1부:인간 우유 올리고당 2/-푸코실락토스는 뇌내 출혈 뇌졸중으로부터 신경 보호를 유도합니다
Mar 22, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
차이웨이 훙1, 우궈젠1, 왕위셴1, 배은경1, 송영하2, 윤종원2, 유성진1,*
1국립보건연구원, 신경정신과 연구센터, Zhunan 35053, Taiwan;
pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);
baee@nhri.edu.tw (E.-KB)
2Advanced Protein Technologies Corporation, 수원시 16229, 한국; yhsong@aptech.biz (YS);
jongwon.yoon91@gmail.com (JY)
통신: b7508@nhri.edu.tw; 전화: 플러스 886-37206166 (내선 36710)
추상적인:
뇌내출혈(ICH)은 뇌혈관이 파열되어 염증과 세포사를 일으킬 때 발생합니다. 2-인유 올리고당인 푸코실락토스(2FL)는 강력한 항세포자살 및 항염 효과가 있습니다. 이 연구의 목적은 ICH의 세포 및 설치류 모델에서 2FL의 보호 효과를 조사하는 것이었습니다. 헤민은 기본 쥐 피질에 추가되었습니다신경 세포및 BV2 미세아교세포 공동 배양을 통해 시험관 내에서 ICH를 시뮬레이션합니다. IBA1 및 MAP2 면역 반응성을 사용하여 염증 및신경 세포활착. 헤민은 IBA1을 유의하게 증가시킨 반면 MAP2 면역 반응성을 감소시켰다. 2FL은 두 가지 반응에 모두 적대적이었습니다. 2FL의 보호 효과는 다음으로 쥐 ICH 모델에서 조사되었습니다. 유형 VII 콜라게나아제의 뇌내 투여는 개방 필드 운동 활성을 감소시켰다. 2FL을 사용한 조기 치료 후 운동 활동이 상당히 개선되었습니다. 면역조직화학 및 qRT-PCR 분석을 위해 뇌 조직을 수집했습니다. 2FL은 병변이 있는 선조체에서 IBA1 및 CD4 면역 반응성을 감소시켰습니다. 2FL은 ER 스트레스 마커(PERK 및 CHOP)의 발현을 하향조절한 반면, 병변이 있는 뇌에서 M2 대식세포 마커(CD206 및 TGF)를 상향조절했습니다. 종합하면 2FL이 가지고 있는 데이터 지원신경보호억제를 통해 ICH에 대한 효과신경염및 ER 스트레스. 2FL은 ICH 치료에 임상적 의미를 가질 수 있습니다.
키워드: 2-푸코실락토스; 뇌내 출혈 뇌졸중; 염증; 소포체
1. 소개
뇌내출혈(ICH)은 주요신경학적성인의 높은 사망 위험과 관련된 장애[1,2]. ICH는 모든 급성 뇌졸중 사례의 10-15%를 차지합니다[3]. 몇몇 역학 연구는 ICH[4] 또는 뇌혈관 질환[5]이 있는 환자의 성별 격차를 지지했습니다. ICH 환자의 작은 부분에서 출혈성 열공 증후군이 발생합니다[6]. ICH에 대한 현재 치료는 출혈 조절, 혈전 제거 및 출혈로 인한 두개내압 완화에 중점을 둡니다. ICH에 대한 효과적인 약리학적 치료법은 없습니다.
염증은 ICH에 의해 유발된신경변성. ICH가 시작된 후 혈액 세포는 뇌 실질로 들어가 미세아교세포를 활성화하고 염증성 사이토카인 생성을 시작합니다[7,8]. 헤모글로빈의 부산물인 헤민은신경 세포사망하고 세포 사멸과 염증을 유발합니다 [9,10]. 여러 연구에서 ICH 동물 모델에서 항염증 치료의 효과를 뒷받침했습니다[11,12]. 우리는 최근에 CXCR4 길항제 CX807을 사용한 초기 후처리가 실험적 ICH 쥐에서 염증을 억제하고 행동 기능을 개선함을 입증했습니다[13]. 이러한 데이터는 항염증 요법이 뇌 손상을 줄일 수 있음을 시사합니다.
무형문화유산 이후.
사람의 모유에는 영양과 몇 가지 중요한 생리 활성 성분[14], 예를 들어 모유 올리고당(HMO)이 포함되어 있습니다[15]. 2'-푸코실락토스(2FL)는 모유의 주요 올리고당입니다. 2FL의 구두 전달 개선메모리및 쥐의 학습 [16,17]. 또한, 2FL은 인간 장세포에서 lipopolysaccharide에 의한 CD14 발현과 염증을 억제하였다[18]. 우리는 최근에 2FL이 완화되었다고 보고했습니다.신경염허혈성 뇌졸중으로 고통받는 뇌에서 [19]. 이러한 데이터는 2FL이 강력한 항염증제이므로 ICH 치료에 유용할 수 있음을 시사합니다.
이 연구의 목적은 ICH의 세포 및 동물 모델에서 2FL의 신경 보호 작용을 조사하는 것이었습니다. Hemin은 세포 배양에서 ICH를 시뮬레이션하는 데 사용되었습니다[20]. 우리는 2FL이 소교세포의 헤민 매개 활성화를 길항한다는 것을 입증했습니다. 유형 VII 콜라게나아제는 성인 쥐에서 국소 ICH를 생성하는 데 사용되었습니다[13]. 우리는 2FL이 ICH에 의해 유도된 미세아교세포 활성화, CD4와 림프구 침윤 및 병변이 있는 뇌의 ER 스트레스를 유의하게 완화하고 행동 기능을 개선한다는 것을 발견했습니다. 2FL이 가지고 있는 데이터 지원신경보호ICH에 대한 효과.
시스탄치 추출물의 효과
2. 결과
2.1. 2FL은 1차 피질 뉴런 및 BV2 미세아교세포 공동 배양에서 헤민 매개 신경변성을 감소시켰습니다.
2FL의 보호 효과는 뇌출혈의 세포 모델에서 처음으로 조사되었습니다. 1차 피질신경 세포BV2 미세아교세포 공동 배양물은 48시간 동안 헤민(10uM)으로 처리되었습니다(그림1E의 타임라인 참조). 헤민 감쇠신경 세포마커 MAP2(그림 1A), 미세아교세포 마커 IBA1(그림 1B)을 증가시켰습니다. 이러한 반응은 모두 2FL(1 uM, 그림 1A,B)에 의해 길항되었습니다. 특정 마커의 픽셀 밀도를 측정하여 MAP2 및 IBA1의 면역 반응성을 추가로 분석했습니다. 그림 1C,D에서 볼 수 있듯이 헤민은 MAP2 면역반응을 유의하게 감소시키고(Map{11}}ir) IBA{12}}를 증가시켰습니다(p < 0.{19}}0="" 1,="" 일원="" 분산="" 분석,="" 각="" 그룹의="" n="6)." 이러한="" 응답은="" 2fl(map2:="" p="">< 0.001,="" f2,{22}}.{23}},="" iba1:="" p="">< 0.001,="" f2,{28}}.644,="" 일원="" 분산="" 분석)에="" 의해="" 상당히="">
F
그림 1.신경보호1차 피질에서 2FL의 효과뉴런및 BV2 미세아교세포 공동 배양. (A) 대표적인 현미경 사진은 헤민이 MAP2 면역 반응성(-ir)을 감소시켰음을 보여줍니다. 2FL과의 병용 투여는 MAP-ir의 헤민 매개 손실을 길항했습니다. (B) Hemin은 IBA{6}}ir을 증가시켰습니다. 2FL과의 병용 투여는 IBA{8}}ir를 감소시켰습니다. (C,D) MAP{9}}ir 또는 IBA{1{19}}}}의 픽셀 밀도는 NIS Elements AR 5.11 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. (C) 2FL은 MAP{15}ir의 헤민 매개 손실을 유의하게 길항합니다. (D) 2FL은 헤민 유도 IBA1 활성을 유의하게 약화시켰다. (E) 실험 타임라인. * p < 0.05.="" 스케일="" 바="100">
시스탄치 추출물의 이점
2.2. ICH 쥐의 2FL 개선된 운동 활성을 사용한 치료 후
2FL의 보호 효과는 다음으로 ICH의 동물 모델에서 조사되었습니다. 총 14마리의 성체 수컷 쥐에게 저용량(0.5 units/uL × 1 uL)의 유형 VII 콜라게나아제를 정위적으로 투여하여 오른쪽 선조체의 뇌출혈을 유도했습니다. 2FL(400 mg/kg/d, ip, n=7) 또는 비히클(saline, ip, n=7)을 뇌졸중 1일 후부터 5일 동안 매일 투여했습니다(시간표 참조 그림 2G). 그런 다음, 5일째에 마지막 2FL 또는 비히클 주입 후 2시간 후, 동물을 적외선 활성 챔버에 30분 동안 개별적으로 배치했습니다. 30분 동안 야외 운동 행동을 조사했습니다. 우리는 2FL이 수직 활동(VACTV, 그림 2A), 총 이동 거리(TOTDIST, 그림 2B), 수직 시간(VTIME, 그림 2C), 수평 활동(HACTV, 그림 2D), 이동 시간(MOVTME, 그림 2E)을 상당히 증가시켰음을 발견했습니다. ) 및 이동 번호(MOVNO, 그림 2F). 자세한 통계(two-way ANOVA 및 사후 Newman-Keuls(NK) 테스트)는 표 1에 나열되어 있습니다.
그림 2. 2FL을 사용한 후처리는 ICH 쥐의 신경 기능을 향상시킵니다. D0(G, 타임라인)에 성인 쥐를 유형 VII 콜라게나제로 처리했습니다. 2FL 또는 비히클을 5일 동안 매일 전신 투여하였다. D5에 운동 행동을 조사했습니다. 2FL은 (A) 수직 활동, (B) 총 이동 거리, (C) 수직 시간, (D) 수평 활동, (E) 이동 시간 및 (F) 이동을 크게 개선했습니다.
숫자. n {{0}} 각 그룹. * p < 0.05,="" 양방향="" anova;="" #="" p="">< 0.05,="" 사후="" nk="">
표 1. ICH + veh 및 ICH + 2FL 간의 운동 행동의 중요한 차이.
2.3. 병변 주변 지역에서 2FL 감소된 미세아교세포 활성화를 사용한 조기 치료 후
8마리의 ICH 쥐(2FL, n=4; Veh, n=4)를 안락사시키고 5일째의 행동 테스트 후 IBA1 면역조직화학을 관류했습니다. 일반적인 IBA{5}}ir은 그림 3에 나와 있습니다. . IBA{7}}ir은 veh를 투여받은 뇌졸중 쥐의 반대쪽 비 병변 선조체(그림3A)의 해당 부위와 비교하여 선조체(그림 3B)의 병변 주변 영역에서 향상되었습니다. 고배율에서, 탈분열 또는 아메보이드 미세아교세포는 병변 부위에서 발견되었고(그림 3B, 삽입), 분류된 형태를 나타내는 휴지 미세아교세포는 병변이 없는 선조체에서 발견되었습니다(그림3A, 삽입). 2FL 처리는 IBA{17}ir를 감소시키고 미세아교세포의 형태학적 파급효과를 부분적으로 복원했습니다(그림 3C, 삽입물). IBA{19}}ir는 모든 동물에서 시각화된 전방 교련과 함께 3개의 연속 뇌 섹션에 걸쳐 정량화되고 평균화되었습니다. 2FL은 IBA{21}또는 ICH 뇌에서 상당히 감소했습니다(그림 3D, p < 0.001,="" f2,{26}}.357,="" 일원="" 분산="">
그림 3. 초기 치료 후 2FL은 병변이 있는 선조체에서 미세아교세포 활성화를 감소시켰습니다. 동물은 1일에서 5일까지 콜라게나제 주사 후 비히클 또는 2FL을 받았습니다. 동물은 5일에 희생되었습니다. 병변이 있는 선조체(B 대 A)에서 박리된 형태를 갖는 강화된 IBA1 면역 반응성이 발견되었습니다. 2FL을 사용한 치료는 IBA 면역반응을 감소시켰다(C 대 B). (D) 2FL은 병변이 있는 뇌에서 IBA1 면역 반응성을 유의하게 감소시켰습니다. * p < 0.05,="" 일원="" 분산="" 분석="" +="" nk="">
2.4. 2FL 완화된 CD4와 병변이 있는 뇌로의 림프구 침윤
콜라게나아제의 투여는 CD4와 병변이 있는 선조체로의 림프구 침윤을 향상시켰습니다(그림 4B). 병변이 없는 선조체에서는 CD4 세포가 거의 발견되지 않았습니다(그림 4A). 병변이 있는 선조체로의 CD4 세포 침윤은 2FL 처리에 의해 완화되었습니다(그림 4C 대 그림 4B, p < 0.001,="" f2,{12}}.485,="" 일원="" anova,="" 그림="">
그림 4. 2FL로 치료한 후 CD4와 림프구 침윤이 손상된 뇌로 감소했습니다. 대표적인 현미경 사진은 (A) 병변이 없는 선조체 및 (B) 저배율(교정=50 um) 및 고배율(삽입, 교정=10 음), 뿐만 아니라 (C) 2FL을 받은 쥐로부터 병변이 있는 선조체. (D) 2FL은 병변이 있는 뇌에서 CD{1{11}}}ir을 유의하게 감소시켰습니다(* p < 0.001,="">
방법 ANOVA).
2.5. 2FL은 ICH 뇌에서 M1 및 M2 염증 마커의 발현을 차등적으로 변경했습니다
5일째에 8마리의 쥐(veh, n {0}}; 2FL, n=4)에서 선조체 조직을 수집했습니다. qRT-PCR로 M1/M2 염증 마커의 발현을 조사했습니다. ICH는 M1 마커 CD86(그림 5A, p{10}}.005)와 M2 마커 CD206 및 TGF(그림 5B, C, p{15}}.005)의 발현을 유의하게 증가시켰습니다. 2FL은 CD{18}}의 표현을 변경하지 않았습니다(그림 5A, p{20}}.356, 양방향 ANOVA). 그러나 병변 측에서 CD206(그림 5B)과 TGF의 발현을 유의하게 상향조절하였다(p < 0.05,="" nk="">
시스탄치 추출물의 이점
2.6. 2FL은 ICH 뇌에서 ER 스트레스 및 세포 사멸 마커의 표현을 변경했습니다.
ER stress 및 apoptotic marker의 발현은 8마리의 쥐에서 조사되었다(veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL은 PERK(그림6A, p{5}}.016), IRE1(그림6B, p{9}}.018), CHOP(그림6C, p{12}}.032) 및 SigmaR1의 발현을 현저히 감소시켰습니다. (그림 6D, p=0.017) 병변이 있는 선조체. 2FL은 BIP(그림6E, p{20}}.841) 및 ATF6(그림6F, p{24}}.403)의 발현을 변경하지 않았습니다. 또한, caspase3의 발현은 2FL에 의해 유의하게 감소되었습니다(그림 6G, p{30}}.029, t-test).
그림 5. 2FL은 ICH 뇌에서 M2 마커의 발현을 상향 조절했습니다. ICH는 (A) M1 마커 CD86, M2 마커 (B) CD2{13}}6 및 (C) TGF(# p=0.005, 양방향 분산 분석). (A) 2FL은 병변이 있는 선조체에서 (B) CD206 및 (C) TGF의 발현을 유의하게 상향조절했지만 (A) CD{12}}는 발현하지 않았습니다(* p < 0.05,="" nk="">
그림 6. 2FL은 ER stress와 apoptotic marker의 발현을 억제했습니다. (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 및 (G) caspase3의 발현은 출혈성 뇌에서 2FL에 의해 유의하게 억제되었습니다. (E) BIP 및 (F) ATF6의 발현은 2FL에 의해 변경되지 않았습니다. * p < 0.05.="" er,="" 소포체;="" perk,="" 단백질="" 키나제="" r-유사="" er="" 키나제;="" ire1,="" 이노시톨-요구="" 효소="" 1;="" chop,="" ccaat="" 인핸서-결합="" 단백질="" 상동="" 단백질;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" 수용체;="" atf6,="" 전사="" 인자="" 6="">
