갈렉틴-3은 시스플라틴에 의해 유발된 급성 세뇨관 괴사에서 항괴사 및 항아폽토시스 효과를 나타냅니다.

연락처: ali.ma@wecistanche.com

수하일 알-살라마 외

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추상적인

배경/목표:심각한신장부상(AKI)은 이환율, 사망률 및 의료 비용이 증가하는 공중 보건 부담입니다. 이는 만성 질환의 발병 위험 증가와 관련이 있습니다.신장질병과 죽음. 급성 세뇨관 괴사(ATN)는 AKI의 가장 흔한 원인입니다. Apoptosis와 조직 괴사는 ATN에서 중요한 역할을 합니다. 베타 갈락토사이드 결합 렉틴인 Galectin 3(GAL{1}})는 염증, 세포자멸사 및 산화 스트레스에 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 시스플라틴에 의해 유발된 급성 세뇨관 괴사에서 그 역할은 명확하게 밝혀지지 않았습니다.

행동 양식:수컷 C57B6-J 및 C57BL-6 -GAL-3 녹아웃 마우스를 사용하여 급성 세뇨관 괴사의 시스플라틴 마우스 모델을 사용하여 ATN을 유도했습니다. GAL-3 발현, apoptotic, necrotic, necroptotic protein in신장표준 조직학, 면역조직화학 및 효소 결합 면역흡착 분석 기술을 사용하여 측정되었습니다. 데이터는 평균 ± SE로 표시되었습니다. 통계적으로 유의한 차이(p<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

결과:GAL{0}}이 크게 증가했습니다.신장대조군 마우스와 비교했을 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스의 또한, ATN의 비율이 유의하게 더 높았고 혈장 요소 및 크레아티닌 농도가 더 높았으며 카텝신 B와 카텝신 D 농도가 더 높았습니다.신장시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스가 시스플라틴 처리된 GAL{3}} 야생 마우스보다 큽니다. 마찬가지로, 괴사 단백질 RIPK1, RIPK3 및 MLKL의 수준이 유의하게 더 높았습니다.신장시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스가 시스플라틴 처리된 GAL{3}} 야생 마우스보다 큽니다. 게다가 훨씬 더 높은 수준의신장프로-아폽토시스 단백질; 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{3}} KO 마우스에서 절단된 카스파제-3, 절단된 PARP, TRAIL 및 FAS.

결론:GAL{0}}은 시스플라틴에 의해 유발된 급성 세뇨관 괴사 동안 신세뇨관에서 괴사, 세포자멸 및 생존촉진 단백질과의 상호작용을 통해 세포 생존 및 사멸에 영향을 미칠 수 있습니다.

핵심어: 신장• 급성 세뇨관 괴사 • 시스플라틴 • 갈렉틴{0}} • 괴사 • 아폽토시스

소개

심각한신장상해(AKI)는 급격한 감소가 특징입니다.신장기능은 혈청 크레아티닌 수치의 상승, 소변량의 감소, 신대체 요법의 필요성 또는 이러한 요인의 조합을 기반으로 합니다[1].

그만큼신장AKI에 대한 질병 개선 글로벌 결과(KDIGO) 임상 실습 가이드라인은 AKI를 0.3 mg/dl(26.5 µmol/l 이상) 이상의 혈청 크레아티닌 증가로 정의합니다. 48 시간; 또는 이전 7일 이내에 발생한 것으로 알려져 있거나 추정되는 기준선의 1.5배 이상으로 혈청 크레아티닌의 증가; 또는 소변량<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

급성 세뇨관 괴사(ATN)는 AKI의 흔한 원인입니다[3]. 허혈성 및 신독성 문제는 ATN의 주요 원인입니다[3]. 세포 손상, 세포 사멸 및 재생을 포함하는 ATN에 대한 광범위한 연구에도 불구하고 기본 메커니즘은 명확하게 정의되지 않습니다.

아폽토시스는 카스파제에 의해 매개되는 프로그램된 세포 사멸의 한 형태입니다. 중요한 보고는 ATN에서 중요한 역할을 하는 세포자멸사를 보여주었습니다[3, 4]. 한편, 괴사는 초기 원형질막 투과성, 세포 소기관 팽창 및 세포 내용물의 붕괴를 특징으로 하는 세포 사멸의 한 형태이다[5]. 괴사는 세포가 과도한 외부 스트레스를 받을 때 자주 발생합니다. 괴사는 전통적으로 수동적이며 프로그램되지 않은 것으로 간주되었습니다. 따라서 인간 질병에 널리 퍼져 있음에도 불구하고 괴사의 기전을 조사하려는 노력은 거의 없었습니다[5]. 잘 알려진 괴사 유형은 괴사입니다[5]. Necroptosis는 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 많은 세포외 자극에 의해 유도되는 프로그램된 비-아폽토시스 세포 사멸입니다[5]. 이것은 원래 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1)의 동시 활성화와 함께 괴사성 세포 사멸 형태를 특징으로 하는 세포 사멸로 정의되었습니다. RIPK1은 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3)을 활성화하여 괴사라고 하는 복합체를 형성합니다[6]. 나중에 활성화된 RIPK3은 MLKL(mixed lineage kinase domain-like)을 인산화하고 활성화하는 능력을 얻습니다[6]. 인산화된 MLKL 분자는 올리고머를 형성하여 포스파티딜이노시톨 지질 및 카디오리핀에 대한 결합을 통해 세포막으로의 전위를 촉진할 수 있습니다. 전위된 MLKL 올리고머는 세포막에서 채널로 작용하여 나트륨 유입 및 칼륨 이온 유출[7] 또는 대안적으로 칼슘 이온 유입[8]을 유도합니다. 두 가지 방법 모두에서 이것은 원형질막 투과화 및 파열을 통한 괴사 세포 사멸을 초래하여 세포 내 내용물이 기관으로 유출되도록 합니다.

이 프로젝트에서는 시스플라틴(Cis)을 사용하여 급성 세뇨관 괴사를 유도했습니다. 시스는 광범위한 항종양 효과를 가지고 있으며 다양한 악성 종양을 치료하는데 사용되어 왔다[9]. 그럼에도 불구하고 신독성이 주요 부작용이며 신세뇨관 세포 괴사, 조직 손상, 신기능 장애, 급성 신세뇨병을 특징으로 한다.신장실패 [10]. 신장 손상을 극복하기 위해 취해진 다양한 조치에도 불구하고 거의 4-23%의 환자가 AKI에 의해 영향을 받습니다[11]. 시스플라틴에 의한 신손상의 기전으로는 세포자멸사, 산화스트레스, 신세뇨관 상피세포 및 신혈관의 직접적인 손상으로 인한 염증반응 등이 알려져 있다[12].

갈렉틴-3(GAL{1}}), 35kDa 단백질은 하나의 C-말단 탄수화물 인식 도메인(CRD)이 긴 N-말단 도메인(ND)에 연결된 독특한 키메라 유사 물질입니다[13 ].GAL-3은 세포 표면, 세포질, 세포 핵 및 세포외 기질에서 발견됩니다[13].

세포내 GAL{0}}은 세포 증식 및 항세포자멸사 메커니즘에 관여합니다[14, 15]. 이는 K-Ras 및 Akt 단백질에 영향을 미치므로 분화 생존 및 사멸도 조절합니다[14, 15]. 반면 세포외 GAL-3은 세포-세포 접착, 세포-기질 상호작용 및 신호전달, 염증 및 세포자멸사를 매개합니다[16].

GAL{0}}은 세포자살 자극에 노출된 후 세포질 또는 핵에서 미토콘드리아로 이동하고 미토콘드리아 막 전위의 변화를 차단하여 세포자멸사를 방지하는 것으로 나타났습니다[17]. 연구에 따르면 GAL-3은 AKT의 활성화를 통해 TNF 유도 세포자멸사를 억제할 수 있습니다[18]. 다른 연구에서는 GAL-3과 Beclin1이 프로그램된 세포 사멸, 세포자멸사 및 자가포식의 두 가지 조정된 경로에 관여하는 것으로 나타났습니다[18]. 이 프로젝트에서 우리는 GAL-3이 급성 세뇨관 손상에서 신세뇨관 상피에 보호 역할을 한다고 가정합니다. 우리는 급성 세뇨관 손상의 쥐 모델을 사용하여 신장 기능(혈장 요소 및 크레아티닌) 측정을 통해 시스플라틴 유도 급성 세뇨관 손상에서 GAL-3의 보호 역할을 조사했습니다.신장괴사 단백질(RIP-1, RIP{1}} 및 MLKL), 괴사 단백질(카텝신 D 및 카텝신 B), 세포자멸사 단백질(절단된 Caspase-3, 절단된 PARP, TRAIL 및 FAS) 표준 효소 결합 면역흡착 분석법, 생화학적 분석기, 조직학적 및 면역조직화학적 절차를 사용하여 세포 생존 마커(p-NF-κB, 베타-카테닌 및 Wnt).

재료 및 방법

우리는 급성의 마우스 실험 모델을 사용했습니다신장문헌에 광범위하게 기술되어 있고 급성 연구에 사용되는 부상신장전세계 실험실에서 부상 [19].

급성 세뇨관 괴사의 마우스 모델

무게가 25-30g인 C57BL/6 및 C57BL/6 –GAL-3 녹아웃(KO) 마우스를 사용했습니다. 마우스는 표준 식단으로 유지되었습니다. 쥐는 시스플라틴 투여 전 최소 1주일 동안 12-시간의 명암 일정에 따라 케이지당 5마리를 수용했습니다.

Cisplatin(EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, AUSTRIA)은 투여 당일 0.5 mg/ml의 농도로 새로 사용되었습니다. 마우스에 30mg/kg 체중의 시스플라틴[11] 또는 비히클(정상 식염수) 복강 내(IP)를 제공한 후 마우스는 다시 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 안락사 방법은 Ketamine(100mg/kg)과 Xylazine(10mg/kg)의 조합이 포함된 마취제를 복강 내 주사하는 것으로 시작하여 시스플라틴 투여 96시간 후 신장을 적출하고 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액은 EDTA vacutainer에 수집되었습니다.신장그런 다음 절제하고 얼음처럼 차가운 인산완충식염수(PBS)로 세척하고 각 신장의 절반을 즉시 액체 질소에서 동결한 다음 나중에 -80도 냉동고에 보관했습니다. 나머지 절반은 즉시 24시간 동안 10% 완충 식염수에 고정시켰다. 수집된 혈액을 15분 동안 3000RPM에서 원심분리하였다. 혈장을 수집하고 분취하고 추가 분석이 있을 때까지 -80도에서 보관했습니다.

단백질 추출을 위한 시료 처리

총 단백질은신장용해 완충액으로 균질화하고 원심분리 후 상층액을 수집하여 샘플을 추출합니다. 총 세포 용해물의 경우, 신장 샘플을 해동하고, 무게를 재고, 5{{20}}mM Tris, 300mM NaCl, 1mM을 포함하는 차가운 용해 완충액에 넣었습니다. MgCl2, 3mM EDTA, 2{39}}mM -glycerophosphate, 25mM NaF, 1% Triton X-100, 1{42}}% w/v 글리세롤 및 프로테아제 억제제 정제(Roche Complete 프로테아제 억제제 칵테일 정제). 신장은 균질화기(IKA T25 Ultra Turrax)에 의해 얼음 위에서 균질화되었다. 그런 다음 샘플을 4도에서 15분 동안 14{44}}00 RPM에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고 분취하고 추가 분석이 있을 때까지 -8{56}}도에서 보관했습니다. 핵 및 세포질 단백질 추출은 다른 곳에서 설명한 프로토콜에 따라 수행되었습니다[19]. 간단히 말해서, 신장 샘플을 얼음 위에서 해동하고 무게를 재고 Tris HCl 10mmol/l, CaCl{18}}mmol/l, MgCl{19}}mmol/l, EDTA 0.1mmol/l를 포함하는 완충액으로 얼음 위에서 균질화했습니다. , 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF) 0.5mmol/l, 수크로스 0.32mmol/l, 디티오트레이톨(DTT) 1mmol/l, Nonidet P-40(NP{28}}) 0.5% 및 프로테아제 억제제 칵테일 1%. 균질물을 800 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포질 분획으로 보관하였다. 펠렛을 NP{34}}가 없는 균질화 완충액으로 2회 세척하고 HEPES 20mmol/l, MgCl{36}}.5mmol/l, KCl 20mmol/l, EDTA 0.2mmol을 함유하는 저염 완충제로 재현탁했습니다. /엘. 글리세롤 25%, PMSF 0.5mmol/l 및 DTT 0.5mmol/l. 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션한 후 HEPES 20mmol/l, MgCl2 1.5mmol/l, KCl 800mmol/l, EDTA 0.2mmol/l를 포함하는 동일한 부피의 고염 완충제. 글리세롤 25%, PMSF 0.5mmol/l, DTT 0.5mmol/l, NP{58}}% 및 프로테아제 억제제 칵테일 1%를 첨가하고 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고 14000RPM에서 15분 동안 원심분리했습니다. 4도에서 분, 상층액을 핵분획으로 저장하였다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석법(Thermo Scientific Pierce BCA 단백질 분석 키트)에 의해 결정되었습니다.

조직학을 위한 시료 처리

신장을 절제하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 무게를 잰다. 각신장두 개의 반으로 나뉘고 각 반은 카세트로 10% 완충된 포르말린에 직접 고정되었습니다. 섹션을 증가하는 농도의 에탄올에서 탈수하고 크실렌으로 제거하고 파라핀으로 포매했습니다. 파라핀 블록에서 3μm 섹션을 준비하고 표준 절차를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 및 과요오드산 Schiff(PAS) 염색으로 염색했습니다[20]. 염색된 부분은 이 프로젝트에 참여한 조직병리학자가 평가했습니다.

면역조직화학

5μm 섹션을 자일렌으로 탈파라핀화하고 등급 알코올로 재수화했습니다. 그런 다음 섹션을 95oC의 수조에서 20분 동안 높은 pH(pH 9)의 검색 용액에 넣었습니다. 그런 다음 섹션을 5분 동안 증류수로 세척한 다음 TBST 완충액으로 5분 동안 세척했습니다. 그런 다음 섹션을 10분 동안 퍼옥시다제 차단으로 처리한 다음 10분 동안 단백질 차단으로 처리했습니다. 그런 다음 절편을 항절단된 카스파제{9}} 항체(Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), 항절단된 PARP 항체(Rabbit Polyclonal, 1: 100, Cell signaling technology, Danvers, MA, USA), 항-베타-카테닌 항체(Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), 항-포스포-NF-κB 항체(Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt{25}}(Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1(Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3(Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및 anti-MLKL 1(Rabbit monoclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . 1차 항체와 접합시킨 후, 섹션을 실온에서 20분 동안 2차 항체(EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA)와 함께 배양한 다음 DAB chromogen(EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) 및 대조염색은 헤마톡실린으로 수행되었습니다. 적절한 양성 대조군이 사용되었습니다. 음성 대조군의 경우 1차 항체를 섹션에 추가하지 않았습니다. 양성 및 음성 대조군은 염색된 슬라이드의 모든 배치에 사용되었습니다(그림에는 표시되지 않음).

면역형광 라벨링

5μm 섹션을 자일렌으로 탈파라핀화하고 등급 알코올로 재수화했습니다. 절편을 20분 동안 95도의 수조에서 높은 pH(pH 9)의 회수 용액에 넣었습니다. 그런 다음 섹션을 5분 동안 증류수로 세척한 다음 TBST 완충액으로 5분 동안 세척했습니다. 그런 다음 섹션을 항-GAL{7}} 항체(Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), 항-RIPK1(Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK{15}}(Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및 anti-MLKL 1(Rabbit monoclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 실온에서 밤새. 절편은 이후 당나귀 항토끼 Alexa Fluor 488(Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100) 항체와 함께 배양되었습니다. 마지막으로 섹션을 DAPI 수용성 장착 매체(Abcam, Cambridge, MA, USA)에 장착하고 Olympus 형광 현미경으로 관찰했습니다. 적절한 양성 대조군 섹션이 사용되었습니다. 음성 대조군의 경우 절편에 1차 항체를 첨가하지 않고 상기와 동일한 방법으로 전 과정을 진행하였다. 양성 및 음성 대조군은 염색된 슬라이드의 모든 배치에 사용되었습니다(그림에는 표시되지 않음).

형태 분석

급성 세뇨관 괴사의 형태학적 분석은 이 연구에 참여한 두 명의 연구자에 의해 수행되었습니다. 절단된 카스파제-3, 절단된 PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, 베타-카테닌, 신세뇨관 세포에서의 발현의 형태학적 분석은 ImageJ 소프트웨어(http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Cleaved caspase-3, cleaved PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt{12}}, Beta-Catenin, 라벨링은 무작위로 선택된 고배율에서 양성 세포의 수를 계산하여 결정되었습니다. 신장의 필드(HPF). 양성 세포의 평균 수는 HPF당에서 mm2당(각 mm{16}}HPF)으로 변환됩니다. cleaved caspase{17}}, cleaved PARP, RIPK1, RIPK3 및 Wnt{20}} 라벨링의 경우 세포가 고려되었습니다.

세포질 염색 패턴이 있을 때 양성입니다. MLKL 표지의 경우 세포는 막 및 세포질 염색 패턴이 있을 때 양성으로 간주되었습니다. phospho-NFK-B 및 Beta-Catenin의 경우 표지에 핵 염색 패턴이 있을 때 세포가 양성으로 간주되었습니다.

효소 면역 분석법

신장GAL{0}}, Cathepsin D, Cathepsin B, Cleaved caspase{1}}, TRAIL 및 FAS의 농도는 DuoSet 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 개발 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA를 사용하여 결정되었습니다. ) 샌드위치 ELISA의 경우 제조업체의 지침에 따른 표준 절차를 사용합니다. 제조사의 지침에 따라 표준 절차를 사용하여 샌드위치 Elisa에 대한 Cell 신호 기술 Elisa 키트(Danvers, MA, USA)를 사용하여 신장 절단 PARP 농도를 결정했습니다. 신장 RIPK1, RIPK3 및 MLKL 농도는 제조업체의 지침에 따른 표준 절차를 사용하여 샌드위치 Elisa용 MyBioSource(San Diego, CA, USA) Elisa 키트를 사용하여 결정되었습니다. 96-웰 플레이트 분광광도계(BioTek ELx800 마이크로플레이트 Elisa 판독기, Winooski, VT, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 판독했습니다. GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, cleaved caspase-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, 쪼개진 PARP 및 신장 샘플의 FAS 농도는 표준 곡선에서 보간하여 결정되었습니다. 수준은 총 단백질 농도로 정규화되었습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 Graph Pad Prism Software 버전 5를 사용하여 수행되었습니다. 다양한 그룹 간의 다중 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Newman Keuls 사후 다중 범위 테스트에 의해 달성되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 Student t-test에 의해 달성되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시됩니다. P 값 < 0.05는="" 유의미한="" 것으로="">

결과

시스플라틴 유발 급성 세뇨관 괴사

시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 그룹은 브러시 경계의 손실, 세뇨관 세포의 부종, 세뇨관 내 탈락 세포, 세뇨관 내 분비물 및 유사분열과 함께 신장 실질의 (67.29% ± 2.392)를 포함하는 ATN을 보여줍니다(그림 1)( 도 2B 및 3B).

시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 그룹은 브러시 경계의 손실, 세뇨관 세포의 부종, 세뇨관 내 떨어지는 세포, 세뇨관내 분비물 및 유사분열(그림 2D 및 3D).

ATN의 비율이 훨씬 더 높습니다.신장시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스에서 시스플라틴 처리된 GAL{3}} 야생 마우스(P<0.002) (fig.="">

GAL-3은 급성 세뇨관 괴사에서 발현됩니다.

GAL{0}}의 세포질 분획 농도가 크게 증가했습니다.신장시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 그룹(6084 ± 587.3 pg/mg)에서 GAL{5}} 야생 대조군(1620 ± 62.3 pg/mg)과 비교할 때 (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">신장시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생에서

GAL{4}} 야생 대조군(429.2 ± 39.56 pg/mg)과 비교할 때 그룹(841.8 ± 41.11 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

대표 면역형광염색신장섹션은 GAL-3 야생 대조군 마우스(그림 4A)와 비교할 때 급성 세뇨관 괴사의 영향을 받는 세뇨관에서 GAL-3의 상당히 더 높은 발현을 보여주었습니다(그림 4B-D).

GAL-3은 항괴사 매개체입니다.

수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1). RIPK{4}} 농도(55.33 ± 3.766 pg/mg)가 유의하게 증가했습니다.신장GAL-3 야생 대조군 마우스(14.22 ± 1.687 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스, (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

일원 분산 분석을 사용한 4개 실험 그룹 간의 다중 비교에 이어 Newman-Keuls 사후 검정이 통계적으로 유의했습니다(P<>

RIPK{0}}에 대한 면역조직화학 염색은신장시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스(P<0.001), (fig.="">

수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3). GAL{11}} 야생 대조군 쥐(17.46 ± 7.002pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">신장시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스(616.4 ± 27.07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

RIPK{0}}에 대한 면역조직화학적 염색은 시스플라틴 처리된 GAL{5}} 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{3}} KO 마우스의 신장에서 RIPK{1}}를 발현하는 세포의 수가 훨씬 더 많았음을 보여줍니다( 피<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

혼합 계통 키나제 도메인 유사(MLKL). MLKL 농도(71.46 ± 1.757 pg/mg)가 유의하게 증가했습니다.신장GAL-3 야생 대조군 마우스와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스(23.30 ± 0.5897pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

카텝신 B. 카텝신-B 농도가 유의하게 증가했습니다.신장GAL{6}} 야생 대조군 마우스(37.99 ± 1.206pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스(55.79 ± 4.141 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">신장(P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

일원 분산 분석을 사용한 4개 실험 그룹 간의 다중 비교에 이어 Newman-Keuls 사후 검정이 통계적으로 유의했습니다(P<>

카텝신-D. Cathepsin-D 농도가 크게 증가했습니다.신장GAL{5}} 야생 대조군 마우스(4066 ± 107.7 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스(5145 ± 286.1pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">신장GAL{5}} 야생 대조군 마우스(3914 ± 87.51 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스(6695 ± 587.7 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

일원 분산 분석을 사용한 4개 실험 그룹 간의 다중 비교에 이어 Newman-Keuls 사후 검정이 통계적으로 유의했습니다(P<>

GAL-3은 항세포자멸사 매개체입니다.

쪼개진 카스파아제-3. Cleaved caspase{1}} 농도(4665 ± 330.9 pg/mg)가 크게 증가했습니다.신장GAL{2}} 야생 대조군 마우스(3193 ± 75.30 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스, (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

cleaved caspase{0}}에 대한 면역조직화학염색은 cisplatin 처리된 GAL{4}} 야생 마우스보다 cisplatin 처리된 GAL{2}} KO 마우스의 신장에서 유의하게 더 많은 수의 아폽토시스 세포를 보여주었습니다(P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

쪼개진 PARP. Cleaved PARP 농도(1446 ± 56.97 pg/mg)가 유의하게 증가했습니다.신장GAL{2}} 야생 대조군 마우스(171.5 ± 3.926 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스, (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

절단된 PARP에 대한 면역조직화학 염색은 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스의 신장에서 훨씬 더 많은 수의 양성 세포를 보여주었습니다(P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF 관련 세포자살 유도 리간드(TRAIL). TRAIL 농도(120.9 ± 4.748 pg/mg)가 유의하게 증가했습니다.신장GAL-3 야생 대조군 마우스와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스(86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

절단된 caspase{0}}에 대한 면역조직화학 염색에서는신장시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스(P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

쪼개진 PARP. GAL{5}} 야생 대조군 마우스(171.5 ± 3.926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">신장GAL{2}} KO 대조군 마우스(236.1 ± 11.{6}} pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스, (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

절단된 PARP에 대한 면역조직화학 염색은신장시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스(P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF 관련 세포자살 유도 리간드(TRAIL). GAL-3 야생 대조군 쥐(86.14 ± 2.879pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">신장(P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

FAS 레전드.FAS 농도(332.5 ± 6.395 pg/mg)가 유의하게 증가했습니다.신장GAL-3 야생 대조군 마우스(77.72 ± 2.805 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} 야생 마우스, (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">신장GAL-3 KO 대조군 마우스(134.1 ± 3.597 pg/mg)와 비교할 때 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스, (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

일원 분산 분석을 사용한 4개 실험 그룹 간의 다중 비교에 이어 Newman-Keuls 사후 검정이 통계적으로 유의했습니다(P<>

GAL{0}} 및 생존 신호

NF-κB.인광체-NF-κB에 대한 면역조직화학적 염색은신장시스플라틴 처리 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리 GAL{3}} KO 마우스(P<0.001), (fig.="" 12="">

베타 카테닌.Beta-catenin에 대한 면역조직화학염색에서는 베타카테닌으로 염색된 세포의 수가 훨씬 더 많았다.신장시스플라틴 처리 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리 GAL{3}} KO 마우스(P<0.001), (fig.="" 12="">

아니{0}}Wnt{0}}에 대한 면역조직화학 염색은 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스의 신장에서 시스플라틴 처리된 GAL-3보다 훨씬 더 많은 수의 Wnt{1}}염색된 세포를 보여주었습니다. KO 마우스(P<0.001), (fig.="" 12="">

플라즈마 요소GAL-3 야생 대조군 마우스(6.688 ± 0)와 비교할 때 시스플라틴 처리 GAL{5}} 야생 마우스에서 혈장 요소 농도(23.88 ± 6.715mmol/L)가 유의하게 증가했습니다. 6066mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

일원 분산 분석을 사용한 4개 실험 그룹 간의 다중 비교에 이어 Newman-Keuls 사후 검정이 통계적으로 유의했습니다(P<>

혈장 크레아티닌

GAL-3 야생 대조군 마우스(13.27 ± 0)와 비교할 때 시스플라틴 처리 GAL{5}} 야생 마우스에서 혈장 크레아티닌 농도(48.42 ± 3.992 umol/L)가 유의하게 증가했습니다. 3106umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

논의

심각한신장부상은 전 세계적으로 흔한 건강 문제입니다. 매년 약 1,330만 건의 급성 질환이 발생합니다.신장부상(AKI). 신흥국에서 특히 높아지고 있는 부담[21]. 전 세계적으로 AKI로 인해 연간 170만 명이 사망합니다. 그 중 저소득 및 중간 소득 국가에서 약 140만 명이 발생합니다[21]. AKI는 종종 예방 및 치료가 가능하며 장기적으로 건강에 미치는 영향은 극히 일부에 불과합니다. AKI 개발에 참여하는 주요 메커니즘과 참여자를 식별하는 것은 환자의 치료를 개선하고 사망률과 이환율을 최소화하는 데 반영됩니다.

GAL{0}} 농도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다.신장AKI 대상. 우리는 또한 식염수 처리 대조군의 신장 세뇨관보다 시스플라틴 처리 GAL{2}} 야생 마우스에서 급성 세뇨관 괴사의 영향을 받은 세뇨관에서 GAL{0}}의 발현이 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. GAL{4}}의 세포질 및 핵 농도는 식염수 처리 마우스와 비교할 때 ATN 후 신장 세뇨관에서 유의하게 증가합니다. 손상된 신세뇨관에서 GAL-3의 증가된 수준은 GAL-3이 ATN에서 중요한 역할을 함을 시사합니다.

또한 GAL{0}} KO 마우스를 사용하여 ATN에서 GAL{1}}의 기계적 역할을 조사했습니다. 이를 통해 GAL-3의 존재 및 부재 시 pro-apoptotic, pro-necroptotic 및 prosurvival 단백질의 조절을 자세히 살펴보고 GAL-3이 이러한 변화에 영향을 미치는지 여부를 결정합니다. .

우리는 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스에서 ATN의 영향을 받는 세관의 비율이 훨씬 더 높은 것으로 나타났습니다. 우리의 결과는 또한 ATN에 의해 ​​영향을 받는 신장에서 카텝신 B와 카텝신 D의 상당한 증가를 보여주었습니다. 또한 카텝신 B와 카텝신 D의 수치가 훨씬 더 높습니다.신장시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스가 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 큽니다. 카텝신은 다양한 기질을 분해하거나 미토콘드리아 불안정화에 기여함으로써 세포 사멸 및 괴사 세포 사멸을 유도하는 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 합니다[22]. 리소좀 프로테아제, 카텝신 B 및 카텝신 D는 신장에서 풍부하게 발현된다[23].

산성 환경에서 최적의 활성을 갖는 시스테인 프로테이나제인 카텝신 B는 많은 생리적, 병리학적 과정에 참여합니다. 세포내의 구조적 단백질과 효소를 소화하고 기저막의 주성분을 분해하며 전효소, 호르몬, 성장인자를 활성화시킨다[24]. 증가된 발현 수준과 카텝신 B의 활성화가 세포자멸사를 겪고 있는 인간 근위 세뇨관 상피 세포주 HK{1}}에서 관찰되었습니다[25].

카텝신 D는 근위 세뇨관 세포에서 유의하게 발현됩니다. 카텝신 D는 리소좀 막의 세포 괴사와 파열 동안 뿐만 아니라 자가포식-리소좀에 의한 단백질 및 세포 소기관의 분해를 담당하는 주요 리소좀 아스파르트산 프로테아제입니다[26]. 카텝신 D는 신장 허혈/재관류 손상 후 손상된 세뇨관에서 유의하게 증가하여 카텝신 D가 유의하게 증가한다는 발견을 뒷받침합니다.신장급성 세뇨관 괴사와 함께 [27].

ATN의 비율이 높을수록 카텝신 B와 D의 농도가 높아집니다.신장시스플라틴 처리된 GAL-3 KO 마우스가 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 GAL-3이 항괴사 매개체임을 시사합니다.

우리는 또한 훨씬 더 높은 수준의 괴사 단백질을 보여주었습니다. RIPK1, RIPK3 및 MLKL신장시스플라틴 처리한 쥐. 또한, 시스플라틴 처리된 GAL{6}} 야생 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{4}} KO 마우스의 신장에서 RIPK1, RIPK3 및 MLKL의 농도가 유의하게 더 높은 것으로 확인되었습니다.

연구에 따르면 시스플라틴은 산화 스트레스 증가와 관련이 있습니다[28]. 활성산소(ROS)의 생성, 지질 과산화 생성물의 축적신장, 억제된 항산화 시스템은 시스플라틴에 의해 유도된 AKI의 주요 기전으로 생각됩니다[29]. 세포 내에서 시스플라틴은 글루타티온과 같은 티올을 함유한 항산화 분자와 빠르게 반응하여 반응성이 높은 형태로 전환됩니다[30]. 시스플라틴은 또한 손상된 호흡 사슬을 통해 미토콘드리아 기능 장애와 ROS 생성 증가를 유발할 수 있습니다[31]. ROS는 RIPK1 자가인산화를 촉진하고 RIPK{6}} 모집과 괴사체 형성을 촉진합니다[32]. 또한, ROS는 리소좀 막 투과성(LMP)의 중요한 유도인자입니다[33].

Cai et al. [34]는 ROS 매개 LMP가 토끼 추간판 세포에서 괴사 유도에 관여한다는 것을 보여주었습니다. 마찬가지로, RIPK1-유도 미토콘드리아-ROS 생성은 Ca2+와 JNK 사이의 양성 피드백 루프의 결과로 LMP 및 미토콘드리아 기능 장애로 이어지며, 이는 A549 및 H1299 세포의 괴사를 유발합니다[35, 36].

또한, necroptosis에서 상향 조절된 RIPK3은 세포질 세망 스트레스를 유도하여 세포 Ca2 + 농도를 증가시키고 xanthine oxidase의 발현을 증가시켜 ROS 생성을 증가시키는 것으로 나타났습니다[37].

카텝신 B와 D는 세포 사멸 과정에서 증가된 LMP와 함께 리소좀에서 방출되는 주요 기능적 내용물이다[34]. 카텝신 B 및 D 활성화는 괴사 경로를 증가시킬 수 있습니다[38]. 따라서 necroptosis는 수용체 독립적인 방식으로 유도될 수 있습니다[39]. 또한 ROS, cathepsin B, D 외에 necroptosis를 유도하는 추가적인 자극이 있다는 보고가 있으며, 여기에는 TRAIL의 상향조절, FAS legend protein이 있다[40]. 따라서 시스플라틴 또는 RIPK1 또는 RIPK3의 유도로 인해 ROS가 증가하면 LMP가 증가하고 카텝신 B와 D가 방출되어 결국 괴사를 증가시킬 수 있습니다. 마찬가지로, 증가된 ROS는 RIPK1, RIPK3의 동원, 괴사 형성의 향상, MLKL의 인산화, 인산화된 MLKL의 세포막으로의 전위를 활성화하여 원형질막 투과화 및 파열을 통한 괴사 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.

이 연구에서 우리는 증가된 ROS, 카텝신 B, 카텝신 D, TRAIL 및 FAS가 ATN에서 괴사 유도에 관여한다고 믿습니다.

괴사에서 GAL{0}}의 역할을 확인하기 위해 GAL-3 wild 및 GAL{{5 }} KO 마우스.

시스플라틴 처리된 GAL-3 마우스보다 시스플라틴 처리된 GAL{3}} KO 마우스에서 훨씬 더 높은 농도의 RIPK1, RIPK3 및 MLKL은 GAL-3의 녹아웃이 다음과 관련이 있음을 나타냅니다. 괴사 단백질의 상당한 증가는 GAL-3의 항괴사 역할을 시사합니다.

더욱이, 우리는 상당히 더 높은 수준의 pro-apoptotic protein을 보여주었습니다. cleaved caspase-3, cleaved PARP, TRAIL, FAS 및 apoptotic body신장ATN에 이어

ATN 동안, 리소좀 막 투과화는 카텝신 D와 카텝신 B를 리소좀에서 세포질로 전위시켜 세포자멸사 기능을 발휘할 수 있습니다. 세포질 카텝신 D는 Bid 단백질을 tBid로 절단하여 미토콘드리아 막으로 Bax 단백질의 삽입을 유발합니다. 이는 미토콘드리아에서 시토졸로 시토크롬 c가 방출되고 프로카스파제 9와 3이 활성화됩니다[41]. 이 연구에서 면역형광 염색과 단백질 농도는 모두 ATN에서 세포질 및 핵 분획인 세포내 GAL-3의 발현이 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다.신장대조군 마우스와 비교한 GAL{0}} 야생 마우스의 비율.

따라서 더 높은 수준의 pro-apoptotic protein; cleaved caspase-3, TRAIL, FAS 및 apoptotic body신장시스플라틴 처리된 GAL{1}} KO 마우스의 시스플라틴 처리된 GAL-3 야생 마우스보다 GAL-3의 항세포자멸사 역할을 시사합니다. GAL-3은 세포하 위치에 따라 세포자멸사에 결정적으로 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 연구에 따르면 세포 내 GAL-3이 세포자멸사[42-44]를 억제할 수 있습니다. GAL의 항세포자멸사 역할을 뒷받침하기 위해{10} 시스플라틴 처리된 GAL의 신장에서 phospho-NF-κB, 베타-카테닌 및 Wnt 단백질을 발현하는 세포의 수가 훨씬 더 많다는 것을 확인했습니다.{15} } GAL{16}} KO 쥐보다 야생 쥐. NF-κB는 염증, 세포 증식 및 세포 생존을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 전사 인자입니다. 인산화는 이러한 모든 자극의 하류에서 NF-κB의 활성화에 중요한 역할을 합니다[45]. NF-κB는 현재 세포 생존 및 세포자멸사로부터의 보호에 중요한 기여자로 인식되고 있습니다[46]. Wnt 단백질은 -catenin 및 c-Myc의 활성화를 통한 항-세포자멸사 기능을 통해 손상된 세포에 보호 효과가 있는 것으로 나타났습니다[47].

Wu et al. 또한 p-NF-κB의 상당한 증가를 보여주었습니다.신장ATN과 함께 [48]. Wang et al. 또한 급성 신장 손상에서 Wnt/-catenin 신호 전달 경로의 상향 조절을 보여주었습니다[49]. 연구에 따르면 NF-κB가 GAL{5}}[50]의 유도에 관여하고 GAL-3이 NF-κB의 활성화에 관여하는 것으로 나타났습니다[51]. 흥미롭게도 GAL{10}}은 -catenin의 새로운 결합 파트너로 밝혀졌습니다[52].

이러한 발견은 GAL{1}}의 항-세포자멸사 역할이 NF-κB 및 Wnt/-카테닌 경로의 활성화를 통해 매개될 수도 있음을 시사합니다. GAL-3은 우리 연구에서 조사된 이러한 생존 촉진 신호 전달 경로를 연결하는 것으로 보입니다. 이러한 경로는 또한 다양한 수준에서 그들 사이에 혼선이 있습니다. Wnt/-카테닌 경로 플레이어는 NF-κB와의 상호작용을 통해 많은 효과를 조절하며, 상호적으로 NF-κB는 Wnt/-카테닌 신호 전달 경로에도 영향을 미칩니다[53]. 따라서 GAL{12}}이 생존 신호 전달 경로에서 중심 연결자 역할을 한다는 것은 이해할 수 있습니다.

우리의 연구는 세포 내 GAL{0}}의 존재 또는 부재가 시스플라틴 유도 ATN에서 proapoptotic, pronecroptotic 및 prosurvival 단백질의 상당한 변화와 관련이 있으며 신장 세뇨관에서 높은 수준의 GAL{2}}이 질병의 미래 과정을 형성할 수 있는 항세포자멸사, 항괴사제 및 생존 환경을 매개합니다. 이는 급성 시스플라틴으로 유도된 ATN에서 GAL-3의 보호 역할을 시사하며, 이는 GAL-3 야생 시스플라틴 처리 마우스에서 GAL-3보다 상당히 낮은 혈장 요소 및 크레아티닌 수치로 뒷받침됩니다. KO 시스플라틴 처리된 마우스(도 13).

결론

GAL{0}}은 시스플라틴에 의해 유발된 급성 세뇨관 괴사 동안 신세뇨관에서 괴사, 세포자멸 및 생존촉진 단백질과의 상호작용을 통해 세포 생존 및 사멸에 영향을 미칠 수 있습니다.

감사의 말

저자 기여

모든 저자는 제출된 원고 버전을 검토하고 승인했습니다. SA는 개념을 도입하고 연구를 설계하고 데이터를 분석 및 해석하고 그림을 설계하고 논문을 작성했습니다. GJ는 동물 실험과 ELISA 기술을 수행했으며 MS는 면역조직화학 및 면역형광 염색 및 관련 조직 처리를 수행했습니다. HT는 동물 실험과 ELISA 기술을 수행했습니다. JY는 신장 기능의 생화학적 분석을 수행하고 결과 데이터를 제출했습니다.

공개 성명

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

참고문헌

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