Part 1 Detection of Cistanches Herba (Rou Cong Rong) 종별 뉴클레오티드 시그니처를 사용한 의약품

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Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1 *, Zheng Zhang 1 * 및 Shi-lin Chen 3

1 중국 약초의 생리 활성 물질 및 자원 활용의 핵심 실험실, 교육부, 약용 식물 개발 연구소, 중국 의약 과학 아카데미 및 북경 연합 의약 대학, 베이징, 중국, 2 NHP 연구 동맹, 온타리오 생물 다양성 연구소 (BIO), 구엘프 대학, 구엘프, ON, 캐나다,

3 중국 의학의 식별 및 안전 평가를위한 베이징의 핵심 실험실, 중국 Materia Medica의 연구소, 중국 의학 아카데미, 베이징, 중국

Phenylethanoid Glycosides in cistanche (2)

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시스탄치 허바해독 특성을 가지고 있으며 아시아에서 일반적으로 사용되는 약용 식물입니다. 공급과 수요 사이의 불균형으로 인해 간통죄는 종종 이익을 위해 추가됩니다. 그러나 품질 관리 도구가 심하게 가공 된 제품을 식별하기에 충분하지 않기 때문에 규제 감독이 없습니다. 따라서, 뉴클레오티드 시그니처 및 종-특이적 프라이머에 기초한 신규한 분자 도구가 개발되었다. 251의 ITS2 지역시스탄치 허바및 간음한 샘플을 시퀀싱하였다. SNP 부위에 기초하여, 30∼37 bp 내의 네 개의 뉴클레오티드 서명과 여섯 종-특이적 프라이머가 개발되었고, 그들은 여섯 개의 상이한 종과 상이한 비율로 구성된 인공 실험 혼합물에 의해 검증되었다. 이 방법은 또한 검출 66에 적용되었다.시스탄치 허바추출물 및 중국 특허 의약품을 포함한 시장에 나와있는 제품. 결과는 혼합물에서 간통제를 확인하는 뉴클레오티드 서명의 유용성을 입증했다. 시장 조사에 따르면 36.4 %의 간통이 나타났습니다 : 19.7 %는 Cynomorium songaricum과의 간통 또는시스탄체시넨시스, 및 16.7%는 Cy로의 치환을 포함하였다. 노래리쿰, Ci. sinensis, 또는 Boschniakia rossica. 결과는 또한 Cy가 밝혀졌다. songaricum은 시장에서 가장 흔한 간음자였습니다. 따라서 우리는 간통을 조절하고 의약품 공급망, 특히 DNA가 분해 된 가공 제품의 품질 보증을 검증하기 위해 종 별 뉴클레오티드 서명을 사용하는 것이 좋습니다.

키워드: 시스탄치 허바, 중국 특허 의학, 뉴클레오티드 서명, 분해 된 DNA, 의학 품질 관리

소개

시스탄치 허바(Rou Cong Rong)은 아시아에서 잘 알려진 약전 기록 의약품입니다 (중국 약전위원회, 2015; 일본 약전 협약, 2016); 이 약은 말린 즙이 많은 줄기에서 파생됩니다.시스탄체 사막 니콜라Y. C. 마 또는Cistanche tubulosa강장제는 독성이 없으며 장기간 복용 할 수 있기 때문에 (Li et al., 2016). 더욱이시스탄치Herba는 특히 남성의 성기능 강화에 큰 의약 적 가치 때문에 "사막 인삼"으로 명명 된 영예를 안았습니다 (Zhang and Su, 2014; Gu et al., 2016). 중국 약전위원회 (2015) 및 기타 현지 공식 공표 표준 (Wang et al., 2012)에 기록 된 100 개 이상의 중국 특허 의약품이 있습니다. 노인의 인구가 증가함에 따라 상당한 수요가 있습니다.시스탄치 허바그리고 그것의 약용 제품. 그러나 원자재 자원은 점점 부족해지고 있습니다. 사실, 두 종의 원래 종시스탄치 허바중국 식물 레드 데이터 북에 국가 보호 야생 식물 (카테고리 II)로 추가되었습니다 (Fu, 1991). 시장에 나와있는 의약 재료는 주로 중국 북서부에서 재배됩니다.

의 공급과 수요 사이의 상당한 불균형으로 인해시스탄치헤르바, 많은 간음자들이 시장에 진입했습니다. 이러한 간통자는 표준과 일치하지 않으며 약물 보안을 위협 할 수 있습니다. 공지된 간통제는 Cynomorium songaricum Rupr의 건조된 즙이 많은 줄기를 포함한다. (시노모리 헤르바, 중국어로 수오 양),시스탄체sinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan, Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) 페치. et Flerov (Sun et al., 2012). 이 간음한 사람들은 다음과 비슷한 형태 학적 특성을 가지고 있습니다.시스탄치Herba는 전통적인 분류 식별을 어렵게 만들고, 특히 재료가 의약품으로 가공 된 후에 특히 그렇습니다. 현미경 식별은 다음과 같은 이유로 사용할 수 없습니다.시스탄치허바결정적이거나 독특한 현미경 적 특성이 없습니다. 현재의 분석 화학 도구는 유사한 화합물이 알려진 간음제 Ci 내에 존재하기 때문에 Cistanches Herba의 간통을 검출하기에 충분하지 않습니다. 살사 (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) 및 Ci. sinensis (Liu et al., 2013). 따라서 Cistanches Herba 및 그 제품의 인증을 위한 신속한 분자 방법의 개발은 중국 특허 의학 및 기타 의약품 산업에서 적절한 품질 관리 시스템을 위해 절실히 요구되고 있다.

Chen et al. 먼저 약용 식물을위한 보편적 인 바코드로서 내부 전사 된 스페이서 2 (ITS2)를 제안했습니다 (Chen et al., 2010). Sun et al. ITS2 영역을 식별하기 위한 바람직한 DNA 바코드로서 검증하였다.시스탄치Herba 및 그 간통자 (Sun et al., 2012). 그러나 ITS2는 중국 특허 의학과 분해 된 DNA를 구별하는 데 사용할 수 없습니다. 최근에, 점점 더 많은 연구가 "미니 바코드"가 분해된 DNA를 증폭시키는 유용한 방법임을 보여주었다 (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). 그러나, 뉴클레오티드 서명은 미니바코드보다 더 적절하며, 형성제는 한 종에 고유하고 DNA 프로브, 미세유체학 및 루프-매개 등온 증폭과 같은 많은 분자 기술에 의해 효과적으로 활용될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 지칭하기 때문이다(de Boer et al., 2015). Han et al. Panax 인삼, Angelica Sinensis 및 Lonicera japonica에 대한 뉴클레오티드 서명을 개발하고 관련 중국 특허 의약품을 성공적으로 확인했습니다 (Liu et al., 2016; 왕 외, 2016a; Gao et al., 2017).

함유 기능성 제품시스탄치헤르바. 구체적으로, 우리는 (1) 정통 분화를 위한 네 개의 뉴클레오티드 시그니처와 여섯 개의 특정 프라이머 쌍을 개발하였다.시스탄치Herba 및 알려진 간통제, (2) 정통 성분과 간음한 성분을 모두 포함하는 Cistanches Herba 제품을 준비하는 데 사용되는 알려진 분류 바우처의 혼합물을 포함한 실험에서 4 개의 뉴클레오티드 서명을 검증하고 (3) 66에 대한 시장 조사를 수행했습니다.시스탄치그들의 뉴클레오티드 서명을 통해 허브 제품.

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재료 및 방법

샘플 수집 및 준비

총 251 개의 샘플이 내몽골, 신장 및 닝샤에서 수집되었습니다. 이 샘플에는 214개가 포함되어 있습니다시스탄치 허바및 37명의 간통죄와 보충표 S1에 상세히 기재되어 있다. 해당 바우처 샘플은 분류학자들에 의해 검증되었고, 중국 베이징의 중국 의학 아카데미인 약용 식물 개발 연구소의 허바리움에 기탁되었다. 총 35 배치의 분말, 향신료 및 추출물시스탄치Herba는 베이징과 청두의 온라인 상점 및 벽돌 및 박격포 약국에서 구입했습니다 (표 1). 총 31 배치의 중국 특허 의약품 포함시스탄치허브아는 다른 약국에서 구입하였고(표 2), 다른 중국 특허 의약품의 선언된 조성물은 보충표 S3에 나타내었다. 상이한 용량 형태의 상이한 형태학적 특성이 도 1에 도시되어 있다.

혼합 샘플 : Ci의 분말.데저디콜라, 씨.튜불로사, 싸이. 노래리쿰, Ci. sinensis, B. rossica 및 O. coerulescens는 추출 전에 다른 조합 (1:1의 비율로)으로 인위적으로 혼합되었습니다. 이러한 혼합 샘플의 세부 사항은 그림 3의 범례에 나와 있습니다. 또한, 네 명의 간음한 자의 분말을 정품 Ci와 혼합했습니다. 다른 중량비의 사막니콜라: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 및 60000:1(표 3). 그리고 두 정품 제품은 같은 비율로 혼합됩니다.

달임: Ci의 조각. 사막 니콜라와 Cy. songaricum은 달인을 준비하기 위해 사용되었습니다. 슬라이스(10 g)를 300 mL의 이중 증류수에서 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 240분 동안 끓인 다음, DNA 추출에 사용하였다.

DNA 추출, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 및 시퀀싱

표본, 달임 및 혼합 샘플: 샘플(40– 50mg)을 30Hz의 주파수로 Retsch MM400 실험실 믹서 밀(Retsch Co., 독일)을 통해 미세 분말로 분쇄하였다. 게놈 DNA는 이후 제조업체의 지침에 따라 Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., China)로 추출되었습니다. ITS2는 범용 프라이머 2F/3R에 의해 증폭되었다(Chen et al., 2010).

배치 당 병렬로. 중국특허 약재 분말을 700 μL의 예비세척 완충액[100 mM Tris-HCl, pH 8.0]으로 세척하였다[20 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.0;

700 mM NaCl; 2% 폴리비닐피롤리돈(PVP)-40; 상등액이 맑고 무색이 될 때까지 0.4% β-mercaptoethanol]을 수차례 반복하고, 그 후 실온에서 5분 동안 7500 × g에서 원심분리하였다. 침전물은 이어서 제조자의 지시에 따라 Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.)를 통해 게놈 DNA를 추출하는데 사용되었다. 결국, 각 배치로부터의 DNA를 하나의 튜브로 농축하였다. 여섯 종-특이적 프라이머 쌍—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR 및 LDF/LDR은 프라이머 프리미어를 통해 설계되었습니다.

6.0 소프트웨어 (Premier Co., Canada)는 Cistanches Herba와 그 간통자를 증폭시킵니다 (자세한 내용은 표 4에 나와 있습니다). PCR은 1 μL의 1 μL를 함유하는 50 μL 부피 반응에서 수행되었다.

KOD FX (도요보 주식회사, 일본), 25 μL의 2 × PCR 완충액, 10 μL의 dNTPs (2 mM), 1.5 μL의 각 프라이머 (10 μM), 및 4 μL (∼50 ng)의 DNA 주형; 나머지 부피는 이중 증류수로 구성되었습니다. 반응은 다음에 의해 수행되었다.

열 사이클러 (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); 열 프로그램은 표 4에 열거되어 있다. PCR 산물을 3% 아가로스 겔 전기영동을 통해 검사하고, 생어 시퀀싱 방법에 따라 ABI 3730XL 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈사)를 이용한 양방향 시퀀싱을 위해 정제하였다. 이어서, 여섯 개의 프라이머의 감도를 CFX96 실시간 시스템(Bio-rad Lab., USA)을 사용한 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석을 통해 시험하였다. 주기 임계값은 "PCR 기준선 빼기 곡선 맞춤" 모델을 통해 시스템에 의해 자동으로 계산되었습니다. qRT-PCR은 7.5 μL의 SYBR(X)R Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)를 함유하는 15 μL-부피 반응에서 수행되었다.

(타카라바이오사제, 일본), 각 프라이머 1.0 μL(10 μM), 및 1.0 μL의 DNA 주형과 나머지 부피가 이중 증류수로 구성된다. qRT-PCR은 어떤 표준 오차가 계산되었는지에 기초하여 세 번의 기술적 반복실험으로 수행되었다.

서열 분석: 서열을 편집하고 CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA)를 통해 수동으로 조립하였다.

GenBank로부터의 ITS 서열은 ITS2 서열을 얻기 위해 히든 마르코프 모델 (HMM)을 통해 주석을 달았다 (Keller et al., 2009). 그런 다음 시퀀스를 "근육" 정렬 방법을 통해 MEGA 5.0 소프트웨어에 의해 정렬하였다(Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

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결과

Cistanches Herba 및 Adulterants에 대한 뉴클레오티드 서명 및 종 별 프라이머 쌍의 개발

251개의 샘플의 PCR 증폭 및 시퀀싱 성공률은 프라이머 쌍 2F/3R을 사용할 때 100%였다. Cy의 정렬된 길이입니다. songaricum ITS2 서열은 229 bp (보충 도면 S1)이었다. GenBank로부터 검색된 헤르바륨 종 및 밀접하게 관련된 종의 서열들의 서열의 분석(보충 표 S2)은 Cy에 대한 2개의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 부위를 밝혀냈다. 노래. SNPs에 기초하여, 하나의 Cy. 송가리쿰-특이적 30-bp 뉴클레오티드 시그니처 (5'-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3')가 개발되었다 (도 2A). NCBI의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 결과는 이 뉴클레오티드 시그니처가 Cy에 고유하다는 것을 입증하였다. 노래(표 5). 밀접하게 관련된 종의 서열에 대한 유사한 분석으로, Ci에서 하나 내지 두 개의 SNP가 발견되었다. sinensis, B. rossica, O. coerulescens. SNPs에 기초하여, Ci에 대한 34 bp 서명 (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga, ggatgcacgg ccgg-3')을 포함하여 다른 3 개의 간통자에 대한 뉴클레오티드 서명도 유사하게 개발되었다. Sinensis, B. rossica에 대한 37 bp 서명 (5'- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtctc-3') 및 O. coerulescens에 대한 31 bp 서명 (5'-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgtgg-3') (그림 2BD). NCBI에서의 BLAST 분석은 또한 이들 뉴클레오티드 시그니처가 특이적이며 다른 어떤 종에도 존재하지 않는다는 것을 밝혀냈다 (표 5).

시스탄치 허바그리고 그것의 간음은 2F / 3R 보편적 인 프라이머 쌍을 통해 혼합물로부터 동시에 증폭 될 수 있습니다. 따라서, 우리는 ITS2 서열을 정렬함으로써 뉴클레오티드 시그니처 증폭을 위한 종 특이적 프라이머를 설계하였다. 네 개의 특정 프라이머 쌍 - SYF1 / SYR1, CCRF / CCRR, SCRF / SCRR 및 LDF / LDR -은 Cy의 뉴클레오티드 서명을 증폭하도록 설계되었습니다. 노래리쿰, B. 로시카, Ci. sinensis 및 O. coerulescens는 각각 (표 4). 앰플리콘의 길이는 각각 123, 72, 131 및 71 bp였다.

또한, 실험용 시스탄치 허바 물질로부터 총 214개의 ITS2 서열을 분석하였다. 두 개의 짧은 특정 프라이머 - HMRCF / HMRCR 및 GHRCF / GHRCR for Ci. 사막 니콜라와 Ci. tubulosa는 각각-분해된 샘플의 짧은 영역을 증폭하도록 설계되었다(표 4). 앰플리콘의 길이는 각각 132 및 134 bp였다.

인공 혼합물 및 달임에 기초한 뉴클레오티드 서명 및 종 특이적 프라이머 방법의 검증

새로운 프라이머 쌍의 증폭 효율을 혼합물로부터 검증하였다. PCR 산물은 나타낸 바와 같이 각 표적 종에 대해 각 프라이머 쌍을 통해 수득되었다.

B. rossica 또는 O. coerulescens의 cq 값은 샘플의 비율이 30000:1 또는 40000:1이고, Ci의 증폭 결과라도 얻을 수 있었다. sinensis, Ci.튜불로사, 그리고 Ci deserticola는 비율이 20000 : 1 일 때 감지 될 수있었습니다. 그러나 Cy에 대해 검출 가능한 결과를 얻을 수 없었습니다. 그것이 20000 : 1의 비율을 구성했을 때 songaricum.

뉴클레오티드 서명 방법이 처리된 물질, Ci의 달임과 함께 기능하는지 여부를 검증하기 위해. 사막 니콜라와 Cy. 노래가 준비되었습니다. 그 결과, Ci에서 짧은 바코드가 있음을 알 수 있었다. deserticola는 샘플을 210 분 동안 끓인 후에도 증폭 될 수있었습니다. 또한, Cy의 뉴클레오티드 시그니처. 송가리쿰은 샘플을 150분 동안 끓인 후에 증폭될 수 있었지만, 샘플을 210분 또는 240분 동안 끓인 후에는 PCR 산물이 검출되지 않았다(그림 4). 시퀀싱 결과는 짧은 뉴클레오티드 서명이 달인으로부터 성공적으로 얻어졌다는 것을 입증하였다.

뉴클레오티드 서명 및 특정 프라이머를 통한 간통에 대한 시장 조사

상기 방법은시스탄치시장에 나와있는 허브 제품. 서른 다섯 배치의시스탄치허바 슬라이스, 분말 및 추출물을 여섯 개의 디자인된 특정 프라이머를 사용하여 증폭 및 서열화하였다(아가로스 겔 전기영동 결과는 보충도 S2에 도시되어 있고 서열은 보충 데이터 시트 1에 열거되어 있다). 뉴클레오티드 서명을 통한 서열의 분석은 다섯 개의 조각 배치가 진짜임을 밝혀냈다. 하나의 슬라이스 배치 및 하나의 분말 배치를 Cy로 치환하였다. 송가리쿰 및 하나의 추출물을 Ci로 치환하였다. sinensis. 다른 여섯 배치의 분말은 혼합물이었다: 다섯은 Cy로 간음되었다. 노래와 Ci. sinensis와 하나는 Cy로 간음되었습니다. 노래(표 1). 또한, 하나의 슬라이스 배치를 살비아 밀티오르리자로 치환하였다.

중국 특허 의약품의 Cistanches Herba는 인증을 어렵게 만드는 다양한 과정을 거칩니다. 중국 특허 의약품으로부터 종 특이적 뉴클레오티드 서명 영역을 증폭시키는 여섯 개의 프라이머 쌍의 능력을 시험하였다(아가로스 겔 전기영동 결과는 보충도 S2에 도시되어 있다). 대부분의 중국 특허 의약품에는 다양한 유형의 성분이 포함되어 있습니다. 예를 들어, Shihu Yeguang 알약 (ZCY34)에는 Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) 및 인삼 Radix et Rhizoma (Ren Shen)를 포함한 25 가지 성분이 포함되어 있습니다. 이러한 성분으로부터 Cistanches Herba는 프라이머 쌍 GHRCF / GHRCR을 통해 특별히 증폭 될 수 있습니다. PCR 산물의 직접 시퀀싱은 매우 깨끗한 흔적을 밝혀냈다. 그러나, 가시적 밴드는 프라이머 쌍 HMRCF/HMRCR로 수득될 수 없었다.

또 다른 예는 Kangguzhi Zengsheng 알약 (ZCY44)입니다. 이외에 여덟 가지 재료가 있습니다.시스탄치이 중국 특허 의약품의 허바는 GHRCF / GHRCR 또는 HMRCF / HMRCR에 의해 얻은 가시적 인 밴드가 없었기 때문에시스탄치 허바존재했다. 그러나, Cy의 간음 영역. 송가리쿰은 특정 프라이머 쌍 SYF1/SYR1에 의해 성공적으로 증폭되었다. 시퀀싱 결과는 Cy의 짧은 뉴클레오티드 시그니처를 입증하였다. 노래가 성공적으로 획득되었습니다.