파트 1: Cistanche Tubulosa 페닐에타노이드 배당체는 간세포 암종 세포의 세포자멸사를 유도하고 항종양 효과를 향상시킵니다
Mar 25, 2022
연락처: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1 및 Jinyao Li, PhD1
추상적인
시스탄체 튜불로스한약재의 일종으로 다양한 생물학적 기능을 발휘한다. 이전 연구에서 입증되었습니다.Cistanche tubulosa 페닐에타노이드 배당체(CTPG)는 다양한 종양 세포에 대한 항종양 효과를 나타냅니다. 그러나 HepG2 및 BEL{1}} 간세포 암종(HCC) 세포에 대한 CTPG의 항종양 효과는 여전히 파악하기 어렵습니다. 우리 연구는 CTPG가 p38, JNK의 상향 조절된 인산화를 특징으로 하는 MAPK 경로의 활성화와 관련된 세포 주기 정지 및 세포 사멸의 유도를 통해 HepG2 및 BEL{3}} 세포의 성장을 유의하게 억제한다는 것을 보여주었습니다. 및 미토콘드리아 막 전위의 감소를 특징으로 하는 ERK1/2 및 미토콘드리아 의존성 경로. CTPG 처리에 의해 시토크롬 c의 방출과 caspase-3, -7, -9 및 PARP의 절단이 연속적으로 증가했습니다. 또한 CTPG는 기질 메탈로프로테이나제{13}} 및 혈관 내피 성장 인자의 수준을 감소시켜 HepG2의 이동을 유의하게 억제했습니다. 흥미롭게도 CTPG는 비장세포의 증식을 증가시켰을 뿐만 아니라 시스플라틴에 의해 유도된 비장세포의 세포자멸사를 감소시켰습니다. H22 종양 마우스 모델에서 시스플라틴과 결합된 CTPG는 H22 세포의 성장을 추가로 억제하고 시스플라틴의 부작용을 감소시켰습니다. 종합해보면 CTPG는 직접적인 항종양 효과와 간접적인 면역 증강 효과를 통해 간세포암종의 성장을 억제하고 시스플라틴의 항종양 효능을 향상시켰다.
KeywordsCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides, apoptosis, MAPK pathway, mitochondria-dependent pathway, cisplatin, immunoenhancement
Cistanche는 항종양 효과가 있습니다.
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소개
간암은 2018년에 전 세계적으로 6번째로 많이 진단되는 암이자 4번째 주요 암 사망 원인이 될 것으로 예측되었으며, 동남아시아(몽골, 캄보디아, 베트남)에서는 매년 약 841 000명의 새로운 사례와 782,000명이 사망합니다. .1 중국에서 간암은 2015년에 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이었습니다.2 전 세계적으로 원발성 간암의 90% 이상이 간세포 암종(HCC)입니다. 현재 간세포암종의 치료에는 간절제술, 간 이식술, 경피적 절제술이 주요 방법이다. 불행히도, 이러한 치료법은 조기 간암으로 진단된 환자의 30%에 효과적이지만 진행성 간암으로 진단된 환자(40% 차지)는 생존 기간을 연장하기 위해 완화 치료에 의존해야 합니다.3,4 동맥 화학색전증은 아시아 태평양 지역에서 대부분의 진행성 간세포암종 환자에게 중요하고 일반적인 완화 요법입니다.5 2006년 진행성 간암 치료제로 FDA 승인을 받은 소라페닙은 종양 세포 증식과 혈관을 억제하는 다중 키나제 억제제입니다. 생성하고 종양 세포의 세포 사멸을 촉진합니다. 소라페닙은 환자의 생존기간을 3~5개월 연장하지만 부작용이 심각하고 약물 내성 발생과 밀접한 관련이 있다.6 따라서 간세포암종에 대한 신약이나 전략 개발이 시급하다.
한의학(TCM) 단독 또는 다른 전략과 함께 HCC를 치료하는 데 사용되어 왔으며 생존 시간 연장, 삶의 질 향상, 부작용 감소 등의 임상적 이점을 보여주었습니다.7,8시스탄체페닐에타노이드 배당체(PhG), 이리도이드, 리그닌 및 항산화, 항염, 노화 방지, 기억력 향상 및 면역 향상 기능과 같은 다양한 생물학적 기능을 갖는 다당류를 함유하는 한의학입니다.9 PhGs는 다음과 같이 간주되었습니다. Cistanche의 주요 활성 성분은 항산화, 항염, 항세포자멸사, 간 보호 및 신경 보호를 포함한 여러 기능을 가지고 있습니다.10-12 우리 그룹은 다음과 같이 보고했습니다.시스탄체튜불로사 페닐에타노이드 배당체(CTPG)는 시험관 내 또는 생체 내에서 외인성 또는 내인성 신호 전달 경로를 통해 흑색종 B{0}}F10 세포, 식도 암종 Eca{2}} 세포 및 HCC H22 세포의 성장을 억제할 수 있습니다. 또한 CTPG는 면역자극 효과가 있었습니다.13-15
이 연구에서 우리는 시험관 내에서 HepG2 및 BEL{1}} 세포에 대한 CTPG의 항종양 효과와 기전을 조사하고, 시험관 내 및 생체 내에서 CTPG의 면역 조절 기능을 분석하고, CTPG와 화학 요법을 병용한 치료 효과를 추가로 평가했습니다. 생체 내 HCC H22 종양 마우스에 대한 약물 시스플라틴. 우리는 CTPG가 미토콘드리아 의존적 세포자멸사와 MAPK 신호전달 경로를 통해 HepG2 및 BEL{4}} 세포의 성장을 억제할 수 있음을 발견했습니다. CTPG는 기질 금속단백분해효소-2(MMP-2) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 수준을 감소시켜 HepG2 세포의 이동을 유의하게 억제했습니다. 또한, CTPG는 면역 세포의 증식 및 활성화를 촉진하고 마우스의 면역을 향상시켰다. 중요하게도, 시스플라틴과 결합된 CTPG는 생체 내에서 H22 세포의 성장을 추가로 억제할 수 있고 시스플라틴의 부작용을 감소시킬 수 있습니다.
Cistanche는 면역력을 향상시킵니다.
재료 및 방법
동물
약 6~8주령의 수컷 BALB/c, Kunming 마우스 및 암컷 C57BL/6 마우스를 Xinjiang Medical University의 Animal Laboratory Center(Urumqi, Xinjiang, China)에서 구입하여 Xinjiang University의 동물 시설에 실온에 보관했습니다. (RT) 25±3도, 12/12시간 명암 기간.
세포주 및 세포 배양
뮤린 H22 세포는 Procell Life Science & Technology Co., Ltd.(Wuhan, Hubei, China)에서 구입했으며 인간 HCC HepG2 및 BEL{2}} 세포는 Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering에서 구입했습니다. Xinjiang University(Urumqi, Xinjiang, China) 및 RPMI 1640 배지(Gibco, USA) 또는 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)(Gibco)에서 10% 열불활성화 소태아혈청(MRC, China), 1% L-배양 글루타민(100mM), 100U/mL 페니실린 및 100ug/mL 스트렙토마이신을 37도에서 5% CO2의 습한 분위기에서.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
CTPG(Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, China)의 주요 화합물은 이전에 보고된 대로 HPLC에 의해 적격 및 정량화되었습니다.13 ZORBAX SB-C18 컬럼(250x4.6mm; 5μm)을 사용했습니다 이동상은 0.2% 포름산 용액과 23%에서 31%까지의 구배를 갖는 메탄올로 구성되었습니다. 총 10μL 샘플을 주입하여 330nm에서 검출했습니다. echinacoside 및 acteoside 표준(중국 상하이 Yuanye)을 사용하여 CTPG의 성분을 분석했습니다.
에키나코사이드
세포 생존력 분석
CTPG가 HepG2 및 BEL{1}} 세포에 미치는 항종양 효과는 MTT(3-(4, 5-디메틸{5}}thiazolyl)-2, {{7 }}디페닐-2-H-테트라졸륨 브로마이드). HepG2 및 BEL{11}} 세포를 96-웰 플레이트(5 × 104 cells/well)에 플레이팅하고 0, 2{42}}0, 37도에서 24시간 배양 후 400 및 600 ug/mL CTPG를 각각 24시간 및 48시간 동안 처리했습니다. 약 35 ug/mL 시스플라틴(Yuanye)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 그런 다음 100 μL MTT(0.5mg/mL, FBS 배지가 없는 배지로 희석)를 각 웰에 첨가하고 37도 및 5% CO2에서 3시간 동안 배양했습니다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1200rpm에서 7분 동안 원심분리하고, 배지를 제거하고 200ug/mL DMSO를 각 웰에 첨가하여 형성된 포르마잔 결정을 용해시켰다. OD490 값은 {{35}웰 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)로 측정되었습니다. CTPG가 비장세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 C57BL/6 마우스에서 세포를 분리하고 1 × 105 cells/well의 밀도로 96-well plate에 도말했습니다. 비장세포는 각각 24시간, 48시간, 72시간 동안 0, 200, 400, 600 ug/mL로 처리하였다. 세포 생존율은 다음 공식으로 계산되었습니다: 세포 생존율(퍼센트)=(ODtreated/ODuntreated) × 100%.
기 감지{0}}
Ki{0}의 검출은 우리의 이전 연구에 따라 수행되었습니다.16 간단히 말해서, BEL{2}} 세포는 CTPG의 다른 농도(0, 200, 400 및 600ug/mL)로 처리되었습니다. 또는 시스플라틴(35ug/mL). 24시간 후, 세포를 수확하고 PBS로 세척한 다음, 제조사의 지침에 따라 Foxp3 Staining Buffer Set(eBioscience, USA)로 고정 및 투과화시켰다. 세포내 염색은 실온에서 15분 동안 FITC 접합된 Ki{10}} 항체(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 샘플을 유세포 분석법(BD FACSCalibur, CA, USA)으로 분석했습니다.
세포 사멸 및 세포 주기 분석
HepG2 및 BEL{1}} 세포를 2.5 x 105개 세포/접시 밀도로 시딩하고 37도에서 밤새 인큐베이션했습니다. 세포를 트립신 처리하고 다양한 농도의 CTPG로 처리한 후 원심분리에 의해 수확하거나 2시간 전에 카스파제 억제제(Z-VAD-FMK) 또는 카스파제{8}} 억제제(Ac-DEVD-CHO)(Beyotime, 중국)로 전처리했습니다. CTPG 치료. 24시간 후, 유세포분석에 의해 세포자멸사가 검출되었다. 간단히 말해서, 수집된 세포를 차가운 PBS(Gibco)로 세척하고 2.5μL Annexin V-FITC 및 5μL PI-PE Staining Solution(Solarbio, Beijing, China)이 포함된 annexin-binding buffer에 재현탁한 다음 세포를 실온에서 배양했습니다. 15분 동안 어둠 속에서. 세포주기 분포 분석을 위해 CTPG 처리 후 세포를 채취하여 4도에서 30분 동안 차가운 70% 에탄올에 고정하였다. 세포를 암실에서 30분 동안 PI(BD Biosciences)로 염색했습니다. 샘플을 유세포 분석기(BD FACSCalibur)로 분석했습니다. 세포 사멸 및 주기 관련 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다.
웨스턴 블롯
Western blot은 우리의 이전 연구에 따라 수행되었습니다.17HCC는 24시간 동안 CTPG로 치료되었습니다. 빙냉 PBS로 2회 세척한 후, 모든 부착 및 부유 세포를 수집하고 RIPA Lysis Buffer(Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)에서 2분 동안 얼음 위에서 용해시켰다.{9}} 12000rpm 4도에서 10분간 원심분리한 후 Bicinchoninic Acid Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 농도의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. PBST 완충액(0.05% 트윈이 포함된 PBS{11}})으로 세척한 후 막을 37도에서 1시간 동안 5% 무지방 우유로 차단한 다음 1차 항체(Cell Signaling Technology, MA, USA)와 함께 인큐베이션했습니다. 4도에서 하룻밤 적절한 희석. PBST로 3회 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체(eBioscience)와 함께 37도에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 단백질은 ECL 분석 키트(Beyotime)를 사용하여 검출되었습니다. 그레이스케일 스캐닝 데이터는 Image J에서 얻었습니다.
미토콘드리아 막 전위(Δψm) 분석
Δψm은 막 투과성 JC{1}} 염료(Beyotime)에 의해 결정되었습니다. 간단히 말해서, HepG2 및 BEL{3}} 세포를 24시간 동안 서로 다른 농도의 CTPG(0, 200, 400 및 600ug/mL)로 처리했습니다. 모든 세포를 수집하고 JC{9}} 세척 완충액으로 세척했습니다. 제조업체의 지침에 따라 실온에서 20분 동안 JC{10}} 형광 프로브로 세포를 염색했습니다. PBS로 두 번 세척한 후, 모든 샘플을 유세포 분석(BD FACSCalibur)으로 분석했습니다.
Hoechst 33342 염색
Hoechst 33342 염색은 우리의 이전 연구에 따라 수행되었습니다. 핵의 형태학적 변화는 막 투과성 DNA 결합 염료 Hoechst 33342(Beyotime)를 사용하여 조사되었습니다. 간단히 말해서, 세포를 2mL 배지에서 1 x 105개 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 접종했습니다. 70~80% 합류에 도달하면 200, 400 및 600ug/mL의 CTPG 또는 시스플라틴으로 세포를 24시간 동안 처리했습니다. 세포를 PBS로 세척하고 10분 동안 4도에서 4% 빙냉 파라포름알데히드로 고정시켰다. PBS로 세척한 후 세포를 Hoechst 33342로 4도에서 10분간 염색하였다. 샘플은 형광 도립 현미경(Nikon Eclipse Ti-E, Japan)으로 관찰하였다.
시스탄체 추출물
마이그레이션 분석
HCC 세포 이동은 상처 치유 분석을 통해 감지되었습니다. 간단히 말해서, HepG2 세포(2×104/웰)를 24-웰 플레이트에 접종했습니다. 8{16}}% 합류에 도달한 후 20μL 피펫 팁으로 각 웰의 중앙을 한 번 긁었습니다. PBS로 세척한 후 세포를 cisplatin(35ug/mL) 또는 다른 농도(0, 200, 400, 600ug/mL)의 CTPG로 37도에서 처리하였다. 24시간 후, 각 샘플의 이미지를 현미경(Nikon Eclipse Ti-E)으로 촬영하였다. 세포 이동의 평균 거리는 Image J에 의해 분석되었습니다. 상처 치유의 백분율은 다음 방정식으로 계산되었습니다. 상처 치유(%)=(표시된 시점의 1-스크래치 영역/0시간의 스크래치 영역)×100 퍼센트 . 세포 이동 관련 단백질 MMP{19}} 및 VEGF의 발현 수준은 웨스턴 블롯으로 검출되었습니다.
비장세포의 증식 및 세포자멸사
증식 분석을 위해 3마리의 C57BL/6 마우스로부터 비장세포를 분리하고 CFSE(eBioscience)로 염색하였다. CFSE 표지된 세포를 웰당 1mL 배지에서 2 × 106 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고 다양한 농도의 CTPG(200, 400 및 600ug/mL)로 처리하거나 35ug와 조합했습니다. /mL 시스플라틴을 72시간 동안. CD{12}}APC 및 CD{13}}PE(BD Biosciences)로 염색한 후 유세포 분석을 수행했습니다. 세포자멸사 분석을 위해 비장세포를 웰당 1mL 배지에서 2 × 106 세포 밀도로 {{14}웰 플레이트에 접종하고 다양한 농도의 CTPG(200, 400 및 600ug/mL)로 처리하거나 24시간 동안 시스플라틴. 2.5 μL Annexin V-FITC 및 5 μL PI-PE 용액으로 염색한 후 유세포 분석을 수행했습니다.
CTPG In Vivo의 안전성 평가 및 면역자극 활성
CTPG의 생체내 면역자극 활성을 평가하기 위해, 6-8주 수컷 Kunming 마우스를 무작위로 7개 그룹(5마리/그룹)으로 나누었다. 피하주사(sc, 200, 400 mg/kg), 복강내주사(ip, 200, 400 mg/kg), 위내투여(ig, 200, 400 mg/kg)를 2일마다 총 7회 투여하였다. , 대조군은 치료를 받지 않았습니다. 생쥐는 격일로 체중을 측정하고 생쥐의 상태를 매일 관찰했습니다. CTPG 처리 후, 마우스의 장기를 분리하고 무게를 쟀다. 장기 지수는 공식에 따라 계산되었습니다: 장기 지수=장기 중량(mg)/체중(g). 비장세포를 수집하고, 계수하고, 항-CD{14}}APC, 항-CD{16}}PE, 항-CD49b FITC 또는 항-CD{20}}APC, 항-CD{{ 22}}PE, 항CD{24}}FITC(BD Biosciences). 샘플은 유세포 분석법(BD FACSCalibur)에 의해 검출되었습니다.
H22 종양 보유 마우스에서 시스플라틴과 결합된 CTPG의 항종양 효능 약 6-8주령 수컷 BALB/c 마우스에 H22 세포를 피하 주사했습니다(100 μL PBS에서 마우스당 1.{7}} × 106). 종양 부피가 약 60mm3에 도달했을 때, 종양 보유 마우스를 무작위로 4개 그룹(6마리 마우스/그룹)으로 나누고 시스플라틴(4mg/kg), CTPG(400mg/kg), 시스플라틴(4mg/kg) + CTPG( 400mg/kg) 또는 무처리(대조군). 종양 마우스에 각각 5일, 7일, 9일, 11일 및 13일에 CTPG를 복강내 주사하였다. 시스플라틴은 7일과 11일에 정맥 주사되었습니다. 종양 부피 및 체중을 격일로 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산되었습니다. 종양 부피(V)=a × b2/2, 여기서 a와 b는 각각 버니어 캘리퍼스로 측정한 종양의 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 나타냅니다. 20일째에 장기와 종양을 분리하고 무게를 측정했습니다. 비장세포를 수집하고 계수하고 항-CD3-APC 및 항-CD{33}}PE 또는 항-CD4-FITC 및 항-CD{37}}APC 또는 항-CD11b-PE 및 항-Gr-1-APC 또는 항-CD4-FITC, 항-CD{46}}APC 및 항-Foxp{48}}PE(BD Biosciences) . 이어서, 유세포분석기(BD FACSCalibur)를 이용하여 세포의 빈도 및 수를 분석하였다.
Cistanche는 항종양 효과를 높이고 면역력을 향상시킵니다.
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통계 분석
모든 데이터는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 표현하였다. 통계 분석은 Prism5.{2}} 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. 피<.05 was="" considered="" statistically="">
