1부|Herba Cistanche 추출물은 쥐의 심장과 H9c2 세포에서 미토콘드리아 ATP 생성을 향상시킵니다
Mar 04, 2022
Hoi Yan Leung 및 Kam Ming Ko
홍콩과학기술대학교 생화학과, Clear Water Bay, 홍콩 특별행정구, 중국
키워드: ATP,시스탄체 데저티콜라, H9c2 세포, 심장, 미토콘드리아
추상적인
"의 약리학적 근거를 조사하기 위해양기" Herbal Cistanche [건조한 전체 식물의 작용]시스탄체 데저티콜라YC Ma (Orobanchaceae)], 한의학에서 미토콘드리아 ATP 생성 능력에 대한 Herba Cistanche의 메탄올 추출물의 효과는 생체 외 쥐 심장 모델과 in situ H9c2 세포 분석을 사용하여 조사되었습니다. Herba Cistanche 추출물 처리는 시험관 내 측정으로 평가한 바와 같이 쥐의 심근 미토콘드리아 ATP 생성 능력을 용량 의존적으로 증가시켰습니다. ATP 생성 능력의 자극은 숙신산이 아닌 피루브산에 의해 지원되는 미토콘드리아 전자 수송의 병렬 향상과 관련이 있습니다. Herba Cistanche 치료는 또한 심근 미토콘드리아 복합체 I 및 복합체 III 활성을 증가시켰고, 복합체 I 활성에 대한 자극의 정도는 더 커졌습니다. Herba Cistanche 처리는 H9c2 세포에서 미토콘드리아 ATP 생성 능력의 용량 및 시간 의존적 증가를 생성했습니다. 결과는 Herba Cistanche 치료가미토콘드리아 ATP 생성 증가생체 외에서 쥐의 심장과 제자리에서 H9c2 세포, 아마도 통해산화적 인산화 강화.
Cistanche는 심장 기능을 개선하고 혈압을 낮추며 혈중 지질을 낮출 수 있습니다.
소개
한의학에서 일반화된 신체 기능 향상을 구현하는 "양 기운"은 다양한 생화학적 과정을 추진하는 데 에너지를 사용하는 것을 포함합니다.
이와 관련하여 세포 기능에 연료를 공급하는 에너지의 보편적인 통화인 ATP는 주로 미토콘드리아의 산화적 인산화를 통해 생성됩니다. 우리는 "양 기운을 북돋아주는" 허브가미토콘드리아 ATP 생성 능력을 증가시키는 능력 보유(Ko et al., 2004). 이것은 "양 기운"이 아닌 "음영양" 중국 강장제가 생체 외 생쥐 심장에서 심근 ATP 생성 능력을 향상시킬 수 있다는 최근 발견에 의해 뒷받침됩니다(Ko et al., 2006). Cistanche Deserticola YC Ma(Orobnchaceae)의 기생식물(꽃 제외)을 통째로 건조시킨 Herba Cistanche는'양기(陽氣)'는 중국 전통 의학(Chen, 1998)에 있는 토닝 허브이며, 양보에 사용되는 많은 중국 특허 공식에서 가장 인기 있는 성분으로 나타납니다. 중국과 일본에서 Herba Cistanche는 다양한 양 결핍 증상의 치료에 널리 사용됩니다. 약리학적 연구에 따르면 Herba Cistanche는자유 라디칼 제거(Xiong et al., 1996),진정제를 생산하다(루, 1998),노화 방지(Lee et al., 1990),항통 및 항염 효과(Lin et al., 2002), 그리고면역 기능을 강화(Wu et al., 2005). Herba Cistanche의 주요 활성 성분은페닐에타노이드 배당체(Ouyang et al., 2003)항균, 항스트레스, 항산화특성(Xiong et al., 1998) 뿐만 아니라 배양된 뉴런에 대한 항-세포자멸사 효과(Tian & Pu, 2005). 본 연구에서는 한약재의 양생작용의 약리학적 근거를 조사하기 위해 생체외에서 쥐의 심장과 배양된 H9c2 심근세포에서 분리한 미토콘드리아의 ATP 생성능에 대한 한방치료의 효과를 조사하였다. ATP 생성 강화 작용의 기초가 되는 생화학적 메커니즘을 탐구하기 위해 미토콘드리아 전자 수송 및 복잡한 I-IV 활성에 대한 Herba Cistanche 치료의 효과를 쥐의 심장에서도 조사했습니다.
씨스탄슈의 유효성분은 다양한 활성산소를 제거할 수 있습니다.
재료 및 방법
화학물질, 세포배양, 한약재
ATP, ADP 및 3-[4,5-디메틸티오졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma Chemical Co에서 구입했습니다. (미국 미주리주 세인트루이스). 루시퍼라제 용액(ATPlite)은 PerkinElmer(Boston, MA, USA)로부터 입수하였다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 태아 소 혈청(FBS)은 GIBCO BRL Life Technologies(Grand Island, NY, USA)에서 구입했습니다. H9c2 세포주는 ATTC(Rockville, MD, USA)에서 구입했습니다. Herba Cistanche는 현지 허브 딜러(이흥기)가 공급했습니다. 허브는 공급자에 의해 인증되었으며 바우처 표본(HKUSTY00301)은 홍콩 과학 기술 대학(HKUST) 생화학과에 기탁되었습니다.
허브 추출
Herba Cistanche(100g)를 작은 조각으로 자른 다음 65℃에서 2시간 동안 300mL 메탄올에서 환류 가열하여 추출했습니다. 절차를 두 번 반복했습니다. 모아진 추출물을 용매를 감압 증발시켜 건조시킨 결과 39%(w/w)의 수율로 허바 시스탕쉬의 메탄올 추출물을 얻었다. 화학적 분석에 따르면 Herba Cistanche의 메탄올 추출물에는 총 사포닌, 총 플라보노이드, 총 리그난 및 다당류가 각각 1.62%(w/w), 0.08%, 0.15% 및 75.6%의 농도로 포함되어 있습니다.
동물 관리
성체 수컷 Sprague-Dawley 쥐(8-10주, 250-300g)를 약 22ºC의 공기/습도 조절실에서 12-시간 암/광 주기로 유지하고 음식과 물을 임의로 허용했습니다. HKUST의 동물 보호 시설에서. 실험 프로토콜은 HKUST의 연구실무위원회(Research Practice Committee)의 승인을 받았습니다.
약물 치료
동물을 무작위로 그룹으로 나누었고 각 그룹에는 5~6마리의 동물이 있었습니다. 처리 그룹에서 쥐에게 3일 동안 1일 용량({0}}.031–0.5 g/kg)을 증가시키면서 Herba Cistanche의 메탄올 추출물(물에 용해/현탁)을 위내 투여했습니다. 대조군 동물은 물만 받았다. 마지막 투여 후 24시간 후, 페노바르비탈 마취된 동물로부터 심장을 채취하여 생화학적 분석을 실시하였다.
미토콘드리아 분획의 준비 및 생체 외 ATP 생성 능력(ATP-GC) 측정
심장 좌심실 조직 샘플을 절제하고 빙냉 등장성 완충액(0.32M 자당, 1mM EDTA, 50mM Tris/HCl, pH 7.4)으로 헹구었습니다. 심장 미토콘드리아 분획은 4ºC의 등장 완충액에서 차등 원심분리하여 준비했습니다. 10%(w/v) 심장 균질액은 다진 심실 조직을 테플론 유리 균질기로 4000rpm에서 20-30회의 완전한 스트로크로 균질화하여 준비했습니다. 균질액을 600 x g에서 10분 동안 원심분리하여 핵과 세포 파편을 제거했습니다. 그런 다음 상층액을 8000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 침전시켰다(Evan, 1992). 펠릿을 등장성 완충액 1mL에 재현탁하고 미토콘드리아 분획을 재구성했습니다. 처리되지 않은 동물의 미토콘드리아 ATP-GC는 Leung et al. (2005)
Cistanche 다당류는 장기의 생리학적 변성과 세포 형태의 변성을 지연시킬 수 있습니다.
미토콘드리아 전자 수송 측정
Cohen et al. (1997). 미토콘드리아는 인큐베이션 완충액(25{16}}mM 자당, 5{18}}mM HEPES, 10mM KH2PO4, 2mM MgCl2, 1mM EGTA, pH 7.4)을 사용하여 1mg/mL의 단백질 농도로 준비했습니다. . 미토콘드리아의 분취량(40μL)을 15mM 피루베이트 또는 0.5mM 석시네이트 및 0.42mg/mL MTT 각각 100μL와 혼합했습니다. 반응 혼합물을 부드럽게 흔들면서 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL 용해 완충액(10%, w/v, 나트륨 도데실 설페이트, 및 45% 디메틸포름아미드, 빙초산으로 pH 4.7로 조정)을 첨가하여 반응 혼합물을 종결시켰다. 5분 동안 방치한 후, 반응 혼합물의 흡광도 판독값을 마이크로타이터 플레이트 판독기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 측정하고 570 nm와 630 nm의 차이로 보고했습니다. 데이터는 대조군(즉, Herba Cistanche-미처리) 그룹의 평균 값의 백분율로 표시되었습니다.
세포 배양
심장 근모세포(Hescheler et al., 1991)에서 파생된 영구 세포주인 H9c2 세포는 10%(v/v) FBS가 보충된 DMEM에서 단층으로 배양되었습니다. 배지는 NaHCO3(17mM), 페니실린(100IU/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 포도당(4.5g/L) 및 글루타민(4.5mM)을 포함했습니다. 모든 세포는 37ºC의 공기 중 5%(v/v) CO2 대기에서 성장했습니다. 배지는 2 또는 3일마다 새로운 배지로 교체되었습니다. 세포 스톡을 75 cm2 배양 플라스크에서 성장시키고 1:10의 계대배양 비율로 합류 전에 분할하였다. ATP-GC 분석을 위해 H9c2 세포를 24-웰 플레이트에 2.5 × 104 cells/well의 밀도로 시딩했습니다. 세포 부착 후, Herba Cistanche 추출물(인산염 완충 식염수에 용해, PBS)을 배지에 적용하고 세포를 증가된 기간(2-16시간) 동안 배양했습니다. 대조군(미처리) 세포에는 PBS만 제공되었습니다.
현장에서 ATP-GC 측정
증가하는 농도(5{{1{13}}}}–300µg/mL)에서 HerbaCistanche 추출물과 함께 표시된 기간 동안 배양한 후 ATP-GC 분석을 수행했습니다. 배지를 흡인하고 세포를 인큐베이션 완충액(120mM KCl, 5mMKH2PO4, 2mM EGTA, 10mM HEPES, 0.1mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.4)에서 37℃에서 3분 동안 디지토닌(50㎍/mL)으로 처리하였다. ◦ 다. 디지토닌을 흡인한 후 미토콘드리아 ATP 생성을 위해 글루타메이트(5mM), 말산(5mM) 및 ADP(60μM)를 세포에 첨가했으며, 이를 0분에서 15분 사이의 증가하는 시간 간격으로 모니터링했습니다. 60 μL의 과염소산(30%, w/v)을 첨가하여 반응을 종료한 다음, 반응 혼합물을 4℃에서 600 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액의 분취액(120μL)을 1.4M KHCO3 90μL와 혼합하여 중화시켰다. 혼합물을 다시 4℃에서 600×g으로 원심분리하고, 앞서 설명한 바와 같이 상등액의 ATP 함량을 측정하였다. 처리되지 않은 세포의 ATP-GC는 생성된 ATP(nmol/mg 단백질)를 시간(0-15분)에 대해 플롯팅한 그래프(AUC1)의 곡선 아래 면적을 계산하고 임의의 단위로 표시하여 추정했습니다. HerbaCistanche로 처리된 세포의 경우, 증가하는 배양 시간(3, 5, 7, 10, 15분)의 AUC1 값을 처리되지 않은 샘플의 각 평균 대조군 값으로 정규화하고 퍼센트 대조군으로 표시했습니다. 그런 다음, 인큐베이션 시간(3-15분)에 대한 퍼센트 제어 값을 표시하는 그래프의 곡선 아래 면적(AUC2)을 계산하고 임의의 단위로 표시했습니다. Herba Cistanche로 처리된 그룹의 데이터는 방정식에서 대조군의 백분율로 표시되었습니다.
[AUC2(HerbaCistanche - 처리)/AUC2(미처리)]×100%
복합 I-IV 및 구연산염 합성 활성 측정
미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC) 복합체 I-III 활성은 설명된 대로 복합체 특이적 기질(복합체 I의 경우 NADH, 복합체 II의 경우 숙시네이트, 복합체 III의 경우 데실루비퀴놀)을 사용하여 분광광도법으로 측정되었습니다(Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark et al., 2001). 복합 IV 활성은 Sigma의 시토크롬 c 산화효소 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다. Mitochondrial citrate synthase 활성은 Srere(1969)의 방법으로 측정하였다.
단백질 분석
미토콘드리아 분획 및 세포 용해물의 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 사용하는 BioRad 단백질 분석 키트를 사용하여 결정했습니다({0}}.038–0.600mg/mL).
통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 주제의 표준 오차(SEM)로 표현되었습니다. 그들은 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석되었습니다. LSD로 사후 다중 비교를 수행했습니다. P 값<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">
결과
쥐의 심근 미토콘드리아 ATP-GC에 대한 Herba Cistanche 치료의 효과
그림 1에서 볼 수 있듯이 최대 0.5g/kg의 양송이 추출물을 처리하면 쥐에서 심근 미토콘드리아 ATP-GC가 용량 의존적으로 증가했으며 자극 정도는 용량에서 89%였습니다. 0.5g/kg.
쥐의 심장에서 미토콘드리아 전자 수송에 대한 Herba Cistanche 치료의 효과
MTT의 감소를 모니터링하여 측정된 고립된 미토콘드리아의 전자 수송 정도. 분석에 사용된 기질은 피루베이트 또는 숙시네이트였습니다.
그림 1. 생체 외 쥐 심장에서 미토콘드리아 ATP 생성 능력에 대한 Herba Cistanche 치료의 효과
각 막대는 n {{0}}으로 주제 ± SEM을 나타냅니다. 동물을 3일 동안 표시된 일일 용량의 HerbaCistanche로 경구 처리했습니다. ATP 생성 능력은 "재료 및 방법"에 설명된 대로 측정되었습니다. 데이터는 각각의 미처리 대조군의 값(AUC2)에 대한 대조군 퍼센트로 표시하였다. *각각의 미처리 대조군과 상당히 다름; 0.5g/kg의 Herba Cistanche 처리군과 상당히 다릅니다.
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그림 2. 쥐의 심장에서 미토콘드리아 전자 수송에 대한 Herba Cistanche 치료의 효과
각 막대는 n {{0}}인 평균 ± SEM을 나타냅니다. (a) 피루베이트 지원 (b) 숙시네이트 지원 미토콘드리아 전자 수송은 "재료 및 방법"에 설명된 대로 MTT 환원에 의해 측정되었습니다. 데이터는 처리되지 않은 대조군 값의 백분율로 표시되었습니다[피루베이트 지원: OD570nm- OD630nm =0.{17}}206 ± 0.0001(SEM), n {{ 10}}; 석시네이트 지원: 수컷, 0.255 ±0.015, n=5]. *각각의 미처리 대조군과 상당히 다름; 0.5g/kg 그룹과 상당히 다릅니다.
그림 2a에서 볼 수 있듯이 Herba Cistanche 치료는 0.5g/kg의 용량에서 관찰 가능한 최적의 자극과 함께 쥐의 심장에서 피루브산이 지원하는 미토콘드리아 전자 수송의 정도를 용량 의존적으로 증가시켰습니다. 그러나, 숙시네이트에 의해 지원되는 미토콘드리아 전자 수송 정도의 유의미한 변화는 Herba Cistanche로 처리된 쥐 심장에서 감지되지 않았습니다(그림 2b).
파트 2의 경우여기를 클릭해주세요.