PART 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide는 쥐의 OVX 유도 골 손실과 RANKL 유도 파골세포 생성을 억제합니다
Mar 02, 2022
소개
골다공증(골량 감소, 비정상적인 골 조직 미세 구조, 뼈 취약성 증가 및 골절을 특징으로 하는 질병)(De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)은 현재 전 세계적으로 2억 명 이상의 사람들에게 영향을 미치며 상당한 의학적 및 현대 사회에 대한 사회경제적 부담(Strom et al., 2011). 골다공증의 임상 치료는 주로 호르몬 대체 요법, 비스포스포네이트 또는 데노수맙 요법에 중점을 둡니다. 이러한 방법은 효과적이지만 유방암 및 비정형 대퇴골 골절의 잠재적 위험과 같은 장기적인 부작용이 있습니다(Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). 따라서, 억제할 수 있을 뿐만 아니라 약물에 대한 연구가 시급하다.골다공증또한 바람직하지 않은 부작용이 적습니다.
시스탄체 데저티콜라(CD)는 중국에서 널리 사용되는 강장제 및 약용 식품으로 "사막 인삼"으로 알려져 있으며 즙이 많은 줄기를 말린 것입니다.C. 데저티콜라YC Ma(Gu, Yang, & Huang, 2016)는 다양하고 효과적인약리학적활동, 면역 조절, 항산화, 항염과 같은골다공증속성(Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). 골다공증 치료에 대한 CD의 활성 물질에 대한 이전 연구는 주로페닐에타노이드배당체(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). 그러나 CD에는 이리도이드, 리그난,다당류(Wang, Zhang, & Xie, 2012). 중국 전통 의학(TCM)의 임상 적용은 주로 물을 달이는 것입니다.다당류수용성 성분이며 TCM의 주요 약력학적 성분일 가능성이 가장 높습니다. 한의학에서 추출한 다당류는 항염 효과가 있는 것으로 널리 보고되었습니다.골다공증효과 및 임상에서 일반적으로 사용되는 몇 가지 바람직하지 않은 부작용(예: Epimedium brevicornum에서 추출한 다당류(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata(Zhang, Zhang, Zhang, Wang, Yan, 2018) 및 Morinda officinalis(Yan et al., 2019)). 따라서 우리는 다음과 같이 가정했습니다.시스탄체 데저티콜라다당류CD에서 추출한 (CDP)는 골다공증 치료에 잠재적으로 안전한 약물일 수 있습니다.
일반적으로 뼈 재흡수와 뼈 형성은 파골세포, 조골세포, 뼈 내막 세포 및 골세포를 포함한 여러 유형의 세포와 협력하여 뼈 리모델링 동안 동적 균형을 유지합니다(Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). 이 균형이 깨지면 다음과 같은 다양한 뼈 대사 질환이 발생할 수 있습니다.골다공증(Zhu et al., 2018) 및 골 경화증 (Ihde et al., 2011). 파골세포는 단핵/대식세포 계통에서 유래하는 말단 분화 세포로서 골흡수 기능을 갖는 유일한 세포이다(Teitelbaum, 2000). 파골세포 분화 및 성숙에 참여하는 두 가지 주요 사이토카인이 있습니다(Koga et al., 2004): 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) 및 핵 인자 κB(NF-κB) 리간드의 수용체 활성화제(RANKL). M-CSF는 조혈모세포의 파골세포 전구체로의 분화를 매개하고 RANK 수용체의 발현을 상향조절함으로써 파골세포의 분화를 촉진한다(Takayanagi, 2007). 파골세포 표면에 대한 RANKL 및 RANK의 결합은 다음을 초래한다: (1) TNF 수용체 관련 인자 6(TRAF6)과 같은 신호전달 어댑터 분자의 동원; (2) NF-κB 및 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK)를 포함한 다중 다운스트림 표적의 활성화; 및 (3) 활성화된 T 세포, 세포질 1(NFATc1)의 핵 인자 발현 수준의 상향 조절(Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). 이러한 신호 전달 경로의 활성화는 acid phosphatase 5(Acp5)[tartrate-resistant acid phosphatase(TRAcP)를 인코딩], matrix metalloproteinase 9(MMP9) 및 cathepsin K(CTSK)를 포함한 파골세포 유전자의 발현을 직접 조절합니다(Boyle, Simonet , & 레이시, 2003). 따라서, RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화와 관련된 신호전달 경로의 억제는 골다공증의 잠재적인 치료 방법이다.
이 연구에서 우리는 난소 절제술(OVX)에 의해 유도된 CDP 치료의 효과를 확인하는 것을 목표로 했습니다.골다공증생체 내 및 시험관 내 RANKL 유도 파골 세포 활성에 대한 마우스 모델, 파골 세포 특이적 유전자의 발현과 NFATc1 및 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로의 활성화에 중점을 둡니다. 우리의 발견은 골다공증 치료를 위한 안전하고 효과적인 약물로서 CDP의 잠재력에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
자세한 내용은 다음으로 문의하십시오.Joanna.jia@wecistanche.com
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2. 재료 및 방법
2.1. 화학 물질 및 시료 수집
CD(no. 180801)는 Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.(Anhui, China)에서 구입했으며, 중국 광저우에 있는 Guangzhou University of Chinese Medicine의 약학 대학의 Haibo Huang 교수가 확인했습니다. Estradiol valerate 정제는 Bayer(Leverkusen, North-Rhine-Westphalia, Germany)에서 구입했습니다. 알파 변형 최소 필수 배지
(-MEM) 및 태아 소 혈청(FBS)은 Gibco(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 입수했습니다. 페니실린/스트렙토마이신 및 TRAcP 염색 키트는 Solarbio(Beijing, China)에서 구입했습니다. 재조합 마우스 M-CSF 및 재조합 마우스 RANKL은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 조달했습니다. 수산화인회석 코팅 플레이트는 Corning Life Sciences(St. Lowell, MA, USA)에서 구입했습니다. NFATc1 및 CTSK에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK 및 P-JNK(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); 및 -액틴(CWBIO, Beijing, China)도 얻었다. 이 연구에 사용된 다른 시약은 분석 등급이었고 물은 Milli-Q 정수 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 정제되었습니다.
2.2. CDP 추출
CD를 미세한 분말로 분쇄하고 석유 에테르와 3번 혼합하여 이를 타파하였다. 고체 잔류물을 여과에 의해 수집한 다음, 실온에서 건조시켰다. 그만큼다당류전처리된 시료에서 2시간 동안 물로 3회 추출하고, 농축하고, 최종 농도가 80%(v/v)가 되도록 무수 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 4℃에서 24시간 동안 보관하였다. 침전물을 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 수집하고, 증류수에 용해하고, Sevag 방법(Zhao et al., 2019)을 사용하여 정제(유리 단백질 제거)했습니다. 회복된다당류투석하고, 건조하고, 더 사용할 때까지 보관했습니다. 또한, 화학적 조성 결과 CDP의 총 당, 우론산, 황산염 및 단백질 함량은 67.{1}}.98%, 21.{4}}.49%, 1.{7 }}.24퍼센트 및 8.{10}}.36퍼센트
CDP의 단당류 조성 및 푸리에 변환 적외선 분석은 보충 그림 1 및 2에 나와 있습니다.
2.3. OVX 유도 골다공증 마우스 모델
모든 동물 실험은 광저우 중의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다(SYXK 2019-0202 승인). 30{1}}주된 암컷 C57BL/6 마우스는 광저우 중의과대학 실험 동물 센터에서 제공했습니다. 1주일 동안 순응시킨 후, 한 그룹의 마우스는 가짜 수술(Sham 그룹)을 받았고 나머지 마우스는 난소 절제 수술(OVX 그룹)을 받았습니다. 수술 후 마우스는 1-주 동안 회복되었습니다. 그런 다음, 성공적으로 모델링된 마우스를 그룹당 6마리의 마우스로 무작위로 5개의 그룹으로 나누었습니다.
(1) 가짜 그룹: 증류수로 처리, (2) OVX 그룹: 증류수로 처리, (3) OVX E2 그룹(E2): 0.13 mg/kg 에스트라디올 발레레이트 정제로 처리, (4) ) OVX CDP 저용량군(CDP-L): 300mg/kg의 CDP로 처리, (5) OVX CDP 고용량군(CDP-H): 600mg/kg의 CDP로 처리. 증류수, E2 또는 CDP를 1일 1회 위관 영양법으로 투여했습니다. 모든 마우스는 12-주 처리 기간 후에 희생되었습니다(그림 1A). 자궁을 수집하고 무게를 잰 다음, 후속 검사를 위해 왼쪽 경골을 수집했습니다. 전혈 샘플을 수집하고 5000rpm에서 원심분리합니다.
4 ºC에서 15분 혈청 상층액을 흡인하여
추가 분석까지 -80 ºC.
2.4. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 분석 및 뼈 조직 형태 측정
왼쪽 경골을 4% 파라포름알데히드로 48시간 동안 고정한 다음 생리 식염수가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣었습니다. 고정 샘플은 다음 설정을 사용하여 Skyscan 1172 micro-CT 기기(Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgium)로 스캔했습니다. 전압, 8{7}} kV; 소스 전류, 100μA; 알루미늄, 0.5mm 필터; 픽셀
크기, 9.76μm; 및 회전 단계, 0.6◦. 의 여러 매개변수
골밀도(BMD), 골 용적률(BV/TV), 총 용적당 골 표면(BS/TV), 소주 수(Tb. N) 및 소주 간격(Tb. Sp)을 포함한 소주 골은 다음을 사용하여 측정되었습니다. CT-Analyser® 소프트웨어(Bruker micro-CT, Skyscan). CTVol 소프트웨어(Bruker micro-CT. Skyscan)를 사용하여 3차원 이미지를 생성했습니다.
마이크로 CT 분석 후, 왼쪽 경골을 14% EDTA 용액에서 석회화하고 절편을 위해 파라핀에 포매했습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 TRAcP 염색 실험 전에 마이크로톰을 사용하여 샘플을 5 μm 섹션으로 슬라이스했습니다. Olympus CX 31 현미경(Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan)을 사용하여 염색된 섹션을 검사하고 문서화했습니다.
시스탄체골밀도를 높이고 골다공증을 완화할 수 있습니다.
2.5. 혈청 분석
칼슘(Ca) 및 인(P) 농도는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute(Nanjing, China)에서 설계한 키트 지침에 따라 결정되었습니다. 혈청 내 TRAcP-5b 및 RANKL 수준은 각각 TRAcP-5b ELISA 키트(CUSABIO, 중국 우한) 및 RANKL ELISA 키트(Cloud-CloneCorp., 중국 우한)를 사용하여 분석되었습니다.
2.6. 시험관내 파골세포 생성 분석
BMM은 6-주된 암컷 C57BL/6 마우스의 경골과 대퇴골에서 분리되었습니다. 분리된 세포를 25ng/mL M-CSF, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 -MEM 배지에서 배양하였다. 합류에 도달하면 BMM(1 104개 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 접종하고 50ng/mL RANKL의 존재 하에 CDP로 처리했습니다. 배지 및 CDP는 2일마다 교체되었습니다. 7일 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 TRacP의 존재에 대해 염색하였다. 3개 이상의 핵을 갖는 TRAcP-양성 세포로 정의되는 파골세포의 수를 계산하고 광학 현미경을 사용하여 문서화했습니다.
2.7. 세포 증식 분석
BMM(1 × 104 cells/well)을 96-웰 플레이트에 파종하고 밤새 배양했습니다. 그 후, 세포를 48시간 동안 다양한 농도의 CDP(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40μg/mL)로 처리했습니다. 장기 실시간 동적 라이브 세포 이미징 시스템인 IncuCyte ZOOM®(Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA)을 사용하여 세포 합류를 감지하고 분석했습니다.
2.8. 수산화인회석 흡수 분석
BMM({0}} 세포/웰)을 수산화인회석으로 코팅된 플레이트에 파종하고 표시된 농도(0, 5 및 10 μg/mL)의 CDP로 처리하고 완전한 -MEM에서 배양했습니다. 25ng/mL M-CSF 및 50ng/mL RANKL 함유. 7일 후, 세포를 10% 표백제 용액으로 세척하여 세포 성분을 제거하였다. 수산화인회석 흡수 영역의 이미지는 IncuCyte ZOOM®을 사용하여 캡처하고 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석했습니다(Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. RNA 분리 및 실시간 역전사 정량적 PCR(RT-qPCR) 분석
BMM({0}} 세포/웰)을 6-웰 플레이트에 시딩하고 다양한 농도(0, 5, 10)에서 CDP의 존재 하에 RANKL 및 M-CSF로 자극했습니다. μg/mL) 5일 동안. 총 RNA는 TRIzol 시약(Sigma-Aldrich)을 사용하여 마우스의 세포 또는 뼈 조직에서 분리되었습니다. 역전사 효소 키트(TransGen Biotech, Beijing, China)를 사용하여 2μg의 총 RNA에서 상보적 DNA를 합성했습니다. RT-qPCR 반응은 PerfectStart™ Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)를 사용하여 준비되었고 ABI 7500 시스템(Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). PCR에 대한 사이클링 매개변수는 5분 동안 95℃, 15초 동안 95℃, 30초 동안 60℃의 40주기로 설정되었습니다. 사용된 특정 프라이머는 표 1과 같으며, 각 표적 유전자의 양은 GAPDH(내부 대조군)로 표준화하였다.
2.10. 웨스턴 블롯 분석
BMM({0}} 세포/웰)을 6-웰 플레이트에 접종했습니다. 단시간 실험을 위해 세포를 다양한 농도의 CDP({14}}, 5, 10 µg/mL)와 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션한 다음 50ng/mL RANKL로 30분 동안 처리했습니다. . 오랜 시간 동안 세포는 CDP(0, 5, 10μg/mL)가 있는 3일, 5일, 7일에 50ng/mL RANKL로 자극되었습니다. RIPA 용해 완충액(CWBIO)을 사용하여 총 단백질을 추출하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. 막을 5% 탈지유로 실온에서 2시간 동안 차단하고 1차 배양액과 함께 배양했습니다.
항체를 4 ºC에서 밤새도록 한 다음 해당하는 이차
1.5시간 동안 항체. 멤브레인은 ECL 시약(Millipore Corp., Billerica, MA, USA)을 사용하여 개발되었으며 이미지는 Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System(Tanon Science and Technology, Shanghai, China)을 사용하여 촬영되었습니다.
시스탄체골밀도를 높일 수 있습니다
2.11. 면역형광 검사를 이용한 NFATc1 전위 검출
BMM을 {{0}}웰 커버슬립에 파종하고 RANKL 및 M-CSF로 자극하고 5일 동안 10µg/mL CDP로 처리했습니다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고 PBS로 3회 세척하고 0.1% Triton X{8}}로 10분 동안 투과화했습니다. 세포를 10% 염소 혈청(CWBIO)과 혼합하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양한 다음, Alexa Fluor 488 염소 항마우스 2차 항체(Abcam, Cambridge, MA, USA)와 함께 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 커버슬립을 PBS로 세척하고 4', 6-디아미디노{18}}페닐 인돌(DAPI)(Solar)이 포함된 Prolong Gold Antifade Reagent에 장착하고,
Airyscan 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)이 있는 Zeiss LSM 800을 사용하여 검사했습니다.
2.12. 통계 분석
모든 실험 데이터는 SPSS 25.{1}} 통계 소프트웨어(IBM Corporation, Armonk, NY, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 동물 및 세포 연구에 대한 데이터는 각각 평균 ± SEM 및 평균 ± SD로 표시됩니다. 결과는 분산의 일원 분석 또는 스튜던트 t-검정을 사용합니다. p < 0.05의="" 값은="" 통계적으로="" 유의한="" 것으로="">
시스탄체줄일 수 있습니다세포자멸사그리고 뼈를 강화밀도
