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이러한 발견을 바탕으로 우리는 다음으로 공간 학습 시 마우스에서 해마 miR{0}}f{1}}p 발현이 상향 조절되는지 조사하고메모리형성은 또한 생체내 뉴런 형태에 영향을 미쳤다. 중요하게도, 우리는 피라미드의 골지 함침에 의해 밝혀진 바와 같이 GLN 마우스의 해마 뉴런의 평균 척추 밀도가 PLN 마우스의 평균 척추 밀도보다 높다는 것을 발견했습니다.

그림 3. 해마 miR-466f-3p 발현 수준의 변경이 마우스 MWM 성능에 미치는 영향

(A) 렌티바이러스 주입 후 마우스 뇌의 MWM 작업, 발현 분석 또는 전기생리학 측정의 실험적 타임라인.

(B) 왼쪽 패널: 마우스 해마에서 dsRed의 발현. 대조군으로 dsRed만 표시(이미지의 왼쪽 열) 또는 miR-466f{5}}p와 dsRed(오른쪽 이미지 열). 상단 두 이미지의 박스 영역이 확대되어 아래에 표시됩니다. 스케일 바, 100mm. 점선은 DG의 경계를 나타냅니다. 핵은 DAPI로 염색되었습니다. GCL, 과립 세포층; ML, 분자층. 오른쪽 히스토그램, RT-qPCR( 그룹당 n=16).

(C) dsRed-only, miR{1}}f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p 및 miR/SCR-sponge를 각각 해마에 넣습니다(각각 그룹당 n=13, 26, 16, 19 및 11). 왼쪽 패널: 훈련 중 탈출 대기 시간. 오른쪽 패널: 6번째 세션의 개별 탈출 대기 시간.

(B)에 표시된 데이터는 평균 ± SD로 표시되고 (C)에 표시된 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 통계적 의미는 쌍을 이루지 않은 t 검정(B), Bonferroni 사후 비교를 사용한 양방향 ANOVA(C, 왼쪽 패널) 또는 Tukey의 사후 검정을 사용한 one-ANOVA(C, 오른쪽 패널)에 의해 평가되었습니다. 통계적 차이: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" 및="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f{10}}p="" vs.="" #mir-스폰지="" 대="">

GLN 및 PLN 마우스 해마의 뉴런(그림 S3). 이러한 발견은 해마 miR{1}}f{2}}p의 상향 조절이 신경돌기 성장과 수지상 척추 형성을 촉진한다는 것을 보여주며, 이는 PLN 마우스에 비해 GLN 마우스의 해마에서 관찰되는 척추 밀도의 유도와 유사합니다.

miR{0}}f{1}}p는 마우스 공간 학습을 긍정적으로 조절하고메모리성능 및 시냅스 가소성

miR{0}}f{1}}p가 마우스 공간 학습을 긍정적으로 조절하는지 여부를 조사하고메모리형성, 우리는 마우스 해마에서 miRNA를 과발현하기 위해 재조합 렌티바이러스 감염 접근법을 사용했습니다. 마우스는 DG에 렌티바이러스 주사 7일 후에 분석되었습니다(그림 3A). miR-466f-3p의 엉덩이 발현 수준의 대표적인 이미지는 대조군에 비해 miR-466f-3p 과발현 그룹에서 실제로 상승했습니다(오른쪽 히스토그램 그림 3B). miR-466f- 3p의 해마 과발현이 있고 MWM 작업을 받은 마우스는 첫 번째 세션에서 88 ± 5초, 여섯 번째 세션에서 19 ± 1초의 탈출 대기 시간을 나타냄을 발견했습니다(빨간색 점선, 그림 3C)는 벡터 제어 마우스(검정색 선) 또는 돌연변이 제어 마우스(빨간색 원 선)보다 우수하고 그림 1A에 설명된 GLN 마우스의 탈출 대기 시간과 유사합니다. 동시에 우리는 공간 학습에 대한 miR{18}}f{19}}p 기능 손실의 영향을 조사했으며메모리miR-sponge를 사용하여 miR{0}}f{1}}p를 억제합니다. 특히, miR-sponge에 의해 해마 miR-466f-3p가 갇힌 마우스의 MWM 성능은 PLN 마우스의 MWM 성능과 유사했습니다. 마지막 세션(실선 녹색 사각형,

그림 3C). 또한, 렌티바이러스를 주입한 마우스는 각 그룹의 일부 마우스가 마지막 세션 동안 학습했거나 적어도 학습 과정에 있었기 때문에 항상성 가소성을 방해한 것으로 보이지 않았습니다(그림 3C, 오른쪽 히스토그램).

쥐의 해마에서 miR{0}}f{1}}p의 과발현이 학습을 향상시키고메모리기능을 사용하여 다양한 수준의 miR{0}}f{1}}p를 발현하는 배양된 해마 뉴런의 비교 전기생리학을 분석했습니다. miR-466f{4}}p 또는 mut-miR-466f-3p, miR-sponge 또는 대조군을 과발현하는 DIV14 해마 뉴런의 소형 흥분성 시냅스 후 전류(mEPSC)는 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 기록했습니다. 4개의 샘플 세트 간에 mEPSC 진폭, 상승 Tau 또는 감쇠 Tau에는 유의한 차이가 없었지만 miR{11}}f{12}}p를 과발현하는 뉴런의 mEPSC 주파수는 다른 그룹(그림 4A)은 시냅스 후 글루타민성 수용체가 miR{14}}f{15}}p 과발현 시 더 강력하게 활성화되었음을 나타냅니다.

그런 다음 생체 내 시냅스 가소성에서 miR{1}}f{2}}p의 역할을 직접 결정하기 위해 장기 강화(LTP)를 측정했습니다. 그림 3에 설명된 바와 같이 재조합 렌티바이러스로 쥐의 해마에 주사한 다음 Schaffer 측부 경로의 파상풍 자극(고주파 자극 [3xHFS]의 3열)에 의해 LTPin 해마 슬라이스를 유도했습니다. 우리는 우리의 프로토콜이 모든 그룹에서 LTP를 유도한다는 것을 발견했습니다. 이는 각질층 1(CA1) 영역에서 필드 흥분성 시냅스 후 전위(fEPSP)의 지속적인 증가에 의해 입증되었습니다(그림 4B, 왼쪽 패널). LTP는 돌연변이(169% ± 1%)에 비해 miR{9}}f{10}}p-과발현 슬라이스(자극 후 40~50분에 기준선의 188% ± 2%, 평균 ± SEM)에서 더 강력했습니다. 기준선의), SCR-스펀지(기준선의 173% ± 3%) 및 대조군 바이러스에 감염된 슬라이스(기준선의 159% ± 2%), miR-466f{26}}p 억제 miR-스폰지는 대조군에 비해 LTP(기준선의 128% ± 1%)를 감소시켰습니다(그림 4B, 오른쪽 패널). 또한 훈련 후 GLN 및 PLN 그룹의 LTP를 측정했습니다. 각각의 데이터는 또한 GLN 그룹과 PLN 그룹 사이의 CA1 영역에서 fEPSP 기울기의 상당한 차이를 나타냈습니다(그림 4C). 따라서 miR{33}}f{34}}p의 높은 수준은 LTP와 시냅스 가소성을 향상시켜 차례로 학습을 촉진하고메모리쥐의 능력. 함께 그림 2, 3, 4에 제시된 데이터는 miR-466f{4}}p가 공간 학습 및메모리척추 형성, LTP 및 시냅스 가소성의 강도를 향상시킴으로써 형성.

Mef2a mRNA는 miR-466f-3p의 규제 대상입니다.

miR{0}}f{1}}p가 30개의 UTR에 결합하여 조절되는 잠재적인 표적 mRNA를 식별하기 위해 생물정보학 분석을 수행했습니다. 우리가 식별한 후보 중에는 MEF2A를 인코딩하는 Mef2a mRNA가 있었습니다. 흥미롭게도, MEF2A 발현은 이전에 MWM 훈련 후에 하향 조절되는 것으로 밝혀졌으며 이 인자의 과발현은 마우스의 성능에 부정적인 영향을 미쳤습니다(Cole et al., 2012). 따라서 우리는 miR-466f{8}}p가 30 UTR에 결합하여 Mef2a mRNA의 번역을 조절하는지 조사하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 사용했습니다. 야생형 또는 돌연변이 Mef2a 30 UTR 서열을 SV{14}}프로모터 구동 루시퍼라제 cDNA(Luc)의 다운스트림에 삽입하여 리포터 플라스미드 psiCHECK{16}}MEF2A 30 UTR 또는 psiCHECK{19}} mut-MEF2A 30 UTR(그림 5A). 그림 5B의 왼쪽 히스토그램에서 볼 수 있듯이 miR{26}}f{27}}p의 동시발현은 Mef2a 30 UTR이 지시하는 luciferase의 발현을 약화시켰습니다. 이 효과는 miR-466f{35}}p의 예측된 결합 부위 중 하나의 돌연변이 때문에 miR-466f{31}}p와 Mef2a 30 UTR 간의 상호작용에 의존하는 것으로 나타났습니다. Mef2a 30 UTR(50-UGU-GUAU-30) 또는 miR{41}}f{42}}p(50-AUACACA-30)의 시드 영역 Mef2a 30 UTR을 인식하면 루시퍼라제 활성에 대한 miR{47}}f{48}}p의 억제 효과가 폐지되었습니다(그림 5B, 중간 히스토그램). 또한 CR 스폰지가 아닌 miR-스폰지의 동시 발현은 루시퍼라제 활성에 대한 miR-466f{53}}p의 억제 효과도 제거했습니다(그림 5B, 오른쪽 히스토그램). 특히 miR-466f-3p의 과발현이나 miR-sponge의 과발현은 1차 해마 뉴런에서 Mef2a mRNA 수준에 영향을 미치지 않았지만(그림 5C), 각각 감소하거나 증가했습니다. MEF2A 단백질 수준(그림 5D). 우리는 또한 각각 miR{62}}f{63}}p 또는 miR-sponge의 과발현이 일차 해마 뉴런에서 활성 조절된 세포골격 관련 단백질(Arc)의 mRNA 수준을 하향 조절하거나 상향 조절한다는 것을 발견했습니다(그림 5C) MEF2A에 의해 긍정적으로 조절되는 알려진 다운스트림 표적이었습니다(Flavell et al., 2006)

우리는 또한 miR{0}}f{1}}p를 감지하기 위해 형광 제자리 교잡(FISH)을 수행하고 포스콜린 치료 없이 또는 포스콜린 치료 없이 DIV14 1차 해마 뉴런에서 MEF2A의 IF 라벨링과 결합했습니다. Forskolin은 화학적 LTP를 유도하고 adenylyl cyclase를 활성화하여 세포 내 cAMP 수준을 높이는 것으로 알려져 있습니다. 그림 5E의 대표 이미지에서 볼 수 있듯이 miR-466f- 3p를 사용한 MEF2A의 핵 공동 국소화를 관찰했습니다. 그러나 포스콜린 자극 후 miR-466f-3p 신호는 체세포와 수상돌기 모두에서 증가한 반면 MEF2A 신호는

개별 신경 세포의 MEF2A 및 Fast Red 신호 강도의 상호 변화에 의해 나타난 바와 같이 핵이 감소했습니다(그림 5E). 요약하면, 그림 5A-5E의 데이터는 miR-466f{5}}p가 Mef2a mRNA의 30 UTR에 결합하여 결과적으로 그 번역을 억제함으로써 MEF2A 단백질의 발현을 부정적으로 조절함을 나타냅니다.

위에서 설명한 결과와 일치하게, 우리는 MWM 훈련 후 GLN 마우스에서 MEF2A 단백질의 해마 수준이 하향 조절되었지만 PLN 마우스에서는 그렇지 않다는 것을 발견했습니다(그림 5F). 또한, 개별 GLN 마우스(점) 및 PLN 마우스(사각형)에서 MEF2A의 상대적 수준은 miR-466f{5}}p(R=0.60, 그림 5G). 따라서 공간 학습의 이질적인 패턴과메모리능력은 개별 마우스에서 해마 miR{0}}f{1}}p의 확률적 증가와 신경 활동 자극 시 MEF2A의 결과적인 감소에 의해 조절됩니다.

MWM 훈련 중 해마 CREB의 확률적 활성화 및 그에 따른 miR{0}} 클러스터의 전사 상향 조절

마우스 해마의 miR{0}}f{1}}p가 MWM 작업에 의해 확률적으로 상향 조절될 수 있는 메커니즘을 조사했습니다. miR{2}}f{3}}p를 인코딩하는 3개의 miRNA 전구체가 있으며, 모두 숙주 유전자 mSfmbt2의 인트론 10에 위치한 설치류 특이적 miR{5}} 클러스터에 속합니다(Inoue et al ., 2017) (그림 6A). 흥미롭게도 miR{10}}f{11}}p와 달리 GLN 그룹과 PLN 그룹 사이에 mSfmbt2의 발현 수준에는 큰 차이가 없었으며(그림 6B), 이는 miR{14}} 클러스터가 별도의 스크립트를 인코딩할 수 있음을 시사합니다. mSfmbt2의 기본 사본의 일부가 되는 대신. 따라서 우리는 RT-qPCR로 miR{16}} 클러스터의 추정 1차 전사체를 식별하기 위해 여러 프라이머 세트를 설계했습니다. 도 6A에 도시된 바와 같이, 긴 PCR 단편(플러스 282 ~ 2,381)과 일련의 겹치는 qPCR 밴드, 즉 A( 플러스 282 ~ 115), B( 131 ~ 406), C( 388 ~ 686), D ( 662 ~ 1,028), E ( 1,004 ~ 1,299), F ( 1,242 ~ 1,629 ), G ( 1,605 ~ 2,029 ), H ( 2,005 ~ 2,381 ) 는 마우스 해마에서 감지될 수 있었지만 2,37 부분 I ) (데이터는 표시되지 않음). 이러한 데이터는 miR{51}} 클러스터가 첫 번째 miRNA 전구체(즉, pre-mir{55}}m, 그림 6A에서 1로 표시됨)의 약 2,388bp 상류 부근에서 긴 전사체를 인코딩했음을 뒷받침합니다. 놀랍게도 miR{58}}f{59}}p에서 찾은 것과 유사하게 GLN 마우스의 해마에서 이 전사체의 평균 수준은 PLN 마우스보다 높았습니다(그림 6C). 따라서 향상된 학습과메모리GLN 마우스의 기능은 miR{0}} 클러스터의 전사 활성화 때문입니다.

MWM 작업 또는 다른 형태의 학습 중 인산화에 의한 핵 CREB의 활성화는 단기를 장기로 전환하는 데 중요한 단계입니다.메모리(Lisman et al., 2{26}}18; Rogerson et al., 2014). 따라서 MWM 작업을 수행한 개별 마우스 간의 다양한 수준의 miR-466f-3p가 CREB의 활성화 상태와 상관 관계가 있는지 조사했습니다. 이 아이디어를 탐구하기 위해 먼저 개별 마우스에서 해마 CREB의 인산화 수준을 조사했습니다. 그림 6D에 표시된 것처럼 CREB 활성화(잔기 S{6}}에서의 인산화에 의한)는 PLN 및 HC 마우스에 비해 GLN 마우스에서 향상되었습니다. 또한 miR-466f{8}}p가 일차 해마 뉴런에서 pCREB 및 MAP2의 IF 염색과 결합된 miRNA ISH를 수행하여 뉴런에서 pCREB와 실제로 공동 발현된다는 것도 확인했습니다(그림 S2A). 또한 miR{12}} 클러스터의 기본 전사 수준은 GLN 마우스에서 pCREB와 양의 상관관계가 있는 반면(R=0.52), PLN 마우스에서는 pCREB와 음의 상관관계가 있었습니다(R=0 .71) (그림 6E). 다른 활성 인자인 pERK(phospho-extracellular signal-controlled kinase) 수준과 miR{21}} 클러스터의 기본 전사 수준 간의 상관관계를 확인했습니다. 우리는 두 유형의 MWM 훈련된 마우스가 miR-466-669 클러스터 신호와 pERK 사이에 양의 상관관계를 나타냄을 발견했습니다(각각 R=0.59 및 0.48, 그림 S4A), pERK/ 이 두 그룹 간의 tERK 발현(그림 S4B). CREB 활성화가 miR 클러스터의 전사 상향조절에 미치는 영향을 더욱 명확히 하기 위해{30}결과적으로,

InductionofmiR{0}}f{1}}p,weusedaspecific CREBinhibitor,{2}}(Xie et al., 2015), DIV14 원발성 해마 뉴런의 포스콜린 치료와 함께. 포스콜린은 CREB 인산화를 활성화하는 것으로 알려져 있습니다(Malhotra et al., 2015). 666-15로 일차 해마 뉴런을 전처리하면 포스콜린 유도 CREB 활성화가 차단되고(그림 6F) miR{9}}f{10}}p 및 miR{11}} 클러스터 수준이 감소한다는 사실을 발견했습니다. 전사체(도 6G 및 6H). 동시에, 알려진 pCREB 표적 유전자 nurr1 및 homer1a(Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017)의 mRNA 수준도 666-15 처리 시 감소했습니다(그림 6H). 종합하면, 그림 6은 MWM 작업을 수행하는 근친교배 마우스의 부분집단의 해마에서 CREB의 확률적 활성화가 miR{21}} 클러스터의 전사를 유도하고 결과적으로 miR{22}}f{23 }}p, 따라서 공간 학습을 향상시키고메모리작업을 더 잘 수행할 수 있는 능력.

논의

우리는 공간 학습의 다양한 능력을 조절하는 miRNA의 가능한 역할을 탐구하고메모리근친 교배 C57BL/6J 마우스 중에서. 우리는 CREB의 확률론적 활성화와 그에 따른 해마 miR-466f{3}}p의 상향 조절이 더 큰 공간 학습 및메모리miR{0}}f{1}}p가 인코딩하는 Mef2a mRNA의 번역 억제를 매개하기 때문일 가능성이 있음메모리네거티브 레귤레이터 MEF2A. 우리의 발견은 환경 자극에 의한 CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A 축의 확률적 유도를 통해 인지를 조절하는 특정 miRNA의 기능적 및 진화적 역할을 보여주는 시나리오를 제공합니다.

MWM 작업은 공간 학습의 다양한 능력을 조사하고메모리설치류를 위해. 정상적인 조건에서 설치류는 원위 신호를 사용하여 방향을 지정하여 작업에서 숨겨진 플랫폼의 위치를 ​​배우고 기억할 수 있습니다. 대부분의 테스트 근친교배 C57BL/6J 마우스(62%)는 정상적인 탈출 지연 패턴을 나타내어 세션 3{5}}까지 3초 이내에 플랫폼을 찾았습니다(그림 1A, GLN). 대조적으로, 쥐 그룹(38%)은 6차 세션(PLN)까지 작업을 학습하지 않았습니다. 특히, 우리는 쥐에게 두 가지 다른 인식 테스트를 실시했습니다. 첫 번째는 새로운 대상 인식(NOR) 테스트로, 행동을 동기를 부여하기 위해 강화나 스트레스 없이 타고난 탐색을 기반으로 하는 단일 시도입니다(Leger et al., 2{18}}13). 마우스 성능 측면에서 NOR와 MWM 작업 간의 상관 관계는 좋지 않으며(R {{1{{20}}}}.13), 이는 NOR 성능과 해마 발현 수준 간의 상관 관계와 유사합니다. miR{12}}f{13}}p(R=0.01, 데이터는 표시되지 않음). NOR 테스트는 또한 MWM GLN과 PLN 그룹 간의 식별 지수에 차이가 없음을 보여주었습니다(0.36 ± 0.25 대 0.29 ± 0.18, 그림 S1B). 다른 공간 학습 및메모리- 우리가 적용한 종속 작업은 MWM과 유사한 Barnes maze(BM)입니다. 이것은 혐오스러운 환경에 놓인 설치류가 플랫폼 표면 아래에 위치한 탈출 상자의 위치를 ​​배우고 기억해야 한다는 가정에 기반합니다. 그림 S1C에서 볼 수 있듯이 BM 프로브 실험에서 마우스 성능은 miR-466f-3p의 해마 발현 수준과도 양의 상관관계가 있음을 발견했습니다. 따라서 학습 동안 해마에서 CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A 축의 유도 및메모리형성은 공간적으로 상황에 따라 다릅니다.