푸칼레스 파트 2의 플로로탄닌 성분 개요
Jun 30, 2023
5. 방법특성화 및 정량화
PT의 생체 활성 및 다양한 치료 전략에서의 잠재적 응용에 대한 관심이 기하급수적으로 증가하고 있음에도 불구하고 이러한 화합물을 다룰 때 주요 어려움 중 하나는 화학적 특성 및 구조 설명입니다. 상업적 표준의 제한된 가용성과 관련하여 PT의 엄청난 화학적 변동성과 복잡성으로 인해 PT 분석은 현재 상당히 어려운 작업으로 남아 있습니다. 비색법[56,72,73]을 사용하여 PT 추정을 넘어서지 않는 작업을 찾는 것이 다소 일반적입니다. 그럼에도 불구하고 PT의 구조적 특징을 밝히기 위해 많은 노력을 기울였으며 이미 이러한 화합물의 화학에 대한 관련 통찰력을 제공했습니다.
Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력이 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하는 능력이 있으며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.
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이 분야에서 질량 분석법과 결합된 액체 크로마토그래피는 이러한 화합물의 신속한 분석을 위한 강력한 분석 도구로 계속 자리 잡고 있지만 육상 페놀과 비교할 때 약간의 차이가 있습니다. 이 주제는 Fucales에서 PT를 분리하고 식별하는 데 사용된 방법과 관련하여 지난 몇 년 동안 이루어진 발견을 발전시킵니다.
5.1. 플로로타닌의 분광광도계 정량화
PT 정량화를 위한 분광광도계 방법은 주어진 샘플 또는 추출물에서 PT 함량을 평가하는 빠르고 간단한 접근 방식을 제공합니다. 페놀 화합물로서 Folin-Denis 또는 Folin-Ciocalteu(FC) 방법은 총 PT 함량을 모니터링하기 위한 실행 가능한 접근 방식으로 남아 있습니다. 두 방법 모두 약 760nm에서 흡수 스펙트럼을 갖는 파란색을 형성하는 인텅스텐-포스포몰리브덴 시약(FC 시약)의 잘 알려진 화학적 페놀 매개 환원을 기반으로 합니다[74]. 그러나 PT가 갈조류에 존재하는 주요 페놀 화합물임에도 불구하고 몇 가지 다른 비-플로로탄닌 페놀 화합물도 존재합니다[75]. 또한 이 시약은 페놀류뿐만 아니라 시료 내 어떠한 환원 물질(예: 당, 단백질, 비타민, 티올, 무기 이온)과도 반응하여 총 환원력을 측정하기 때문에 감도가 떨어진다[76]. . 따라서 초점이 PT인 경우 이러한 비특이적 반응이 잘못된 판독 및 잘못된 추정으로 이어질 수 있으므로 이는 가장 적합한 접근 방식이 아닐 수 있습니다. 보다 구체적인 방법은 Stern et al에 의해 개발되었습니다. [77] 2,4- 디메톡시벤즈알데하이드(DMBA)를 사용하여 플로로글루시놀 및 PT와 같은 1,3- 및 1,3,{18}}치환된 페놀에 특이적으로 반응하고 트리페닐메탄 안료를 형성합니다. 510 nm 범위에서 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이 반응은 화합물의 분지 정도 또는 할로와 같은 추가 수산기의 존재에 따라 달라집니다. DMBA와의 반응은 수산기 사이에서 2, 4 또는 6 위치를 통해 일어나야 하기 때문에 이러한 위치를 치환하면 발색단 형성이 방해되어 결국 과소 평가됩니다.
이러한 방법은 수많은 샘플의 PT 함량을 신속하고 예비적으로 추정하는 데 유용한 것으로 간주되지만 주요 단점은 개별 화합물을 정확하게 정량화하고 식별할 수 없다는 점입니다. PT의 구조적 특징에 대한 적절한 해명.
5.2. 플로로타닌의 분리 및 확인 방법
5.2.1. HPLC-DAD
구조적 유사성과 복잡성으로 인해 개별 화합물의 PT 분석 및 식별은 상당히 어려운 작업으로 남아 있습니다. PT 분석에서 직면하는 주요 문제 중 하나는 크로마토그래피 분리입니다. 화합물 구조의 밀접한 유사성과 다중 이성질체 형성 가능성으로 인해 HPLC를 사용할 때 개별 PT를 적절하게 분리하기 어렵고 업그레이드된 UHPLC에서도 마찬가지입니다. 이 분야에서 문헌은 역 크로마토그래피와 순상 크로마토그래피의 두 가지 주요 접근 방식으로 나뉩니다. 한편으로, 역 크로마토그래피는 복잡한 시료 내에서 유사한 구조를 가진 화합물을 분리하는 데 유용하지만 PT의 높은 극성 특성은 이동상과의 특별한 친화력을 제공하여 매우 빠른 용출을 일으키고 일반적으로 잘 분해되지 않는 "혹"을 형성합니다. " [78]. 그러나 이 기술은 Fucus 속(F. vesiculosus, F. Aguirre, F. serratus 및 F. spiralis), Cystoseira(C. nodi caulis)의 여러 종을 포함하여 여러 Fucales의 PT 분석에 널리 사용되었습니다. , C. tamariscifolia 및 C. usneoides), A. nodosum 및 B. bifurcate 등; 일반적으로 8–10 단위보다 긴 화합물을 분리할 수는 없지만 이러한 해조류의 PT 프로필의 낮은 중합도에 대한 귀중한 통찰력을 얻는 데 매우 유용했습니다[16,47,48,50,79]. 다른 한편으로 순상은 이러한 고극성 화합물을 더 잘 유지하는 극성 고정상의 사용을 포함합니다. PT 분리 및 분리를 위한 이 기술의 사용은 과거에 저자가 화합물의 사전 아세틸화를 적용하면서 더 빈번했습니다. 실제로 Glombitza와 그의 동료들은 이 기술을 사용하여 Cystophora, Sargassum 및 Carpophyllum[80-83] 속에서 여러 PT를 분리하고 특성화할 수 있었으며 Carpophyllum angustifolium[84] 및 다른 종에서 할로겐화된 PT를 식별할 수도 있었습니다. 속, Cystophora [85,86]. 최근에는 Koivikko et al. [87]은 이전 아세틸화 단계 없이 F. vesiculosus PT를 중합도에 따라 분리하는 데 적합한 NP-HPLC 방법을 개발했으며, RP-HPLC에 비해 머무름 시간과 피크 정의가 개선된 크로마토그램을 생성할 수 있습니다. 이 기술은 또한 A. nodosum이 투여된 지원자의 소변 샘플에서 PT 대사산물 분석에 사용되었습니다[88]. NP-HPLC의 주요 문제는 더 많은 수의 하이드록시 그룹을 가진 더 높은 PT가 극성 고정상과 강한 상호 작용을 설정하여 용출을 매우 어렵게 만든다는 것입니다. 더욱이 ESI와 일반적인 NP 용매를 인터페이스하는 것은 100% 비극성 용매에서 낮은 이온화 효율로 인한 감도 감소로 인해 어려울 수 있습니다[78].
최근 이러한 문제를 극복하기 위한 대체 방법이 모색되었습니다. 이것은 순상 액체 크로마토그래피의 변형으로 간주되는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)의 경우이며, 친수성 고정상과 역상이 낮은 수용성 용리액이 결합하여 이동상에서 두 개의 층 형성을 촉진하는 것이 특징입니다. 즉, 물이 풍부한 층이 극성 고정상의 표면에 형성되고 또 다른 유기물이 풍부한 층이 그 위에 형성되어(그림 3) 컬럼 내부에 액체/액체 추출과 유사한 시스템을 생성합니다[89 ]. 이 크로마토그래피 모드에서 분석물은 이 두 층 사이에 분포되고 이 두 상 사이에서 발생하는 분할 평형 이동에 따라 용리되지만 쌍극자-쌍극자, 수소 결합 및 정전기력과 같은 다른 상호 작용도 중요한 역할을 합니다[90 ].
이러한 특성으로 인해 HILIC 컬럼은 PT 분리에 가장 적합하며 극성 고정상과 강력한 상호 작용을 확립하여 결과적으로 머무름 시간과 분리를 증가시킵니다. 이 기술은 다른 Fucales, 즉 F. vesiculosus, F. spiralis, A. nodosum, S. longicorns 및 P. canaliculata의 추출물에서 PT를 분리하는 데 적용되어 중합도가 3에서 49 단위 [78], 이는 Tierney et al. [45], F. spiralis, A. nodosum 및 P. canaliculata를 프로파일링하기 위해 RP 컬럼을 사용하여 유사한 연구를 수행했으며 최대 16 단위의 DP가 있는 화합물의 검출을 달성했습니다[45].
보다 최근에는 2D LC 기술(그림 4)이 해조류 추출물에서 PT의 복잡한 혼합물을 평가하는 데 성공적으로 사용되어 훨씬 향상된 분리를 달성했습니다. 이 접근법에서 시료는 순차적으로 연결된 두 개의 분리 컬럼이 포함된 장치에 주입되어 첫 번째 컬럼에서 나오는 용리액이 다른 조건을 사용하여 실행되는 두 번째 컬럼으로 이동됩니다. 일반적으로 두 번째 컬럼에는 첫 번째 컬럼을 보완하는 분리 메커니즘이 있어 첫 번째 컬럼에서 제대로 분해되지 않은 피크가 두 번째 컬럼에서 적절하게 분리될 수 있습니다[91]. 특정 PT의 경우, 가장 자주 보고되는 설정은 중합도에 따라 화합물을 분리하기 위한 HILIC 컬럼(1차원)과 소수성에 따라 분리할 수 있는 RP 컬럼(2차원)의 조합을 설명합니다. 이 기술을 사용하여 Montero et al. Cystoseria abies-marina[4] 종에서 50개 이상의 화합물과 Sargassum muticum[92]에서 70개 이상의 화합물을 분리하고 검출할 수 있었습니다. 표 2는 Fucales에서 PT의 분리 및 검출을 위해 시간이 지남에 따라 사용된 다양한 크로마토그래피 구성 및 조건을 정리한 것입니다.
당연히, 사용된 컬럼에 관계없이 U/HPLC는 화합물이 용출될 때 화합물을 모니터링하기 위해 항상 검출 시스템에 연결해야 합니다. UV-Vis 검출기, 특히 포토다이오드 어레이(PDA)는 많은 관심 천연 화합물이 UV-Vis 영역(190-600nm)에서 흡수하기 때문에 HPLC와 하이픈이 연결된 가장 일반적인 검출기일 것입니다[93]. 특히 페놀은 일반적으로 270~280nm 부근에서 강한 흡광도를 나타내며 PT도 예외가 아닙니다. HPLC-PDA를 사용하여 화합물을 식별하는 것은 주어진 화합물의 UV 스펙트럼 및 머무름 시간을 상업적 표준과 비교하여 달성할 수 있습니다. 또한 이 기술은 복잡한 시료에서 개별 화합물의 함량을 결정하는 데 매우 유용합니다. 이러한 화합물의 농도는 흡광도로 출력되며 Beer의 법칙[95]을 사용하여 정량적으로 측정할 수 있기 때문입니다. 그러나 PT를 식별하고 정량화하기 위한 이 접근법의 적용은 이 목적에 사용할 수 있는 상용 표준의 수가 적기 때문에 매우 제한적입니다. 따라서 PT 식별에는 일반적으로 질량 분석법(MS) 또는 핵 자기 공명(NMR)과 같은 보다 강력한 기술이 필요합니다.
5.2.2. 질량 분석
U/HPLC 장비에 직접 결합된 MS의 사용은 복잡한 추출물의 특성 분석에 혁명을 일으켜 상대적으로 짧은 기간에 높은 감도를 제공하고 분석 능력을 향상시켰습니다. 이러한 이유로 이 기술은 PT를 포함하여 일반적으로 페놀 화합물의 특성화 및 식별을 위한 안정적인 방법이 되었습니다. 탠덤 MS 또는 MS/MS를 사용하면 화합물의 의사 분자 이온(일반적으로 전기분무 이온화를 통해 생성됨)이 컬럼에서 용출될 때 질량 대 전하비(m/z)를 검출하고 추가로 각각의 단편화를 얻을 수 있습니다. CID(collision-induced dissociation)를 통한 패턴 [118]. 이것은 형성된 조각이 이를 생성한 부모 이온의 구조적 특징에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있기 때문에 PT 할당에서 중요한 단계입니다. 일반적으로 거의 모든 PT는 MS2에서 하나 또는 두 개의 물 부분의 손실에 해당하는 기본 피크를 나타냅니다[46]. 마찬가지로, 126 Da의 손실은 PT의 구성 요소인 플로로글루시놀 모이어티에 해당하기 때문에 이러한 화합물의 공통적인 특징입니다[119]. 플로로글루시놀 단위 사이에 확립된 연결 유형을 이해하려면 다른 사람에게 해를 끼치는 특정 중립적 손실이 나타나는 것이 중요합니다. 예를 들어, C-C 결합이 일반적으로 C-O-C 결합보다 끊기 위해 더 높은 에너지를 필요로 한다고 가정하면 동일한 중합도를 가진 푸콜, 플로레톨 및 푸코플로레톨은 동일한 분자량을 나타내지만 결국 다른 조각화 패턴을 생성합니다. 플로레톨에서 조각화는 에테르 결합의 양쪽에서 발생할 수 있으며 플로로글루시놀, 테트라하이드록시 벤젠 또는 레조르시놀에 해당하는 126, 142 또는 110 Da의 중성 손실을 생성할 수 있습니다(그림 5A). 단위. 대조적으로 연료의 CC 결합 특성이 끊어지면 126 Da(플로로글루시놀)의 중성 손실만 발생할 수 있으며 이러한 결합을 끊는 데 더 높은 에너지가 필요하기 때문에 연료도 종종 14, 28, 44 및 84 Da의 중성 손실을 나타냅니다. (그림 5B), 교차 고리 절단을 나타내는 추가 플로로글루시놀 또는 물 모이어티와의 조합. 두 유형의 절단을 나타내는 화합물은 fucophlorethols일 가능성이 가장 높습니다(그림 5A, B)[48]. 반면에 푸할롤은 이러한 화합물이 적어도 하나의 추가 수산기를 포함하는 클로로에틸 유사 배열을 갖기 때문에 구별하기가 약간 더 쉽습니다. 따라서, 주어진 중합도를 갖는 홀의 의사 분자 이온은 플로레틴 등가물에 비해 항상 16 Da 더 높은 m/z를 나타냅니다(그림 5C). 또한, 이러한 화합물의 MS/MS 스펙트럼은 테트라하이드록시 벤젠 및 플로로글루시놀과의 조합(예: m/z 265, 389, 513 등에서 [MH]-)에 해당하는 다중 생성물 이온 및/또는 중성 손실을 자주 나타냅니다. [92].
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