파트 1: Cistanche 추출물은 새로운 돌연변이 DJ-1 형질감염 신경모세포종 세포 모델에서 과산화수소에 의해 유도된 신경 독성을 개선합니다
Mar 02, 2022
연락하다:joanna.jia@wecistanche.com
1. 소개
주요 신경 퇴행성 질환에는 다음이 포함됩니다.알츠하이머질병, 파킨슨병(PD), 헌팅턴병 및 기타. 이러한 장애 중 PD(파킨슨 병)는 세계 2위이며 60세 이상 인구에서 1~2%를 달성합니다(Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). PD의 주요 신경학적 특징으로 흑색질의 도파민성 뉴런은 진행성 퇴행성이며(Glizer & MacDonald, 2016), 이는 Lewy 소체(Zhang, An, Zhang, Pu , 2010). 파킨슨병의 발병기전에서 임상에서는 파킨슨병의 주요 증상으로 안정떨림, 강직, 운동완화, 자세이상을 진단하고 있다. 도파민성 뉴런의 정확한 진행성 퇴행 기전은 이해할 수 없지만 살충제, 신경독성 물질, 중금속 노출을 포함한 환경적 원인 또는 Parkin(Kitada et al., 1998), ‐synuclein(Polymeropoulos et al., 1998)의 돌연변이와 같은 유전적 원인이 있습니다. al., 1997) 및 DJ-1(Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003)은 PD의 발생을 유도하는 것으로 믿어집니다. 현재까지 DJ-1 유전자 돌연변이로 인한 미스센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이 및 대형 단편 결실의 수는 10개를 초과한다(Andres-Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). DJ-1 단백질 내에서 Leucine166Proline(L166P)의 치환이 중요합니다. 또한 산화 스트레스는 PD에서 발생하고(Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) 발병기전에 관여하는 것으로 나타났습니다(Hague et al., 2003).
24kb에 걸쳐 분포된 8개의 엑손을 포함하는 DJ-1 유전자는 인간의 염색체 1p36에 위치하며(Bonifati et al., 2003), 189개 아미노산을 포함하는 고도로 보존된 단백질을 인코딩합니다. ThiJ/PfpI 패밀리에 속하는 단백질은 동종이량체 형태로 존재합니다. 피질 내의 아교 세포와 흑질 및 선조체는 DJ-1 단백질 영역에서 주로 발견됩니다(Olzmann et al., 2007). 이 세포에서 DJ-1은 종양유전자(Nagakubo et al., 1997), 전사 조절(Kim et al., 2005; Niki, Takahashi-Niki, Taira, Iguchi-Ariga, & Agria, 2003)과 같은 역할을 합니다. ), 항산화 스트레스(Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), 샤프롱(Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006) 및 프로테아제 (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees, & Wood, 2003).
시스탄체중국 전통 의학이며 주로 시대를 따라 남성과 질환을 치료하는 데 사용되었습니다. 의 주요 활성 성분시스탄체acteoside, echinacoside 등 34가지 화합물을 포함하는 phenyl glycosides이다.시탕슈 추출물성 기능 개선, 노화 방지, 학습 및 기억 능력 증가, 신경 보호, 면역 조절, 항피로, 항허혈 및 간 보호를 포함합니다(Tu et al., 2011). 카페인산은 Cistanche의 주요 대사 산물 중 하나입니다(Yan, 2018).
일반적으로 사용되는 PD의 세포 모델에는 1-메틸-4-페닐 피리디늄 이온 유도 PC12 세포(Abou-Sleiman et al., 2003)와 과산화수소(H2O2) 유도 신경모세포종(SH-SY5Y) 세포(Zhang et al. ., 2009). 그러나 PD의 전형적인 병리학 적 특징은 이러한 모델에 존재하지 않습니다. 보다 생리학적으로 관련된 PD의 세포 모델을 개발하기 위해, 이 연구에서 우리는 H2O2 유도 L166P 및 C106S DJ-1-형질감염 SH-SY5Y 세포를 설정하고시탕슈 추출물및 악테오사이드, 에키나코사이드, 카페산 및Cistanche 총 배당체이 두 모델에서 처음으로.
Cistanche 추출물 항 신경 퇴행성 질환
2. 재료 및 방법
2.1|플라스미드, 약물, 화학 물질 및 세포
FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 플라스미드 및 항-DJ-1 다클론항체는 홋카이도 대학 약학대학원 Dr. Hiroyoshi Ariga가 친절하게 제공했습니다. 탈수 최소 필수 배지(MEM) 및 F-12 배지는 Gibco에서 구입했습니다. 리포펙틴은 Invitrogen의 제품이었습니다. FastDigest Xho I 및 FastDigest EcoR I은 Fermentas에서 왔습니다. 엔도톡신이 없는 플라스미드 준비 키트는 생명공학의 제품이었습니다. SH-SY5Y 세포주는 중국 의학 아카데미의 세포 은행에서 가져온 것입니다. BCA 단백질 분석 시약 키트는 Pierce에서 구입했습니다. PVDF 멤브레인은 Millipore에서 구입했습니다. Anti-FLAG 다클론 항체는 GeneTex의 제품이었습니다.시탕슈 추출물, 악테오사이드, 에키나코사이드, 카페산 및 Cistanche 총 배당체를 포함하여 북경대학교 약학대학 천연의학과에서 공급했습니다.
2.2|플라스미드 증폭, 추출 및 정제
Escherichia coli JM109 세포를 LB 액체 배지에서 OD{1}}.5까지 배양한 후, 염화칼슘 방법을 사용하여 적격 세포를 제조했습니다. 그런 다음 열 충격법을 사용하여 적격 E. coli를 플라스미드 DNA로 형질전환시킨 후, 형질전환체를 암피실린이 포함된 LB 플레이트에서 37도에서 16-24시간 동안 배양하였다. 성공적으로 형질전환된 단일클론 콜로니를 선택하고 50ug/mL 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 37도에서 추가로 12시간 동안 배양하였다. 플라스미드는 제조업체의 지침에 따라 내독소가 없는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 추출 및 정제되었습니다.
2.3|플라스미드 식별
추출된 플라스미드를 효소 분해한 후 플라스미드와 분해된 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 검사했습니다. 생성된 겔을 실온에서 20-25분 동안 EB 용액에 염색하고 사진을 찍었다.
2.4|SH-SY5Y 세포로의 플라스미드 형질감염
정제된 플라스미드 DNA를 10% 소태아혈청을 함유하는 MEM/F-12 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포에 형질감염시켰다. 그런 다음 형질감염된 세포를 400ug/mL G418을 함유하는 배지에서 선택하고, 그 후 200ug/mL G418을 사용하여 안정적으로 형질감염된 세포주를 유지하였다.
2.5|Western blot에 의한 형질감염된 세포의 식별
형질감염된 SH-SY5Y 세포를 RIPA 완충액에서 용해시켰다. 용해물의 원심분리 후, 상청액의 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 결정되었습니다. 그런 다음 동일한 양의 단백질 추출물을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. PVDF 막을 TBST 용액에 5% 무지방 분유로 차단하고 면역 검출을 위해 처리했습니다. Anti-FLAG와 anti-DJ-1을 1차 항체로 사용하였고, HRP-conjugated IgG를 2차 항체로 사용하였다. 표적 단백질을 검출하기 위해 향상된 화학발광 검출 시스템이 적용되었습니다.
2.6|형질감염된 세포의 면역세포화학적 식별
형질감염된 SH-SY5Y 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하고 0.3% Triton X-100 용액으로 투과화하고 10% 염소 혈청으로 차단했습니다. 그런 다음 차단된 세포를 먼저 항-FLAG 및 항-DJ-1 다클론 항체와 함께 배양한 다음 FITC가 결합된 염소 항토끼 이차 항체와 함께 배양했습니다. 세포핵은 Hoechst 33342로 염색하고 도립형광현미경(IX-71, Olympus)으로 세포를 관찰하였다.
2.7| 세포 생존력 분석
형질감염되지 않은 SH-SY5Y 세포를 악테오시드, 에키나코시드, 카페산 및 Cistanche 총 배당체(각각 모두 10, 20 및 40ug/mL)를 포함한 96개 추출물에 첨가하고 세포를 0.2mM H2O2로 추가 1시간 동안 처리하기 전에 6시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 버리고 세포 생존력을 위에서 설명한 대로 MTT를 사용하여 분석했습니다.
2.8|Cistanche 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향
acteoside, echinacoside, caffeic acid 및 Cistanche total glycosides(각각 1{4}}, 20 및 40ug/mL 모두)를 포함한 추출물을 첨가하고 0.2mM H2O2로 처리하기 전에 세포를 6시간 동안 배양했습니다. 추가 1시간 동안 배지를 버리고 세포 생존력을 위에서 설명한 대로 MTT를 사용하여 분석했습니다.
2.9|통계 분석
데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. 그룹 간의 차이는 SPSS 22.{1}} 소프트웨어와 함께 일원 분산 분석 및 LSD 방법을 사용하여 분석되었습니다. p < 0.05의="" 값은="" 유의미한="" 것으로="">
시스탄체목초
3|결과
3.1|플라스미드는 성공적으로 형질전환되고 정제되었습니다. E. coli JM1{9}}9에서 별도의 발현 후 플라스미드를 추출하고 제한 효소로 소화한 후 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 검사했습니다(그림 1). 6.2kb 플라스미드를 5.4kb 및 0.8kb 선형 DNA 단편으로 절단하여 L166P 및 C106S DJ-1 플라스미드가 모두 성공적으로 발현되고 정제되었음을 확인했습니다.
3.2|웨스턴 블로팅에 의한 형질감염된 세포의 식별. 그림 2와 같이 약 70kDa에서 FLAG-L166P DJ-1 및 FLAG-C106S DJ-1 밴드를 감지했습니다. 형질감염된 SH-SY5Y 세포에서 높은 수준의 FLAG-태그된 단백질은 L166P 및 C106S DJ-1 돌연변이체가 각각의 형질감염체에서 강하게 발현되었음을 나타낸다.
3.3|형질감염된 세포의 면역세포화학적 식별. anti-DJ-1 또는 anti-FLAG 항체와 함께 배양 후 형질감염된 SH-SY5Y 세포에서 강한 형광 신호를 보여줍니다. 이것은 형질감염체에서 발현되는 L166P 및 C106S DJ-1의 높은 수준을 확인시켜줍니다.
3.4|형질감염된 세포는 형질감염되지 않은 세포보다 H2O2에 더 민감하였다. 단계적 농도의 H2O2(0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5 및 1mM), L166P 또는 C106S DJ-1로 형질감염된 SH-SY5Y 세포의 생존율은 형질감염되지 않은 세포에 비해 용량 의존적으로 감소하였다.
3.5|Cistanche 추출물은 H2O2 유도 감소 SH-SY5Y 세포 생존율을 용량 의존적으로 억제했습니다.시탕슈 추출물, acteoside, echinacoside, caffeic acid 및 Cistanche 총 배당체를 포함합니다(각각 10, 20 및 40 ug/mL).
시스탄체
