파트 2 Echinacoside는 쥐의 대뇌피질 신경 말단에서 전압 의존성 Ca2와 단백질 키나제 C를 억제하여 글루타메이트 방출을 억제합니다
Mar 07, 2022
파트 2 Echinacoside는 쥐의 대뇌피질 신경 말단에서 전압 의존성 Ca2와 단백질 키나제 C를 억제하여 글루타메이트 방출을 억제합니다
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3. 토론
이 연구에서 활성 화합물인 에키나코사이드는허바 시스탄체,{0}}쥐의 대뇌 피질 신경 말단에서 아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 억제했습니다. 글루타메이트 방출의 echinacoside 매개 억제에 대한 가능한 기본 메커니즘은 여기에서 추가로 조사되고 논의됩니다.
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3.1. 글루타메이트 방출의 에키나코사이드 매개 억제의 기초 메커니즘 글루타메이트 방출
4-아미노피리딘에 의해 유발되는 두 가지 구성요소는 다음과 같습니다. 생리학적으로 관련된 Ca2 플러스 의존성 구성요소는 글루타메이트를 함유하는 시냅스 소포의 엑소사이토시스를 통해 생성됩니다. 및 Ca2+-독립적 구성요소는 장기간의 탈분극으로 인해 막 전위 매개된 글루타메이트 수송체 정상 상태의 외부 방향으로의 이동을 유발하여 세포질 글루타메이트 유출에 영향을 미칩니다[31]. 여기에서 우리는 다음을 관찰했습니다.에키나코사이드Ca2+가 없는 배지(Ca2+-독립적 방출)의 존재하에서 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 유의하게 억제하지 않았습니다. 또한 관찰된에키나코사이드4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출의 매개된 억제는 바필로마이신 A1(시냅스 소포의 글루타메이트 함량을 고갈시킴)에 의해 효과적으로 방지되었지만 DL-TBOA(모든 흥분성 아미노산 수송체 아형을 비선택적으로 억제함)에 의한 것은 아닙니다. 이러한 결과는에키나코사이드신경 말단 원형질막 글루타메이트 수송체의 역전을 통해 글루타메이트의 Ca2 플러스 독립 세포질 유출에 영향을 미치지 않으면서 글루타메이트 방출의 Ca2 플러스 의존성 엑소사이토시스에 영향을 미친다. 시냅스 말단에서 Na+채널 억제 또는 K+채널 활성화는 막 흥분성을 안정화시키고 결과적으로 유발된 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 감소시킨다[32,33]. 따라서 잠재적인 메커니즘은에키나코사이드-매개된 글루타메이트 방출 억제는 시냅토솜 흥분성의 감소를 포함합니다. 그러나 이러한 가능성은 두 가지 관찰에 근거하여 지지할 수 없습니다. (1) 4- 아미노피리딘 유발 막 전위 탈분극, 막 전위에 민감한 염료 DiSC3(5)로 측정한에키나코사이드; (2) echinacoside는 4-아미노피리딘에 의해 유발된 Ca2와 막 전위에만 의존하는 방출 성분인 글루타메이트 방출에 영향을 미치지 않았습니다[31]. 효과가 시냅토솜 흥분 억제에 의한 것이 아니라면, Cav2.2(N-형) 및 Cav2.1(P/Q-형) Ca2 플러스 채널의 활성 감소를 통해 나타날 수 있습니다. 신경 말단 [34-36]. fura{15}}를 사용하여에키나코사이드4-아미노피리딘 유발 Ca2 플러스 농도 증가를 크게 감소시킵니다. 또한, 우리의 데이터는에키나코사이드4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출은 Cav2.2(N형) 및 Cav2.1(P/Q형) Ca2 차단제에 노출된 후 42.4%에서 2.3%에서 12.1%로 3.9% 감소했습니다. 플러스 채널. 또한 우리는 다음을 관찰했습니다.에키나코사이드세포 내 Ca2와 방출 억제제의 존재에서 4-아미노피리딘 유발 글루타메이트 방출을 유의하게 계속 억제했습니다. 이러한 결과는 Cav2.2(N형) 및 Cav2.1(P/Q형) Ca2 + 채널 활성의 동시 억제가 잠재적인 메커니즘임을 나타냅니다.에키나코사이드-매개된 글루타메이트 방출 억제. 그러나 Cav2.2(N-형) 및 Cav2.1(P/Q-형) Ca2 + 채널 활성의 결합된 활성화는 의 작용을 차단할 수 없었습니다.에키나코사이드완전히. 따라서 다른 미확인 유형의 Ca2 플러스 채널 또는 다른 시냅스 전 경로가 억제에 관여할 수 있습니다. 예를 들어, GABAA 수용체는 시냅스 전 수준에 존재하며 이들의 활성화는 Ca2와 유입 및 글루타메이트 방출을 억제하는 것으로 나타났습니다[37]. 현재의 연구에서 GABAA 수용체 길항제 SR95531과 비쿠쿨린은 에키나코사이드 매개 글루타메이트 방출 억제를 차단하지 않았으며, 이는 GABAA 수용체가 전압 의존성 Ca2 플러스 채널 활성의 감소와 글루타메이트 방출의 후속 억제에 관여하지 않는다는 것을 시사합니다.
전압 의존성 Ca2 플러스 채널을 통한 Ca2 플러스 진입은 mitogen-activated protein kinase, protein kinase C 및 protein kinase A를 포함한 신경 말단에서 글루타메이트 방출과 관련된 여러 단백질 키나제를 활성화합니다. 여기에서 우리는 protein kinase C 억제제가 효율적으로 길항한다는 것을 보여줍니다에키나코사이드-글루타메이트 방출의 매개 억제; 그럼에도 불구하고, mitogen-activated protein kinase inhibitor PD98059 또는 protein kinase A inhibitor H89는 효과가 없었다. 게다가 그. J. 몰. 과학. 2016, 17, 1006 8 13 4-아미노피리딘 유도 단백질 키나제 C의 인산화는 로 전처리 후 시냅토솜에서 감소에키나코사이드글루타메이트 방출 억제에 효과적인 농도에서. 따라서 신호 전달 경로는에키나코사이드-매개된 글루타메이트 방출 억제는 단백질 키나제 C를 포함할 수 있습니다. 단백질 키나제 C는 시냅스 전 수준에 존재하고 신경전달물질 엑소사이토시스에서 중요한 역할을 하는 중요한 세포내 신호전달 시스템입니다. 예를 들어, 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질과 같은 시냅스 소포 트래피킹 또는 모집 및 세포외유출에 관여하는 여러 시냅스 단백질은 단백질 키나제 C에 의해 인산화됩니다[38,39]. 이 인산화 과정은 탈분극으로 자극된 Ca2와 글루타메이트 방출을 촉진하는 유입에 의해 증가될 수 있습니다[40]. 따라서 우리는 의 억제 효과를 합리적으로 추측할 수 있습니다.에키나코사이드여기에서 관찰된 Ca2 플러스 진입은 단백질 키나제 C 활성을 감소시키고 결과적으로 글루타메이트 방출을 감소시킬 수 있습니다.
3.2. 치료적 의미
과도한 글루타메이트 방출과 글루타메이트 수용체 활성화로 인한 병리학적 과정인 흥분독성은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 파킨슨병, 알츠하이머병과 같은 급성 및 만성 뇌질환에서 신경세포 사망의 주요 원인이며[13,41], 치료 전략 글루타메이트 방출 억제를 포함하는 것은 그러한 질병을 치료하기 위한 유망한 신경 보호 전략일 수 있습니다.에키나코사이드혈뇌장벽(BBB)을 관통하는 것으로 확인되었으며 다양한 생체 내 신경독성 모델에서 신경보호 효과를 나타냅니다[8,10-12,42]. 이러한 신경 보호 효과의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만 염증 반응 억제, 미토콘드리아 기능 안정화, 항산화, 자유 라디칼 소거 및 신경 영양 기능 모방을 포함한 여러 가능한 메커니즘이 보고되었습니다[5,9,12,42]. 현재 연구에서 신경 말단에서 글루타메이트 방출을 감소시키는 에키나코사이드의 능력은 또한 신경 보호 메커니즘을 부분적으로 설명할 수 있습니다. 그러나 이 효과가 글루타메이트 흥분독성과 관련된 뇌 장애에서 에키나코사이드의 명백한 치료 가능성에 기여하는지 여부는 추가 연구가 필요합니다.
4. 재료 및 방법
4.1. 화학
Fura{0}}아세톡시메틸 에스테르(Fura{1}}AM) 및 3',3',3'-디프로필티아디카르보시아닌 요오드화물[DiSC3(5)]은 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 구입했습니다. ω-코노톡신 MVIIC, 로틀린,2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌{12}}일]-3-(인돌{14}}일) 말레이미드( GF109203X), 5,6,7,{19}}테트라하이드로{20}}메틸{21}}옥소{22}}H-인돌로[2,{25}}a]피롤로[3,{ {27}}c]카바졸-12-프로판니트릴(Go6976) 및 N-[2-(p 브로모신나밀아미노)에틸]-5-이소퀴놀린설폰아미드(H89)는 TocrisBioscience(Bristol, UK)에서 구입했습니다. 에키나코사이드, 단트롤렌, DL-트레오-베타-벤질-옥시아스파테이트(DL-TBOA),{39}}클로로{40}}(2-클로로페니)-1,{43}}디하이드로 -4,1-벤조티아제핀-2(3H)-온(CGP37157), 2-(2-아미노{52}}메톡시페닐)-4 H-1-벤조피란-4-온)(PD98059), 에틸렌 글리콜 비스(-아미노에틸 에테르)-N,N,N1,N{60}}테트라아세트산(EGTA) 및 기타 모든 시약을 구입했습니다. Sigma-Aldrich Co.(미국 미주리주 세인트루이스).
4.2. 동물
2개월 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용했습니다. 동물은 표준화된 환경 조건(22 ˘ 1 ˝C, 상대 습도 50%, 12시간 명암 주기)에서 사육되었으며 음식과 물에 대한 무제한 접근이 허용되었습니다. 동물은 참수로 죽였고 대뇌 피질은 4 °C에서 빠르게 제거되었습니다. 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침에 따라 Fu Jen Institutional동물 관리 및 이용 위원회(A10259)의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하고 신뢰할 수 있는 결과를 생성하는 데 필요한 최소한의 동물을 사용하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
4.3. 시냅토솜 준비
이전에 설명한 대로 불연속 Percoll 기울기에서 쥐의 대뇌 피질에서 시냅토솜을 정제했습니다[43,44]. 간단히 말해서, 조직을 0.32 M sucrose(pH 7.4)를 포함하는 배지에서 균질화하고, 균질물을 3000ˆ g(5{{25 }}00 JA 25.5 로터에서 rpm, Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA) 및 4°C, 상청액을 14,500ˆ g에서 12분 동안 다시 원심분리했습니다( 11,{64}} JA 25.5 로터에서 rpm). 펠릿을 0.32M 수크로스(pH 7.4)에 부드럽게 재현탁하고 이 시냅토솜 현탁액(2mL)의 분취량을 0.32M 수크로스, 1mM EDTA, 0.25mM DL-디티오트레이톨 및 0.25mM DL-디티오트레이톨 및 3%, 10% 및 23% Percoll(pH 7.4). 4°C에서 32,500ˆg(JA 20.5 로터의 경우 16,500rpm)에서 7분간 원심분리한 후 시냅토솜이 10%와 23% Percoll 밴드 사이에서 회수되었으며 최종 부피 30mL로 희석되었습니다. HEPES 완충 배지(140mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NaHCO3, 1mM MgCl2·6H2O, 1.2mM Na2HPO4, 10mM 포도당 및 10mM HEPES(pH 7.4)). 27,{66}}ˆg(JA 25.5에서 15,000rpm)에서 10분 동안 추가 원심분리한 후, 시냅토솜 펠릿을 3mL의 HEPES 완충 배지에 재현탁하고, 단백질 함량을 브래드포드 분석을 사용하여 결정했습니다. 마지막으로, 0.5 mg의 시냅토솜 현탁액을 10 ml의 HEPES 완충 배지에 희석하고 3000 g(JA 20.1 로터에서 5000 rpm)에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액은 버리고 시냅토솜을 포함하는 펠렛을 얼음에 보관하고 4-6시간 내에 사용했습니다.
4.4. 글루타메이트 방출
글루타메이트 방출은 이전에 설명한 대로 온라인 형광측정법에 의해 분석되었습니다[45,46]. 시냅토좀 펠릿을 HEPES 완충 배지({2}}.5 mg/mL)에 재현탁하고 16 μM 소 혈청 알부민의 존재하에 37 °C에서 10분 동안 사전 배양하여 사전 배양 동안 시냅토솜에서 방출된 유리 지방산을 결합합니다. 시냅토솜의 2-mL 분취량을 2mM NADP 플러스, 50단위의 글루타메이트 탈수소효소 및 1.2mM CaCl2를 포함하는 교반 큐벳으로 옮기고 NADPH의 FL 형광을 Perkin-Elmer LS{{ 14}} 340 및 460 nm의 여기 및 방출 파장에서 분광형광계(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). 시냅토솜은 전기 자극을 받지 않기 때문에 칼륨 채널 차단제 4-아미노피리딘을 사용하여 글루타메이트 방출을 자극했습니다. 4-아미노피리딘은 막 전위를 불안정하게 하고 전압 의존성 Ca2 플러스 채널 및 신경전달물질 방출의 활성화를 유도하는 시냅스 말단의 생체 내 탈분극에 근접하는 반복적인 자발적인 Na + 채널 의존성 탈분극을 일으키는 것으로 생각됩니다. ]. 2초 간격으로 데이터를 얻었다. 외인성 글루타메이트(5nmol)의 표준물이 각 실험의 마지막에 추가되었습니다. 표준 첨가에 의해 생성된 FL 형광 변화 값을 사용하여 방출된 글루타메이트를 시냅토솜 단백질 밀리그램당 글루타메이트 나노몰(nmol/mg)로 계산했습니다. 본문에 인용된 방출 값은 5분의 탈분극 후 정상 상태에서 도달한 수준입니다(nmol/mg/5분). 누적 데이터는 Lotus 1-2-3 스프레드시트(IBM, White Plains, NY, USA) 및 MicroCal Origin(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)을 사용하여 분석되었습니다.
4.5. 플라즈마 막 잠재력
원형질막 전위는 막 전위에 민감한 염료인 DiSC3(5)[48]로 결정되었습니다. 시냅토솜을 HEPES 완충 배지에 재현탁하고 2ml 분취량을 Perkin-Elmer LS{10}} 분광 형광계(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, 매사추세츠, 미국). 혼합물을 3분 동안 평형화시킨 후, FL 형광은 각각 646 및 674 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정되었습니다. 데이터는 2초 간격으로 수집되었습니다. 누적 데이터는 MicroCal Origin(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)을 사용하여 분석하고 FL 형광 단위로 표현했습니다.
4.6. 세포질 Ca2 + 농도([Ca2 + ]C)
[Ca2 plus ]C는 Ca2 plus 지시약 fura-2로 측정되었습니다. 시냅토솜(0.5 mg/mL)을 교반 테스트에서 37 °C에서 30분 동안 5 µM fura-2 및 0.1 mM CaCl2를 포함하는 HEPES 완충 배지에서 사전 배양했습니다. 튜브. fura{12}} 로딩 후, 시냅토솜을 3000ˆg(5000rpm)에서 30초 동안 미세원심분리기에서 원심분리했습니다. 시냅토솜 펠릿을 HEPES 완충 배지에 재현탁하고, 시냅토솜 현탁액을 Perkin-Elmer LS{17}} 분광 형광계(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA)의 항온 큐벳에서 교반했습니다. CaCl2(1mM)를 3분 후에 첨가하고 추가 10분 후에 추가로 첨가하였다. 형광 데이터는 2초 간격으로 여기 파장 340 및 380 nm(방출 파장 505 nm)에서 축적되었습니다. [Ca2 plus ]C(nM)는 보정 절차[49]와 이전에 설명한 방정식[50]을 사용하여 계산되었습니다. 누적 데이터는 MicroCal Origin(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)을 사용하여 분석되었습니다.
4.7. 웨스턴 블로팅
시냅토솜은 용해 완충액(10mM HEPES 완충액, pH 7.4), 1% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 혼합물에서 균질화되었습니다. 용해물은 원심분리에 의해 정화되었고 단백질 농도는 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정되었습니다. 동일한 양의 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 5% 저지방 우유가 포함된 트리스 완충 식염수로 차단하고 적절한 1차 항체(phospho-protein kinase C(pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, USA)와 함께 밤새 배양했습니다. 4 ㄷ. Tris-buffered saline으로 3회 세척한 후, 막을 상온에서 1시간 동안 2차 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항체(1:3000)로 처리하였다. 그런 다음 멤브레인을 Tris 완충 식염수로 3회 이상 세척하고 향상된 화학 발광 시스템(Amersham, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 시각화했습니다. 샘플의 분취량을 로딩하고 로딩 대조군으로서 PKC의 검출을 위해 항-PKC 항체로 탐침하였다. 발현 또는 인산화 수준은 농도계로 정량화된 밴드 밀도로 평가하였다. 밴드의 Densitometricquantification은 Syngene 소프트웨어(Synoptics, Cambridge, UK)를 사용하여 분석되었습니다.
4.8. 통계 분석
데이터는 단일 시냅토솜 준비에서 얻었고 서로 독립적이지 않았습니다. 약물의 효과 대 대조군의 유의성을 테스트하기 위해 양측 스튜던트 t-검정이 사용되었습니다. 추가 비교가 필요한 경우(예: 두 번째 치료가 echinacoside의 작용에 영향을 미치는지 여부) 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 테스트가 사용되었습니다. 분석은 소프트웨어 SPSS(17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 통해 완료되었습니다. 데이터는 평균 ˘ SEM으로 표시됩니다. 유의성은 모든 통계적 측정에 대해 p < 0.05에서="">
5. 결론
를 입증한 최초의 연구이다.에키나코사이드Ca2와 Cav2.2 및 Cav2.1 채널을 통한 유입을 감소시켜 쥐의 대뇌피질 시냅토솜으로부터 글루타메이트 방출을 억제하고, 이 방출 억제는 적어도 부분적으로는 단백질 키나제 C 경로의 억제에 의존할 가능성이 있습니다. 현재 발견은 뇌에서 에키나코사이드의 작용 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 때문에 가치가 있습니다.
감사의 말:이 작업은 과학 기술부(MOST 103-2320-B{1}} MY3)의 보조금으로 지원되었습니다.
저자 기여:Tzu Yu Lin과 Su Jane Wang은 실험을 구상하고 설계했습니다. Cheng Wei Lu가 실험을 수행했습니다. Cheng Wei Lu와 Shu Kuei Huang이 데이터를 분석했습니다. Su Jane Wang이 논문을 작성했습니다.
이해 상충:저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
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