산화 스트레스, 기능 장애 에너지 대사 및 불안정한 신경 전달 물질은 4.0 MPa로 잠수하는 모의 헬리옥스 포화의 쥐 모델에서 대뇌 대사 프로필을 변경했습니다.

추상적인

현재 연구의 주요 목적은 빈 대조군과 비교하여 해수 400미터에 시뮬레이션된 헬리옥스 포화 잠수(HSD) 후 쥐의 뇌에서 대사 프로필 변화를 결정하는 것이었습니다. HSD로 인한 쥐 뇌의 극성 대사체의 변화는피질, 해마, 그리고선조체 조직피질에서 생화학적 검출과 결합된 NMR 기반 대사학 접근법을 적용하여 샘플. 그만큼글루타티온 및 타우린 수치 감소가정적으로항산화 방어력 강화포화 잠수 중말론디알데히드 수치 증가,슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 감소, 그리고글루타티온 퍼옥시다제 감소피질에서. 호기성 및 혐기성 대사 경로의 수반되는 감소는 대뇌 피질 조직에서 대사 효소 Na-K ATPase 및 LDH의 생화학적 정량화에 의해 입증된 하향 조절된 에너지 대사를 포함합니다. 그만큼아미노산 신경 전달 물질의 중요한 대사 이상GABA, 글리신, 아스파르테이트와 같은 방향족 아미노산 감소티로신그리고 페닐알라닌은 둘 다에 관여합니다.도파민의 대사및 노르아드레날린은 피질에서 하향 조절됩니다. 특히, N-아세틸 아스파르테이트의 감소는 신경 손상과 관련이 있습니다. 요약하면, 400msw HSD의 고압 감압은뇌 대사체쥐 모델에서 잠재적으로 광범위한 방해 아미노산 항상성, 산화 스트레스 및 에너지 대사와 관련된 대사 산물 및 불안정한 신경 전달 물질 구성 요소를 포함합니다. 이것들교란에 기여할 수 있습니다신경화학그리고HSD의 신경학적 표현형.

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소개

1.3MPa 이상의 고압(약 120-미터 해수에서)은 중추 신경계(CNS) 변화의 위험이 있는 인간과 포유류에서 유도됩니다[1, 2]. CNS는 과도한 기압, 체내 기포, 심해 잠수로 인한 감압병(DCS)에서 가장 민감한 대상 중 하나일 수 있습니다. 이러한 조건에서 일련의 정신 운동 및 인지 징후는 원위부 및 근위부 떨림, 뇌파 이상, 다발성 근경련, 수면 장애, 메스꺼움, 두통, 현기증 및 인지 테스트 성능 저하와 함께 매우 복잡합니다[2-4]. Moenet al. 확산 및 관류 강조 자기공명영상(MRI)으로 국소 신경학적 이상을 측정했습니다. 동맥 미세색전이 있는 대뇌 미세혈관 기능의 관류 결핍은 북해 잠수부에서 발견되었으며 미세혈관 또는 모세혈관 시스템의 복잡성 감소로 인한 평균 전환 시간 감소로 입증되었습니다. Alvhild Alette Bjørkum 외. 예를 들어 시냅스 소포에서 단백질 항상성을 방해하고 쥐 모델에서 헬리옥스 포화 다이빙 후 불안정한 세포 골격 구성 요소를 발견했습니다. 그러나 Arvid Hope et al. 헬리옥스 포화 감압 후 감압병의 대규모 신경학적 증상이 있는 쥐에서 MRI 스캔에서 형태학적 변화의 가시적인 CNS 손상이 관찰되지 않았다고 보고했습니다[6]. 따라서 우리는 heliox 포화 다이빙 후 CNS 조직에서 중요하지만 모호한 생리적 이상 뒤에 잠재적인 분자 프로필 변경이 관찰될 수 있다고 가정합니다.

세포 생리학적 메커니즘의 상태를 모니터링하기 위한 바이오마커의 식별은 생화학적 사건을 이해하는 데 중요합니다. 특정 순간이나 조건에서 다양한 요인에 대한 생물학적 시스템의 반응과 관련된 분자 경로의 복잡성과 다양성을 고려하면 항상 어려운 과제입니다. 기능적 CNS 섭동과 개별 바이오마커를 연결하는 이전의 시도는 산화적 손상 및 에너지 대사 후포화 다이빙에 대한 통찰력을 제공했습니다[3, 4, 7]. 마찬가지로 여러 연구에서 고압 신경 증후군이 있는 쥐의 아미노산 신경 전달 물질 프로필을 건강한 사람의 프로필과 비교했습니다[2]. CNS 여가의 신경학적 대사 지문을 설명하면 병인론적 가설[8, 9], 예방[10] 및 치료적 접근[11]을 선호할 수 있습니다. 그러나 헬리옥스 포화 다이빙의 깊은 깊이에 의해 유도된 통합된 신경학적 대사 섭동은 조사되지 않았습니다. 복잡한 생물학적 시스템에서 출력되는 이러한 정보는 기술적 수단의 발전으로 인해 빠르게 기록될 수 있습니다[12]. 고해상도 핵 자기 공명(NMR) 분광법을 적용하면 매우 복잡하지만 해석 가능하고 강력한 대사 프로파일링 데이터를 극도로 제공할 수 있습니다. 생리학적 또는 병리학적 상태 정보를 나타내기 위해 생체액 및 조직 대사 산물 추출물의 스펙트럼 데이터를 화학적 및 생물정보학적 방법으로 얻을 수 있습니다. NMR 분광법은 생물학적 샘플에 존재하는 약 102개의 서로 다른 작은 분자에 대한 즉각적인 정성적 및 정량적 정보를 제공합니다. NMR 검출은 특정 생화학적 경로를 선험적으로 선택하지 않고도 편향되지 않은 광범위한 접근 방식을 가능하게 합니다. 또한 NMR은 높은 처리량 분석과 높은 재현성을 허용하며 농도 내에서 NMR 신호의 선형 응답으로 인해 넓은 동적 범위에 걸쳐 본질적으로 정량적인 기술입니다. 이 기술은 전임상 및 임상 연구 모두에서 소뇌 운동 실조[13], 헌팅턴병[14, 15], 알츠하이머병[16, 17]과 같은 신경계 질환에 성공적으로 적용되었습니다.

NMR 기반 대사체학의 유망한 적용 가능성에도 불구하고 헬리옥스 포화 다이빙의 중추 신경 대사 섭동 효과 평가에 대한 적용은 보고되지 않았습니다. 본 연구의 목적은 400미터의 해수(MSW) 헬리옥스 포화 다이빙을 시뮬레이션한 후 쥐 모델에서 뇌의 다양한 해부학적 구획(피질, 해마 및 선조체)의 대사 변화와 피질의 생화학적 지수 수준 변화를 조사하는 것이었습니다. , 그림 1의 현재 연구의 도식적 실험 설계에서 볼 수 있듯이 표적 장기의 대사 지문에 대한 설명은 잠수 절차의 개선에 기여할 수 있는 일련의 이용 가능한 바이오마커를 제공할 수 있습니다.

그림 1. 본 연구의 개략적인 실험 설계

실험 절차

우리는 윤리적 출판과 관련된 문제에 대한 저널의 입장을 읽었으며 이 보고서가 해당 지침과 일치함을 확인합니다.

시약 및 재료 분석용 염화나트륨, DMSO, NaN3, NaH2PO4•2H2O 및 Na2HPO4•12H2O는 Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. HPLC 등급 CHCl3 및 CH3OH는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. Sigma–Aldrich에서 화학적 이동 참조를 위한 내부 표준으로 3-(trimethyl-silyl) propionate-2, 2, 3, 3, d4(TSP) 나트륨을 포함하는 D2O(D에서 99.9%)를 제공했습니다. (미주리, 미국). pH 7.4에서 D2O에 0.2M Na2HPO4/NaH2PO4를 포함하는 완충 시스템을 준비하여 다양한 농도에서 대사물의 화학적 이동에 대한 pH 효과를 방지했습니다. 나트륨-칼륨 ATPase(Na-K-ATPase), 콜린에스테라아제(AChE) 및 젖산 탈수소효소(LDH) 측정을 위한 분석 키트는 Abcam(USA)에서 구입했습니다. 도파민(DA) 분석 키트는 미국 RD에서 구입했고, 에피네프린(E) 및 노르에피네프린(NE) 분석 키트는 대만 Abnova에서, 5-하이드록시트립타민(5HT) 분석 키트는 BioSource에서, 감마-아미노부티르산(GABA) 분석 키트는 미국 Santa Cruz에서 구입했습니다. SOD(superoxide dismutase), MDA(malondialdehyde) 및 GPx(glutathione peroxidase) 분석 키트는 미국 Cayman에서 구입했습니다.

윤리 승인

모든 실험 프로토콜은 해군 의과대학 해군 의료 센터 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: SYXK(Shanghai)2017-0019, 승인 연도: 2020). 모든 동물은 해군 의과 대학의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 좋은 관리를 받았습니다. 모든 방법이 동물 실험 보고를 위한 ARRIVE 지침(https://arriveguidelines.org)에 따라 보고되었음을 확인합니다. 이 연구에서 조사된 참가자는 인간이 아닌 쥐였습니다. 따라서 참여에 대한 동의가 없었습니다.

동물 및 그룹화 디자인

평균 연령이 8주이고 체중이 200~220g인 성체 수컷 Sprague–Dawley 쥐가 이 연구에 포함되었습니다. 동물은 Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 동물의 고통과 신뢰할 수 있는 데이터를 수집하는 데 필요한 동물의 수를 최소화하기 위해 최대한의 노력을 기울였습니다. 모든 동물에 대해 표준 래트 사료 및 음용수를 임의로 제공하였다. 우리당 3마리의 쥐가 있는 동물은 특정 병원균이 없는(SPF) 동물실(온도, 22–24˚C, 습도, 45–55%) 및 조절된 조명 조건(12/12시간 명암 주기)에 수용되었습니다. 실험 일주일 전. 다이빙 실험을 시작하기 전에 쥐를 고압 챔버를 포함한 실험실 환경에서 5일 동안 적응시켰다. 16마리의 쥐의 무게를 측정하고, 라벨을 붙이고, 무작위로 통제 그룹(CON 그룹, n=8으로 명명된 유사한 빛과 소음을 견디는 정상기압 공기에 노출)과 4.0MPa(400msw), HSD 그룹, n=8).

400msw의 자극 포화 잠수

HSD 그룹의 쥐는 고압 챔버에서 헬륨-산소 가스로 가압되었습니다. 요약하면 압축, 저장, 감압 및 굽힘 감시의 4단계가 포함되었습니다.

포화 기간. 쥐의 압박 속도는 20% He2O 가스 혼합물에서 1msw/min에서 10msw까지, 순수한 He에서 10msw에서 400msw까지 3.54msw/min이었습니다. 표면에서 400msw까지의 시간 압축에는 약 120분이 소요되었습니다. 400msw에서 바닥 단계는 120분이었습니다. 산소농도는 순수산소로 보충하여 압축과정과 저장깊이에서 산소분압을 35~50 kPa로 유지하였다. 감압 굽힘 관찰 시간은 300msw에서 40분, 200msw에서 45분, 105msw에서 50분, 45msw에서 60분, 10msw에서 75분, 3msw에서 75분, 수면에서 였다. 이 감압 모델에 사용된 상승 속도는 분당 약 10미터(33피트)입니다. 감압 단계에서 산소 분압은 38~67kPa로 유지되었다. 10m까지 감압 후 산소농도는 20~24%를 유지하였다. 포화 다이빙 타임 라인 개요는 그림 2에 나와 있습니다. 공기 제어 그룹 (제어 그룹으로 명명 된 그룹 CON, 8 마리의 쥐 포함)의 쥐는 HSD 그룹과 동일한 챔버가있는 동일한 실험 실험실의 대기 환경 내에서 사육되었습니다. 그룹. 대조군은 어떠한 압박이나 감압 절차도 받지 않았지만 HSD 집단과 유사한 소음과 빛을 견뎌냈습니다.

샘플 수집

감압 기간 후, 랫트를 펜토바르비탈 나트륨({0}}.3%, 1.0 ml/kg 랫트 체중)으로 복강 내로 마취시킨 후 뇌를 적출하였다. 왼쪽 대뇌 반구가 빠르게 해부되었습니다. 두 동물 그룹에서 피질, 해마 및 선조체 조직을 해부하고 각각 HSDC, HSDH, HSDS, CONC, CONH 및 CONS로 약칭했습니다. 세 구획 중 가장 큰 조직인 각 피질 샘플을 대략 동일한 무게로 두 조각으로 절단했습니다(대사체학 분석을 위한 샘플의 한 부분, 생화학적 평가를 위한 샘플의 다른 부분). 모든 조직은 액체 질소에서 급속 동결되었고 추가 분석이 있을 때까지 -80˚C에서 보관되었습니다.

더 요청:

이메일:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: 86 15292862950 추가