파트 1: Verbascoside는 ER 스트레스로부터 췌장 세포를 보호합니다
Mar 05, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
알레산드라 갈리 1명, 파올라 마르시아니 1명, 알제르타 마르쿠 1명, 실비아 기슬란조니 1명, 페데리코 베르투치 2명, 라파엘라 로시 3명, 알레시아 디 지안카밀로 3명, 미켈라 카스타냐 1명, 칼라 페레고 1명,*
추상적인:
상당한 역학적 증거에 따르면 폴리페놀이 풍부한 식단은 제2형 당뇨병 발병을 예방합니다. 페닐에타노이드 배당체버바스코사이드/액테오사이드널리 퍼진 폴리페놀 식물 화합물은 강력한 항산화, 항염 및 신경 보호 활동을 포함한 여러 생물학적 특성을 가지고 있습니다. 이 연구의 목적은 가능한 효과를 테스트하는 것이 었습니다.버바스코사이드췌장 세포에서 이전에 테스트한 적이 없는 대상입니다. 마우스 및 인간 세포를버바스코사이드(0.8–16 uM) 최대 5일 동안 생화학 및 영상 기술의 조합을 사용하여 정상 또는 소포체(ER) 스트레스 유도 조건에서 세포 생존 및 기능을 평가했습니다. 우리는 의 용량 의존적 보호 효과를 발견했습니다.버바스코사이드클론 및 인간 세포의 산화 스트레스에 대한. 기계적 연구에 따르면 폴리페놀은 ER 스트레스 매개 기능 장애로부터 세포를 보호하여 단백질 키나아제 RNA 유사 소포체 키나아제(PERK) 분기의 활성화를 조절하고 미토콘드리아 역학을 촉진합니다. 그 결과, 이들 세포에서 증가된 생존력, 미토콘드리아 기능 및 인슐린 함량이 검출되었습니다. 이러한 연구는 다음과 같은 증거를 제공합니다.버바스코사이드- 세포 기능 장애 및 당뇨병 상태 실패의 중요한 기여자인 ER-스트레스에 대처하는 능력을 향상시키고 당뇨병에서 버바스코사이드의 치료 가능성을 지원합니다.
키워드:
버바스코사이드; 폴리페놀; 인슐린 생산 세포; 당뇨병; UPR; 산화 스트레스; 응급실 스트레스; 여과기; 항염증제; 미토콘드리아
1. 소개
당뇨병은 수억 명의 사람들에게 영향을 미치는 만성 질환입니다[1]. 다른 병인은 제1형(T1D) 및 제2형 당뇨병(T2D) 모두 인슐린 결핍을 특징으로 합니다[2]. 인슐린은 근육과 지방 세포에서 포도당 흡수를 자극하고 간 포도당 대사를 조절하는 혈장 포도당 농도를 조절합니다. 영양소 가용성, 호르몬 및 신경 입력은 췌장 인슐린 분비를 조절하고 생리적 범위 내에서 혈당 농도를 유지합니다[3-5]. 따라서, α-세포 기능 장애는 공복 고혈당을 특징으로 하는 당뇨병으로 이어진다.
T2D는 인슐린 저항성과 α-세포 오작동이 함께 연결된 진행성 상태이며, 최근 증거는 고혈당 상태에 대한 α-세포의 중요한 주요 역할에 대한 관심을 높였습니다[6,7]. 비당뇨병 비만 대상에서 세포는 호르몬 분비를 증가시켜 인슐린 저항성을 보상합니다. 그러나 일부 환자에서는 상태가 악화됨에 따라 인슐린혈증이 감소하고 포도당 수치가 고혈당증으로 상승합니다[8,9].
포도당은 α-세포 기능의 가장 중요한 조절자입니다. 포도당 자극은 해당과정, 인슐린 합성 및 분비와 같은 많은 세포 기능에 관여하는 유전자와 단백질의 발현 조절에 영향을 미칩니다. 포도당 유도 인슐린 분비는 산화 대사에 의존하여 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하고 낮은 수준의 활성 산소 종(ROS)이 생리학적으로 생성됩니다. 그러나 α-세포는 스캐빈저(scavenger) 효소가 잘 갖춰져 있지 않으며 이러한 약점으로 인해 산화 스트레스에 매우 취약합니다[11,12]. 산화 스트레스가 증가함에 따라 -세포 인슐린 생산이 감소하고 -세포는 염증과 세포자멸사를 통해 세포 손상을 유발하는 사이토카인을 생성합니다[13]. 흥미롭게도 감소된 α-세포 질량은 이전에 세포 사멸에 기인했지만 최근 연구에서는 세포 탈구분화의 주요 역할을 제안합니다[14,15]. 여러 단계가 T2D로 이동한다는 것이 분명해졌습니다. 대사 및 산화 손상은 소포체(ER) 스트레스를 유발하여 인슐린 합성 및 분비의 감소를 초래하고 염증 과정은 사이토카인의 방출을 따르며 세포자멸사 및 탈구분화를 통해 세포 손실이 발생할 수 있습니다. 이 지식은 산화 스트레스와 염증이 중화될 수 있고 췌장 세포의 가소성이 생쥐에서 입증된 바와 같이 줄기 세포를 -세포로 되돌릴 가능성을 허용하기 때문에 적절한 치료 전략을 개발하기 위해 기본적입니다[16].
최근에 산화 스트레스에 대한 α-세포의 취약성은 당뇨병 예방을 위한 식이 항산화제의 사용을 성공적으로 촉발했습니다[17]. 가장 흥미로운 항산화 식품 중 올리브 오일은 고대 그리스부터 유익한 특성으로 알려져 있습니다. 올리브 오일에는 다량의 단일불포화지방산(MUFA)과 티로솔, 하이드록시티로솔, 올레유로핀, 버바스코사이드와 같은 여러 폴리페놀이 포함되어 있습니다.
버바스코사이드acteoside라고도 알려진 Olea europea, Verbascum 종의 식물 및 23개의 다른 식물과에서 추출한 페닐에타노이드 배당체입니다[18-20]. 또한 올리브 오일 부산물(올리브 열매 가공에서 파생된 올리브 밀 폐수에 풍부함)에서 얻거나 대사 공학 및 합성 생물학 접근 방식으로 생산할 수 있습니다[21].
아직까지 인간의 버바스코사이드 생체이용률에 대한 데이터는 보고되지 않았습니다. 마우스, SKBR3 및 Caco{1}} 세포에 대해 수행된 연구에 따르면 대사되지 않은 verbascoside가 장 장벽을 통과하고 혈장을 순환하며 항산화 효과를 발휘하는 것이 가능할 수 있습니다[20,22,23]. 대부분의 식물 폴리페놀과 달리 verbascoside는 항산화 및 항염 효과와 함께 다양한 효소 및 조절 인자의 유전자 전사 조절을 통해 주로 세포에 작용합니다[24-30].
인간의 건강에 대한 verbascoside의 많은 유익한 효과가 알려져 있지만 췌장 세포에 대한 효과에 대한 데이터는 없습니다. 산화 스트레스와 염증은 T2D 발병의 기초이기 때문에 우리는 버바스코사이드 치료가 세포 생존력과
ER 스트레스 유도 조건에서의 기능과 우리는 그 작용의 분자 메커니즘을 특성화했습니다. 우리의 데이터는 버바스코사이드가 β-세포 산화 스트레스와 염증이 펼쳐진 단백질 반응의 활성화를 조절하고 미토콘드리아 역학을 촉진하여 α-세포 생존력과 인슐린 함량을 증가시키는 것을 보여줍니다.
2. 재료 및 방법
2.1. 세포 배양 및 재료
마우스 tc3 세포(Prof. Hanahan—Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA[31])를 RPMI 164{18}} 배지(Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italy) 10%(v/v) 열 비활성화 소태아 혈청(Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italy), 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italy) 및 1%(v/v) L-글루타민(EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italy). 랑게르한스의 인간 섬은 Ricordi et al. [32]; 이들은 5.5mmol/L 글루코스, 10% 열-불활성화 소태아 혈청, 0.7mM 글루타민, 50unit/mL 페니실린 및 50ug/mL 스트렙토마이신(EuroClone, SpA, Pero MI, Italy)을 포함하는 RPMI 배양 배지에서 배양되었습니다. 4개의 다른 섬 준비가 사용되었으며 섬 순도는 80 ± 10%였습니다. 섬 격리 및 섬 연구는 밀라노에 있는 Niguarda Ca' Granda 병원의 윤리 위원회에서 승인되었습니다(2009년 11월 12일). tc3 세포는 0.8, 1.6 및 16 uM 버바스코사이드(Carbosynth, OV08034, Compton, UK), 카페산 및 하이드록시타이로솔(Prof. Dell'Agli, Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Universita degli Studi di Milano, 밀라노, 이탈리아) 완전 RPMI 배지에서 5일 동안, 16 uM 버바스코사이드가 있는 인간 섬. 메탄올/에탄올 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 산화 스트레스를 유도하기 위해 세포를 분석 전 20분 동안 완전한 RPMI 배지에서 H2O2(Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM으로 처리하고 tunicamycin 2 ug/mL(T7765, Sigma Aldrich)로 처리했습니다. ) ER 스트레스를 유도하기 위해 7시간 동안 수행하였다.
2.2. MTT 시험에 의한 세포 생존율 검출
세포를 96개의 다중 웰 플레이트에 플레이팅하고 버바스코사이드 처리 5일 후 0.5 mg/mL MTT(3-(4,{6}}디메틸티아졸{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) 37 oC에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 대기에서 4시간 동안. 배양 후, 세포를 100 uL DMSO(Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italy)에 부드럽게 재현탁하고 마이크로플레이트 리더(Benchmark, 마이크로플레이트 리더, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, 미국) [33]. 실험은 삼중으로 수행되었고 데이터는 대조군 샘플에 대한 배수 증가로 표현되었습니다.
2.3. 유세포 분석에 의한 세포 사멸 검출
16μM 버바스코사이드와 함께 인큐베이션한 지 5일 후, α-세포를 트립신/EDTA와 함께 7분 인큐베이션하여 분리하고, 수집하고 원심분리했습니다. 펠렛을 인산염 완충 염수 저염에 부드럽게 재현탁시켰다. 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 MuseTM 카운트 및 생존 시약(Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA)으로 염색되었고 유세포 분석을 통해 분석되었습니다. 실험은 삼중으로 수행되었고 데이터는 전체에 대한 죽은 세포의 백분율로 표시되었습니다.
2.4. ROS 생성
세포내 ROS는 DCFDA(2/,7/-dichlorofuorescein diacetate)(Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA)로 평가되었으며, ROS에 결합될 때 형광이 되는 막 투과성 프로브입니다[34]. tc3 세포에는 Krebs-Ringer 완충액(125mM NaCl, 5mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 25mM HEPES-NaOH pH 7.4 및 2mM CaCl2)에 15uM DCFDA가 미리 로드되어 있습니다.
37 oC에서 1시간 동안 11 mM 포도당을 보충했습니다. ROS 함량은 마이크로플레이트 판독기(485/528 nm Ex/Em)(TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Switzerland)를 사용하여 기저 및 스트레스 조건에서 30분 동안 검출되었습니다. 평균값과 표준편차는 세 번의 독립적인 실험을 기반으로 했습니다.
2.5. 웨스턴 블로팅
tc3 세포를 수집하고 아프로티닌(Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF(Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) 및 Roche 억제제(Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) 4 oC에서 40분 동안. 단백질 농도는 Bradford Reagent(Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Bradford assay[35]에 의해 결정되었으며, 30ug의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분해하고 니트로셀룰로오스 막(Millipore, Burlington)으로 옮겼습니다. MA, 미국). 1차 항체는 5% 무지방 우유 또는 5% BSA 용액이 포함된 차단 완충액에서 2시간 동안 적용되었습니다. 다음 1차 항체가 사용되었습니다: 마우스 항{24}}액틴(Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), 마우스 항아크롤레인(Abcam, ab48501,Cambridge, UK), 마우스 항-BIP (Borgese Nica 교수의 친절한 선물, CNR, Milan, Italy), 토끼 항-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), 마우스 항-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), 토끼 항-포스포-IKB(Ser32)(Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), 마우스 항-IKB(Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), 토끼 항-포스포-NFKB p65(Ser 536)(Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), 토끼 항-NFkB p65(Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), 양 항-SOD1(Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), 토끼 항-PERK(Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), 토끼 항-eIF2(Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) 및 토끼 항-P-eIF2(Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). HRP 결합 이차 항체(Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 1:5000 희석으로 사용했습니다. 단백질은 Odyssey Fc Image system(LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Germany)을 사용하여 ECL 검출 시스템(Euro-Clone SpA, Pero MI, Italy)을 사용하여 검출되었고 밴드 밀도는 Image Studiow Lite 소프트웨어(LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. 실험은 삼중으로 수행되었고 데이터는 대조군 샘플에 대한 배수 증가로 표현되었습니다.
2.6. 미토콘드리아 막 잠재력
tc3 세포와 랑게르한스의 인간 섬을 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos(BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italy) 또는 100 uM MitoSpyw Green FM(BioLegend, 424805, Milan 7, Campoverde at 3)과 함께 배양했습니다. oC; 형광 강도는 마이크로플레이트 리더 TECAN Infinite⑧ F500(MitoSpyw Orange CMTMRos의 경우 551/576 nm Ex/Em, MitoSpyw Green의 경우 490/516 nm Ex/Em)(TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf)으로 감지되었습니다. 세포를 500 uM H2O2와 함께 20분 동안 배양하고 이전에 설명한 대로 형광 강도를 감지했습니다. 평균 값과 표준 편차는 세 가지 다른 실험을 기반으로 했습니다.
2.7. 미토콘드리아 형태 및 역학
tc3 세포에는 37oC에서 30분 동안 11mM 포도당 Krebs-Ringer 완충액에서 100nM MitoSpyw Orange CMTMRos(BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italy)가 미리 로드되었습니다. 샘플을 이미징 챔버에 배치하고 Axio Observer Z1 현미경(Zeiss, Oberkochen Germany)의 로단 필터를 사용하여 임의의 필드를 이미지화했습니다. 미토콘드리아 형태를 평가하기 위해 ImageJ 입자 분석기 소프트웨어를 사용하여 다음 매개변수를 분석했습니다. 면적(um2), 원형도(4mArea2/Perimeter2) 및 Feret의 최대 직경(um) [37].
시간 경과 실험을 위해 제어 또는 산화 스트레스 조건에서 30초 동안 초당 1프레임으로 단일 세포 이미징을 수행했습니다. 미토콘드리아 누적 거리(um2)를 측정하기 위해 먼저 사진 표백을 위해 이미지를 보정한 다음 기존 Image-Pro Plus 플러그인(객체 추적)(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)을 사용하여 동영상을 분석했습니다. 최대 12개
세포는 3개의 독립적인 실험에서 이미지화되었고 데이터는 평균값 및 표준 편차로 표시되었습니다.
2.8. 인슐린 분비
인간 분리된 랑게르한스 섬을 96-웰 플레이트에 웰당 20개 섬의 밀도로 시딩하고, 처리 5일 후 기저(3.3mM 포도당) 및 자극(16.7mM 포도당)에서 인슐린 함량 및 분비를 측정했습니다. ) ELISA 면역분석법(Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Sweden)에 의한 조건.
2.9. 통계 분석
모든 통계 분석은 독립적인 생물학적 복제물에 대해 GraphPad Prism 8.{1}}로 수행되었습니다. 두 그룹 간의 평균은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가되었으며 p-값 < 0.05는="" 통계적="" 유의성의="" 증거로="" 사용되었습니다.="" 3개="" 이상의="" 그룹="" 간의="" 평균을="" 분산="" 분석(anova)에="" 의해="" 비교한="" 후="" 다중="" 사후(tukey's)="" 비교="" 테스트를="" 수행했습니다.="" 사용된="" 통계="" 테스트,="" 정확한="" p="" 값="" 및="" 복제="" 수(n)는="" 개별="" 그림="" 범례에="" 표시됩니다.="" 그림의="" 오차="" 막대는="" 표시된="" 대로="" 평균="" ±="" sd="" 또는="" 평균="" ±="" se를="">
3. 결과
3.1. Verbascoside 개선 - 세포 생존력
세포에 대한 버바스코사이드 효과에 대한 데이터가 없었기 때문에 우리는 세포 생존력을 평가하기 위해 MTT 테스트를 수행했으며 그림 1A에서 볼 수 있듯이 긍정적인 용량 의존적 경향이 관찰되었습니다. 따라서 추가 연구를 위해 통계적으로 α-세포 생존력을 향상시키는 것으로 입증된 16 uM 농도를 선택했습니다. 유세포 분석을 통해 우리는 기본 조건에서 β-세포 생존에 대한 verbascoside 배양 5일이 미치는 영향을 연구했습니다.{21} } 500 uM H2O2로 최소 전처리. 기본 조건에서 버바스코사이드는 세포 생존에 영향을 미치지 않았으며, 이는 MTT 분석에서 관찰된 α-세포 생존력의 증가가 미토콘드리아 활성 개선으로 인한 것일 수 있음을 시사합니다. 반면, H2O2 노출 후 16μM verbascoside 전처리는 산화 스트레스로 인한 세포 사멸을 상당히 감소시켰습니다(그림 1B,C). Verbascoside는 가수분해 효소에 의해 변형될 수 있는 복잡한 분자입니다[18]. Verbascoside 대사 산물이 관찰된 보호 효과에 대한 책임이 있는지 여부를 테스트하기 위해 tc3 세포를 5일 동안 hydroxytyrosol과 카페산(0.8 및 16 uM)으로 처리했습니다. 두 대사 산물 모두 세포 생존력을 향상시키지 않았으며 반대로 H2O2 노출 후 더 관련성이 높은 세포 독성 효과가 16 uM 농도에서 감지되었습니다(그림 S1). 이 발견은 대사산물이 아니라 verbascoside가 H2O2 처리에 보호 효과를 발휘한다는 것을 증명합니다.
3.2. Verbascoside는 산화 환원 항상성을 조절하고 -세포에서 항염 효과를 발휘합니다
우리는 먼저 tc3 세포에서 다른 세포 유형에서 관찰되는 verbascoside의 항염 및 항산화 효과를 확인했습니다[24,29,34]. verbascoside ROS 소거 활성은 ROS 특이적 DCFDA(2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) 세포 투과성 프로브로 표지된 tc3 세포로 평가되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 기본 및 산화 스트레스 조건 모두에서 버바스코사이드 전처리 후 ROS 함량의 상당한 감소가 감지되었습니다.
웨스턴 블롯 분석은 버바스코사이드 처리된 세포에서 산화 스트레스 마커 아크롤레인 및 4-하이드록시노넨알(HNE) 발현의 유의한 감소를 보여주었습니다. 또한, 우리는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1) 발현의 증가를 발견했는데, 이는 버바스코사이드가 ROS 스캐빈저로서 직접적으로 그리고 항산화 효소의 발현을 유도함으로써 간접적으로 두 가지 다른 메커니즘으로 항산화 활성을 발휘함을 시사합니다(그림 2B,C).
세포에 대한 verbascoside의 항염 효과는 이 세포에서 가장 중요한 전 염증 경로인 NFKB 경로의 활성화를 평가하여 평가되었습니다[38]. 웨스턴 블롯 분석을 통해 우리는 핵인자 카파 B(IKB) 억제제와 핵인자 카파-경쇄 증강제(NFKB)의 발현 감소와 전처리된 세포에서 NFKB 인산화의 현저한 감소를 발견했으며, 이는 다음 가설을 뒷받침합니다. 세포 염증을 줄이기 위한 verbascoside 효능(그림 2D,E).
3.3. Verbascoside는 -세포의 펼쳐진 단백질 반응을 조절합니다
그런 다음 우리는 세포에서 대사 및 스트레스 신호의 핵심 센서로 부상하고 있는 소포체에 초점을 맞춰 버바스코사이드가 항산화 및 항염증 역할을 하는 분자 메커니즘을 심층 분석했습니다. 스트레스 조건에서 세포 소기관은 ER 기능을 회복하는 것을 목표로 하는 펼쳐진 단백질 반응(UPR)으로 알려진 항상성 반응을 탑재합니다. 그러나 이 경로의 과도한 활성화는 세포자멸사를 초래합니다[39,40].
증가된 ER 스트레스의 지표는 샤페론 단백질의 상향조절과 UPR 반응의 활성화입니다. Verbascoside로 처리된 세포의 웨스턴 블로팅 분석은 2개의 샤페로닌 열 충격 단백질 70(HSP70) 및 결합 면역글로불린 단백질(BIP)의 수준 감소를 나타냈습니다(그림 3A,B). 또한, 단백질 키나제 RNA-유사 ER 키나제(PERK) 발현의 현저한 감소 및 다운스트림 이펙터인 진핵생물 번역 개시 인자 2(eIF2)의 감소된 인산화가 검출되었습니다.
