파트 2: Acteoside는 C-Fos 유도 및 NF-KB 경로를 억제하고 ROS 생산을 약화시켜 RANKL 매개 파골세포 생성을 억제합니다
Mar 05, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
이승엽1,2., 이근수3.¤, 이세현2., 국성호, 이정채22,3*
악티오사이드대식세포에 의한 골 흡수 억제 Acteoside는 또한 시험관 내 모델 시스템에 의해 측정된 바와 같이 용량 의존적 방식으로 RANKL 매개 골 흡수를 방지했습니다(그림 3A). BMM을 1mM 악테오사이드와 함께 배양했을 때 뼈 흡수가 유의하게 억제되었습니다(그림 3B). 10mM 액테오사이드 처리는 BMM에 의한 RANKL 유도 구덩이 형성을 거의 완전히 약화시켰습니다. 유사하게, 악테오사이드는 RANKL로 자극된 RAW264.7 세포에서 골 흡수를 감소시켰다(그림 S2A 및 B). 골 흡수를 억제하는 acteoside의 능력은 RANKL 자극과 관련된 치료 시기에 따라 달라졌습니다. RANKL 자극 4일 후 추가된 Acteoside(10mM)는 BMM에서 구덩이 형성을 감소시키지 않은 반면, 형성된 파골세포의 수를 억제했습니다(그림 3C). 이 다른 결과는 부분적으로 RANKL 자극 형성 4일 후에 이미 형성된 구덩이 영역 때문이었습니다(그림 3D).
악티오사이드초기 RANKL 신호 전달 경로 하향 조절
RANKL은 파골세포 전구체에서 잘 알려진 3개의 MAPK와 NF-kB의 활성화를 유도하며, 이 활성화는 초기 파골세포 분화에 필요합니다. 가능한 메커니즘을 이해하려면악티오사이드파골세포 형성을 억제하는 효과를 조사했습니다.악티오사이드대식세포에서 MAPK 및 NF-kB 활성화 BMM 및 RAW264.7 세포를 2시간 동안 10mM 악테오사이드로 전처리한 다음 100ng/ml RANKL로 30분 동안 자극했습니다. MAPK 인산화는 웨스턴 블롯팅 및 면역측정 분석으로 조사하였다. RANKL은 BMM(그림 4A) 및 RAW264.7 세포(그림 4B)에서 p38, ERK 및 JNK의 인산화를 유도했습니다. Acteoside는 p-p38, p-ERK 및 p-JNK에서 이러한 RANKL 유도 증가를 방지했습니다. 이 결과는 10mM acteoside로 전처리한 것이 이러한 대식세포에서 인산화된 MAPK의 수준을 유의하게 억제한 면역측정 분석에 의해 뒷받침되었습니다(그림 4C). RANKL 처리는 NF-kB의 DNA 결합을 증가시킨 반면, 악테오사이드는 NF-kB-DNA 결합의 RANKL 유도 활성화를 억제하였다(도 5A). 이 억제는 RAW264.7 세포보다 BMM에서 더 두드러졌습니다. Acteoside는 또한 BMM과 RAW264.7 세포에서 RANKL로 자극된 p65와 IkBa 인산화를 감소시켰습니다(그림 5B 및 C). 10mM 액테오사이드를 첨가하면 BMM에서 IkBa의 분해와 활성화가 거의 완전히 억제되었습니다(그림 5B). NF-kB 활성화가 악테오사이드의 작용에 관여한다는 것을 추가로 확인하기 위해, kB 프로모터-루시페라제 구성물을 RAW264.7 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 100ng/ml RANKL과 함께 배양된 세포는 kB 프로모터 활성이 3-배 더 높았으며, 이는 10mM 악테오사이드에 의해 유의하게 약화되었습니다(그림 5D).
악티오사이드RANKL 자극 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성 및 TNF-a, c-Fos 및 NFATc1 발현을 억제합니다. TNF-a, IL{5}}b 및 IL{6}}은 파골세포 형성 및 RANKL 자극 대식세포에서 NF-kB 신호전달에 의해 매개되는 기능. RANKL은 이들 사이토카인의 생성을 자극하였고, 이 생성은 BMM에서 10mM 액테오사이드 전처리에 의해 현저하게 감소되었다(도 6A). 유사하게, 악테오사이드는 RAW264.7 대식세포에서 IL{12}}을 제외한 사이토카인의 RANKL 유도 생성을 약화시켰습니다(그림 S3). 파골세포 형성에서 acteoside 작용의 분자 메커니즘을 이해하기 위해 우리는 TNF-a, c-Fos 및 NFATc1 발현에 대한 acteoside의 효과를 추가로 조사했습니다. RANKL은 BMM 및 RAW264.7 세포에서 이들 인자의 mRNA 발현을 상향 조절하였다(도 6B 및 C). 10mM acteoside로 전처리하면 두 가지 모두에서 이러한 인자의 RANKL 유도 발현을 유의하게 억제했습니다.
BMM 및 RAW264.7 셀. Acteoside 전처리는 또한 RANKL로 자극된 BMM에서 c-Fos와 NFATc1의 단백질 수준을 크게 감소시켰습니다(그림 6D). 이러한 결과는 악테오사이드가 유전자 및 단백질 수준에서 파골세포 형성의 매개체를 유도하는 RANKL을 하향 조절함을 시사한다.
CISTANCHE 추출물: 악테오사이드
Acteoside는 용량 의존적 방식으로 BMM에서 세포 내 ROS 생성을 감소시킵니다
세포내 ROS 생성이 RANKL에 의해 자극된 파골세포 생성과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있기 때문에 세포 투과성 산화 민감성 염료인 DCFH-DA를 사용하여 RANKL 매개 파골세포 분화 동안 acteoside가 ROS 생성을 억제하는지 여부를 조사했습니다. 유세포 분석은 BMM에서 DCF에 특이적인 평균 형광 신호가 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 RANKL로 자극한 후 분명히 오른쪽으로 이동되었음을 보여주었다(그림 7A). 이 이동은 RANKL 자극 후 RAW264.7 대식세포가 관찰된 경우와 유사했습니다(데이터는 표시되지 않음). BMM을 악테오사이드로 처리하면 DCF의 신호 강도가 용량 의존적으로 감소했습니다. 10mM 액테오사이드로 전처리하면 파골세포 분화 동안 생성된 세포내 ROS 수준이 처리되지 않은 대조군 수준으로 거의 완전히 감소되었다(도 7B).
경구 Acteoside 투여는 난소 절제된 마우스에서 골다공증 생화학적 마커의 변경 및 골 손실을 억제합니다
뼈 손실에 대한 악테오사이드의 효과를 조사하기 위해 우리는 난소 절제술을 통한 골다공증 동물 모델을 준비했습니다. 실험 기간 동안 OVX와 Sham 마우스 사이의 체중에는 유의한 차이가 없었습니다(데이터는 표시되지 않음). OVX 그룹은 Sham 그룹보다 IL{0}}b 및 IL{1}}의 혈청 수준이 유의하게 더 높았습니다(그림 8). 이러한 염증성 사이토카인의 난소절제술 유도 증가는 경구 액테오사이드 투여(AC 그룹)에 의해 약화되었습니다. ALP, 칼슘, TRAP5b 및 OC와 같은 골 회전율 마커의 혈청 수준은 OVX 그룹에서 유의하게 증가했습니다. 이러한 골다공증 표지자 중 OVX 마우스에서 증가된 칼슘, TRAP5b 및 OC 수준은 분명히 acteoside 처리에 의해 억제된 반면, ALP의 혈청 수준은 처리에 의해 변화되지 않았다. 우측 대퇴골 간부의 평균 최대 골절 하중은 Sham 그룹보다 OVX 그룹에서 유의하게 낮았다(Fig. 9A). Acteoside 치료는 최대 골절을 다시 Sham 그룹의 골절로 높였습니다. 대퇴골의 피질골을 절개하여 광학현미경으로 관찰한 결과, AC 마우스에서는 OVX군에서 나타난 골다공증의 특징이 거의 완전히 사라졌다(Fig. 9B). OVX로 유도된 골다공증 모델에 대한 악테오사이드의 효과를 확인하기 위해 마이크로 CT를 통해 경부 대퇴골 섬유주의 골밀도와 골 형태학적 매개변수를 분석하였다. 도 9C에 도시된 바와 같이, 대퇴골 섬유주 구조의 변화가 OVX 마우스에서 발견된 반면, 이러한 변화는 악테오사이드 처리에 의해 감소되었다. micro-CT 분석 결과 골강도의 척도인 BMD가 OVX 마우스에서 극적으로 감소한 것으로 나타났습니다(그림 9D). Sham 그룹과 비교하여 OVX 마우스는 BV/TV, Tb에서도 상당한 변화를 보였습니다. Sp 및 Tb. N, 그러나 Tb.Th에는 없습니다. OVX 마우스의 경구 액테오사이드 치료는 BMD 뿐만 아니라 BV/TV 및 Tb.N.의 변경을 유의하게 방지했습니다.
Acteoside는 골수 세포의 조골세포 형성에 영향을 미치지 않습니다
조골 세포 분화에 대한 악테오사이드의 역할은 골수 세포를 사용하여 추가로 조사되었습니다. 도 10a에 나타난 바와 같이, DAG 처리는 alizarin red-stained 세포의 수를 증가시켰고 이는 10mM acteoside 전처리에 의해 변화되지 않았다. 존재하는 염료의 양은 결합된 악테오사이드와DAG 처리는 광물화를 변화시키지 않았다(그림 10B). 유사하게, Runx2, osterix, BSP 및 OC와 같은 뼈 특이적 마커의 세포내 칼슘 함량(도 10C) 및 mRNA 수준(도 10D)의 DAG 유도 증가는 악테오사이드 전처리에 의해 영향을 받지 않았습니다.
시스탄체 액테오사이드의 효과
논의
뼈 재형성은 조골세포에 의한 뼈 형성과 파골세포에 의한 뼈 흡수 사이의 균형에 의해 엄격하게 조절됩니다. 장기간의 과도한 골흡수는 골격 회전율의 불균형을 일으켜 골흡수 질환을 유발합니다. 파골세포 형성에 대한 악테오사이드의 효과를 조사하기 위해 우리는 2개의 대식세포, 1차 배양된 BMM 및 RAW264.7 세포를 사용했습니다.
이들 세포를 RANKL로 자극하여 악테오사이드의 존재 및 부재하에 파골세포로 분화시켰다. 우리는 acteoside가 파골세포 분화와 형성을 억제한다는 것을 처음으로 보여주었습니다. 조사된 농도에서 Acteoside 자체는 성장 및 분화 조건 모두에서 1차 배양된 대식세포의 생존력 감소를 일으키지 않았습니다.
Acteoside 치료는 또한 성숙한 파골세포의 흡수 활성을 감소시켰습니다. 이러한 결과는 acteoside가 대식세포로부터의 파골세포 형성과 파골세포 흡수 활성을 억제함을 시사한다. 조골 세포 또는 기질 세포를 포함하지 않는 배양 시스템의 결과는 또한 acteoside가 파골 세포 전구체에 직접 작용하여 파골 세포 형성을 방지한다는 것을 시사합니다.
RANKL은 p38, ERK 및 JNK를 포함한 MAPK를 활성화합니다. 이 3가지 키나제는 초기 파골세포 분화에 관여하므로 약리학적으로 또는 우성-음성 JNK 형질감염에 의한 억제가 RANKL 유도 파골세포 형성을 억제한다[29]. 우리의 결과는 acteoside 전처리가 이러한 모든 키나제를 억제하여 MAPK의 비특이적 하향 조절을 나타내는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 녹차의 주요 항염증 화합물인 EGCG가 RANKL로 자극된 BMM에서 ERK 또는 p38 활성화에 영향을 미치지 않으면서 JNK 활성화를 구체적으로 약화시킨다는 이전 보고서와 부분적으로 다릅니다[7]. 한약재에서 추출한 항염증 화합물인 Paeonol도 RANKL에 의해 자극된 RAW264.7 세포에서 ERK와 p38 인산화를 억제하지만 JNK는 억제하지 않는 것으로 보고되었습니다[30]. 대조적으로, 뼈의 새로운 억제제인 silibinin은 p38, ERK 및 JNK의 RANKL 유도 활성화를 약화시켰다[31]. 이러한 발견은 RANKL에 의한 MAPK 활성화에 대한 항흡수성 화합물의 효과가 화합물에 의존하지만, 세 가지 MAPK 모두가 초기 파골세포 형성에 관여함을 시사한다.
Acteoside가 p-JNK를 약화시킨다는 관찰을 고려하면
RANKL로 자극된 BMM의 수준은 1mM에서도 p38 MAPK 또는 ERK보다 JNK의 차단이 세포에서 악테오사이드 매개 항-파골세포 형성에서 더 특정한 이벤트인 것으로 나타났습니다. 동일한 농도의 악테오사이드가 BMM에서 파골세포의 수를 감소시키지는 않았지만, 악테오사이드 처리에 의한 구덩이 형성의 현저한 감소가 있었습니다. 우리는 또한 JNK에 특이적인 약리학적 억제제인 SP600125를 사용한 전처리가 파골세포의 형성을 극적으로 예방한다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 종합적으로, 이러한 발견은 JNK 매개 신호전달이 RANKL에 의해 자극된 파골세포 형성의 액테오사이드 매개 억제와 밀접하게 관련되어 있음을 시사한다.
NF-kB 신호는 세포 사멸, 세포 주기 진행, 세포 부착, 사이토카인 생산 및 대식세포의 생존을 포함한 세포 사건을 조절합니다[32]. NF-kB 신호전달은 파골세포 발달에도 필요하며, 이는 NF-kB 녹아웃 마우스에서 골화석증의 출현으로 입증되었습니다[33,34]. 따라서, NF-kB 억제는 파골세포 활성을 하향 조절하고 골다공증을 치료하기 위한 항흡수제의 효과적인 표적으로 제안된다. NF-kB 서브패밀리 단백질의 번역 후 변형은 NF-kB 활성을 조절하는 데 중요합니다. 특히 p65 subunit과 IkB kinase의 인산화는 NF-kB가 파골세포 형성을 유도하는데 중요하다[7]. 우리의 현재 발견은 RANKL 자극이 BMM과 RAW264.7 세포 모두에서 NF-kB의 DNA 결합 활성과 p65 소단위 및 IkBa의 인산화를 증가시키는 것으로 나타났습니다. Acteoside로 전처리하면 이러한 RANKL에 의한 증가가 억제되어 NF-kB 활성이 하향 조절됩니다. 결과적으로, 이러한 결과는 MAPK 외에도 NF-kB 신호전달이 RANKL 자극 대식세포로부터 파골세포 분화 및 형성을 억제하는 데 있어 악테오사이드의 주요 표적임을 시사한다.
NF-kB 신호 전달 외에도 c-Fos/c-Jun/NFATc1 경로는 파골 세포 발달에 중요한 역할을 하므로 이러한 단백질이 결핍되면 파골 세포 생성이 중단될 수 있습니다[35,36]. 이 연구에서 우리는 acteoside가 mRNA와 단백질 수준에서 RANKL에 의해 유도된 c-Fos와 NFATc1 발현을 방지한다는 것을 발견했습니다. JNK는 RANKL에 대한 반응으로 NFATc1 발현 및 파골세포 형성에 필요한 c-Jun의 업스트림 키나제이다[29].
정크 억제제로 theJNK/c-Jun 경로를 차단하면 RANKL 유도 파골세포 형성과 c-Fos 및 NFATc1 발현이 감소된다[7]. 우리의 결과와 이전 연구 결과는 악테오사이드에 의한 JNK 매개 신호 억제가 RANKL 매개 c-Fos 및 NFATc1 예방과 밀접한 관련이 있음을 시사합니다.대식세포에서 파골세포 분화를 억제하는 발현. BMM과 RAW264.7 세포에 대한 악테오사이드 효과의 차이는 적어도 부분적으로는 JNK 억제에 대한 민감도의 차이 때문입니다.
TNF-a는 RANKL-RANK 신호와 무관하게 파골세포 형성을 유도할 수 있습니다[37]. IL-1은 에스트로겐 결핍이나 염증에 의해 유발되는 병적 뼈 파괴의 강력한 매개체입니다[7]. I형 IL{5}} 수용체 또는 IL{6}} 신호 전달을 방해하면 난소 절제술[38] 또는 류마티스 관절염[39]으로 유발된 골 손실을 역전시킬 수 있습니다. 이 연구는 악테오사이드가 대식세포에서 TNF-a, IL{10}}b, IL{11}}과 같은 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키는 능력을 입증했습니다. Acteoside는 ERK1/2, p38 MAPK 또는 둘 모두의 활성화가 대식세포에서 이들 사이토카인의 지질다당류 유도 생성에 필요하기 때문에 p38 키나아제 및 ERK 신호전달을 억제함으로써 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 것으로 생각됩니다[40,41]. 염증성 화합물인 루테올린(Luteolin)도 p38 MAPK 활성화를 억제하여 염증 매개체의 생성을 억제하는 것으로 보고되었습니다[42]. 이 연구에서 우리는 또한 오른쪽 대퇴골의 중간 샤프트에서 회복된 최대 골절력과 골다공증성 피질골의 소실에 의해 입증된 바와 같이, 악테오사이드가 난소 절제된 마우스에서 뼈 손실을 약화시킨다는 것을 발견했습니다. 경구 액테오사이드 투여는 난소 절제로 유도된 혈청 IL{24}}b 및 IL{25}} 수준의 증가를 하향 조절했지만 ALP는 그렇지 않았습니다. OVX에서 칼슘, TRAP 및 OC의 증가된 혈청 수준은 또한 악테오사이드를 사용한 경구 치료에 의해 억제되었으며, 이는 악테오사이드가 골 형성 및 흡수에 특이적인 바이오마커의 변경을 약화시킨다는 것을 시사합니다. 골다공증은 감소된 질량 밀도와 악화된 소주골 미세구조를 특징으로 하기 때문에 OVX에 의한 소주골 손실 및 형태학적 매개변수 변경은 경구 액테오사이드 투여에 의해 유의하게 억제되었습니다. 이러한 발견은 acteoside가 불균형 파골세포 활성화를 역전시켜 골다공증을 치료하기 위한 항흡수제로 사용될 수 있음을 시사합니다. 그러나 조골세포는 새로운 뼈 형성을 담당하는 주요 요인입니다. 따라서 골 형성을 향상시키기 위해서는 조골세포 증식 또는 분화를 증가시킬 수 있는 제제가 필요하다[30]. 대조적으로, 우리는 acteoside가 DAG 처리된 골수 세포에서 조골 세포 분화 또는 광물화에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다. 종합하면, 우리의 결과는 악테오사이드가 항흡수 효과가 있지만 뼈 형성에 직접적인 영향을 미치지는 않는다는 것을 시사합니다. 액테오사이드가 조골 형성에 도움이 되는지 여부를 명확히 하기 위해서는 생체 내 및 시험관 내에서 뼈 특이적 매개변수를 분석하는 보다 상세한 실험이 필요합니다.
현재의 연구는 MAPK 및 NF-kB, c-Fos 및 NFATc1과 같은 여러 전사 인자를 억제함으로써 파골세포 분화 및 골 흡수에 대한 악테오사이드의 억제 효과를 강조합니다. 데이터는 acteoside가 이러한 이점을 갖는 두 가지 가능한 메커니즘을 제안합니다.
CISTANCHE ECHINACOSIDE 및 ACTEOSIDE는 골다공증을 치료할 수 있습니다
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