했습니다.
where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, 훈련 데이터 세트는 데이터의 90%를 사용하여 생성되었습니다. 나머지 10%의 데이터는 테스트에 사용되었습니다. 디코딩 오류는 50개의 부트스트랩 대체 데이터와 무작위로 선택된 데이터 포인트를 사용하여 160개의 셀 풀을 사용하여 계산되었습니다. 모든 뉴런은 서로 독립적인 것으로 가정하는데, 실제로는 그렇지 않으며 재구성 오류가 더 커지지만 계산 시간이 단축됩니다. 모집단 사후 확률은 다음 방정식에서 파생되었습니다.
여러 날에 걸쳐 세포를 추적합니다. 뉴런은 CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg(v1.5.3)를 사용하여 여러 날에 걸쳐 추적되었습니다. 간단히 말해서 공간 발자국은 회전 및 변환을 수정하기 위해 고정 정렬을 사용하여 정렬되었습니다. 정렬 후, 우리는 최대 거리가 다음과 같은 경우 세포의 후보 세트를 동일한 뉴런으로 간주했습니다.<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).
전기생리학적 분석. 전기생리학적 데이터 분석은 신호 처리와 웨이블릿 툴박스를 모두 사용하는 MATLAB 2020a를 사용하여 수행되었습니다. 시간 및 주파수 영역 정확도가 모두 필요할 때 복잡한 Morlet 웨이블릿(MATLAB의 'cmor1–1.5')을 사용하여 웨이블릿 컨볼루션을 LFP 신호에 적용했습니다. 이동 창 푸리에 컨볼루션(세타 대역의 2초 창, 감마 대역의 5초 창, 10ms 이동 단계)은 주파수 영역 정확도가 시간 영역 정확도보다 우선시될 때 사용되었습니다(예: 광유전학을 사용하여 페이싱할 때 상위 플롯 지배 주파수). 전력 스펙트럼 밀도 분석은 달리 설명하지 않는 한 마우스가 5 cm s -1 이상에서 달릴 때 수행되었습니다.
진동 강도. OS는 최대 발진 주파수 ±1Hz 주변의 누적 전력 스펙트럼 밀도와 세타(4~12Hz) 대역의 누적 대역 전력의 비율로 계산되었습니다. 모든 전력 스펙트럼 밀도가 피크 발진 주파수(예: 해당 주파수에서 자극하는 경우 8Hz) 내에 속하면 이 메트릭은 1이 됩니다.
SWR 감지 및 분석. SWR을 모니터링하기 위해 마우스는 기록하는 동안 10분 동안 열린 필드를 자유롭게 탐색할 수 있었습니다. 자극(스크램블 또는 8Hz)은 5초 ON, 5초 OFF 패러다임으로 수행되었습니다. 조용한 휴식 기간만 분석에 고려되었습니다. 이를 위해 각 주파수 대역에 대해 필터링하고 Hilbert 변환을 수행한 후 결과 값이 0 미만인 기간만 고려한 후 세타/델타 전력의 z 점수 비율을 계산했습니다. SWR을 감지하기 위해 LFP 신호를 150~250 범위에서 필터링했습니다. Hz 주파수 대역을 사용하고 이후에 z 점수를 매깁니다. 임계값=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s 매개변수와 함께 MATLAB의 findpeaks 함수를 사용하여 잔물결이 감지되었습니다.
참고자료
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