파트 2: 일주기 유전자 Per1의 후성 유전적 조절은 해마 기억의 연령 관련 변화에 기여합니다

연락처: 오드리 후audrey.hu@wecistanche.com

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Per1의 녹다운은 장기적으로 손상메모리어린 쥐에서.다음으로, 등쪽 해마에서 Per1의 상향 조절이 장기간에 걸쳐 필요한지 여부를 테스트하기 위해메모리형성, 우리는 10-min OLM 훈련 48시간 전에 Per1을 표적으로 하는 siRNA를 어린 마우스의 등쪽 해마에 주입했습니다. Per1 siRNA의 주입은 최종 테스트 세션 후 2시간 후에 측정된 바와 같이 등쪽 해마에서 PER1 단백질의 상당한 감소를 생성했습니다(그림 4d, 보충 그림 5). PER1 단백질(~30%)의 상대적으로 적당한 녹다운은 심각한 손상을 일으켰습니다.메모리OLM 형성; Per1 siRNA가 주입된 마우스는 훈련과 테스트 사이에 DI의 유의한 증가를 나타내지 않았으며 테스트 중 전체 개체 탐색에 영향을 미치지 않는 대조군 마우스(그림 4e)보다 테스트 중 움직이는 물체에 대한 선호도가 현저히 낮았습니다(그림 4f). 훈련 전 습관화 세션 동안 움직임에 차이가 없습니다(보충 그림 8c). 이것은 해마 내에서 선택적으로 코어 일주기 시계 유전자의 국부적 붕괴가 손상될 수 있음을 처음으로 보여줍니다.메모리형성.

Per1 과발현 개선메모리노화 쥐에서. 드디어,등쪽 해마에서 Per1의 과발현이 연령 관련 개선에 충분한지 여부를 결정하기 위해메모리손상, 우리는 두 가지 보완적인 방법을 사용하여 Per1을 로컬로 상향 조절했습니다. 먼저 v5 에피토프 태그(pLVX-v5Per1)가 있는 야생형 Per1을 발현하는 렌티바이러스를 사용했습니다(그림 5a, 보충 그림 6a). 이 플라스미드가 Per1을 과발현하는지 확인하기 위해 우리는 HT22 세포를 pLVX-v5Per1 또는 pLVX-EV로 형질감염시키고 Per1 mRNA 발현을 측정했습니다. 형질감염 후 24시간과 48시간 모두에서 Per1 mRNA는 대조군 플라스미드로 형질감염된 세포에 비해 pLVX-v5Per1로 형질감염된 세포에서 유의하게 증가하였다(도 5b). pLVX-v5Per1의 형질감염은 또한 24시간에 Per2(Per1과 상호작용하는 주기 시계 계열 구성원)에 대한 mRNA의 상당한 증가를 초래했지만(보충 그림 6b), 이 증가는 Per1의 관찰된 증가(at 24시간, Per1: EV보다 466-배 증가, Per2: EV보다 1.{37}}배 증가). 그러나 Per1 과발현은 가장 가까운 다운스트림 유전자 Hes7의 전사에 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 6c).

Per1 과발현이 개선되는지 여부를 확인하려면메모리노화 마우스에서 성능을 향상시키기 위해 pLVX-v5Per1은 행동 2주 전에 18-mo 마우스의 등쪽 해마에 주입되었습니다. pLVX-v5Per1 마우스는메모리pLVX-EV(빈 벡터) 컨트롤에 대한 테스트에서 OLM의 경우(그림 5c). pLVX-v5Per1 마우스만이 테스트 시 전체 탐색(그림 5d) 또는 습관화 중 움직임(보충 그림 8d)에서 관찰된 그룹 차이 없이 훈련과 비교하여 휴식 중인 움직이는 물체에 대한 선호도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다.

행동에 따라 동물 하위 집합의 해마 조직을 RNA 시퀀싱을 위해 처리하여 생체 내 적절한 그룹에서 pLVX-EV 및 pLVX-v5Per1 전사체의 존재를 확인했습니다(보충 그림 7a, b, f, g).

이 접근 방식을 보완하기 위해 CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator(SAM) 시스템33을 사용하여 등쪽 해마에서 Per1의 전사 활성화를 유도했습니다. 이 시스템은 세 가지 렌티바이러스 성분으로 구성됩니다.GFP 태그(dCas9-VP{4}}GFP)가 있는 VP64 전사 활성화 도메인에 융합된 비활성 Cas9(dCas9) 세 번째 구성요소인 MS2- 이중 전사 활성제(MS{9}}p{10}}HSF1) 융합 단백질을 모집합니다.(그림 5e). 대조군 동물은 SAM 시스템을 Per1으로 표적화하는 데 필요한 20개 뉴클레오티드 서열이 없는 대조군 sgRNA(ctrl sgRNA로 지칭됨)를 받았습니다. Per1 프로모터에서 이러한 구성 요소를 조립하면 3개의 이펙터 도메인(VP64, p65 및 HSF1)이 Per1 전사를 구동할 수 있습니다. 확인하기 위해, 등쪽 해마에서 Per1의 과발현 그림 5의 효과는 물체 위치의 연령 관련 손상을 개선합니다.메모리. 빈 벡터 컨트롤(pLVX-EV)과 비교하여 Per1(pLVX-v5Per1) 태그가 지정된 v{0}}를 과발현하는 데 사용되는 렌티바이러스 구조의 도식. b Per1 mRNA는 EV로 형질감염된 세포와 비교하여 HT22 세포에서 pLVX-v5Per1 형질감염 후 24시간 및 48시간 후에 유의하게 증가했습니다(Two-way ANOVA: Group x Timepoint interaction (F(1,8)=52}.8, p < {{20}}.{38}}{{40}}1),="" sidak의="" 사후="" 테스트,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-해마에="" plvx-v5per1을="" 주입한="" mo="" 마우스는="" plvx-ev="" 대조군="" 바이러스를="" 투여한="" 마우스보다="" olm에="" 대해="" 유의하게="" 더="" 나은="" 기억력을="" 보여주었습니다(two-way="" anova:="" 바이러스="" x="" 세션="" 상호작용,="" (f(1,29)="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0.05),="" sidak의="" 사후="" 테스트,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" n="16," 15,="" 모든="" 남성).="" d="" 전체="" 탐색은="" 테스트에서="" 두="" 그룹="" 모두="" 유사했습니다(t(29)="0.57," p="0.57)." e="" per1="" 전사를="" 구동하는="" 데="" 사용되는="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator(sam)="" 시스템의="" 개략도.="" 위:="" sam의="" 개별="" 구성="" 요소.="" 하단:="" per1="" 전사를="" 구동하는="" per1="" 프로모터에서="" 조립된="" 구성요소.="" f="" per1="" mrna는="" 대조군="" sgrna로="" 형질감염된="" 세포와="" 비교하여="" ht22="" 세포에서="" crispr-sam="" 성분의="" 형질감염="" 48시간="" 후="" 유의하게="" 증가했습니다(two-way="" anova:="" group="" x="" timepoint="" interaction="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0.01),="" sidak의="" 사후="" 테스트,="" **p="">< 0.001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-per1을="" 표적으로="" 하는="" sgrna와="" 함께="" crispr-sam="" 시스템의="" 해마="" 주입을="" 받은="" mo="" 마우스가="" 훨씬="" 더="" 나은="" 것으로="">메모리OLM의 경우 대조군 sgRNA가 있는 EV 대조군 마우스와 비교(Two-way ANOVA: Virus x Session interaction (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidak의="" 사후="" 테스트,="" ***p="">< 0.001,="" n="17," 15,="" 모든="" 남성).="" h="" 전체="" 탐색은="" 테스트에서="" 두="" 그룹="" 모두="" 유사했습니다(t(30)="0.41," p="0.68)." 데이터는="" crispr-sam="" 시스템에서="" 평균="" ±="" sem으로="" 표시되며,="" 우리는="" ht22="" 세포를="" 세="" 가지="" 플라스미드="" 모두로="" 형질감염시키고,="" 24시간="" 또는="" 48시간="" 후에="" 세포를="" 수확하고,="" per1="" mrna="" 발현을="" 측정했습니다.="" 형질="" 감염="" 후="" 48="" 시간까지="" per1="" mrna는="" 대조군과="" 비교하여="" per1="" sgrna가="" 제공된="" 그룹에서="" 유의하게="" 증가하여(그림="" 5f),="" crispr-sam="" 시스템이="" per1="" mrna="" 발현을="" 효과적으로="" 유도함을="" 확인했습니다.="" 우리는="" per2="" mrna(보충="" 그림="" 6e)="" 또는="" hes7="" mrna(보충="" 그림="" 6f)에="" 대한="" 발현의="" 변화가="" 관찰되지="" 않았으며,="" 이는="" crispr-sam="" 시스템이="" 표적="" 유전자="" per1의="" 선택적="" 과발현을="" 유도함을="">

다음으로 18-mo 마우스에 CRISPR-SAM 렌티바이러스를 해마 내 주입하고(보충 그림 6d) 2주 후에 OLM 훈련을 받았습니다. 우리의 pLVX-v5Per1 과발현에서 관찰된 바와 같이, CRISPR-SAM 매개 Per1 과발현이 상당히 개선되었습니다.메모리전체 탐색 (그림 5h) 또는 습관화 동안의 움직임 (보충 그림 8e)에 영향을 미치지 않고 대조군 동물 (그림 5g)에 비해 Per1 sgRNA 주입 마우스의 성능. Per1 sgRNA가 주어진 마우스만이 훈련에 비해 정지해 있는 움직이는 물체에 대한 선호도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다.메모리물체 위치에 대한 것입니다(그림 5g). 행동에 따라 동물 하위 집합의 해마 조직을 RNA 시퀀싱을 위해 처리하여 생체 내 적절한 그룹에서 CRISPR 전사체의 존재를 확인했습니다(보충 그림 7c-g). 함께, 이러한 결과는 등쪽 해마에서 Per1의 과발현이 장기 물체 위치 기억에서 연령 관련 손상을 개선하기에 충분하다는 것을 보여줍니다. 따라서 Per1은 장기 기억 형성에 중요한 핵심 유전자이며 HDAC3에 의해 조절되며 노화된 뇌에서 손상됩니다.

논의

우리의 결과는 억제 히스톤 데아세틸라제 HDAC3의 삭제 또는 파괴가 장기적으로 노화 관련 손상을 개선할 수 있음을 보여줍니다.메모리및 시냅스 가소성. 또한, HDAC3의 결실은 등쪽 해마에서 24시간 주기 유전자 Per1의 경험 유도 발현을 회복시킨다. 해마 PER1 발현은 장기 기억 형성에 중요하고(그림 4) 해마에서 Per1의 과발현은 노화 관련 기억 장애를 개선하기 때문에(그림 5), PER1은 HDAC3의 삭제가 이를 통해 개선되는 잠재적인 메커니즘입니다.메모리및 노화 마우스의 시냅스 가소성. 보다 광범위하게, Per1의 연령 관련 장애는 구조에 따라 장기 기억 및 일주기 리듬 모두에서 연령 관련 손상을 연결할 수 있습니다.

현재 연구에서 발견된 한 가지 중요한 사실은 해마 LTP의 연령 관련 손상이 HDAC3 삭제 또는 중단으로 개선될 수 있다는 것이었습니다. 이는 HDAC3의 약리학적 차단이 연관 해마 LTP34의 연령 관련 장애를 개선할 수 있음을 보여주는 Sajikumar 연구실의 최근 연구와 일치합니다. 흥미롭게도, 우리는 오래된 HDAC3flox/flox 및 HDAC3(Y298H) 동물의 슬라이스가 어린 HDAC3flox/flox 또는 HDAC3(Y298H) 동물의 슬라이스와 동일한 수준의 강화에 도달하지 못한다는 것을 발견했습니다(그림 2c, f). 노화된 두뇌는 젊은 두뇌보다 가소성 한계가 더 낮을 수 있습니다. 강화의 이러한 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은 CA122의 시냅스 접촉의 연령 관련 손실이 노화 해마의 가소성 한계를 낮출 수 있다는 것입니다. 어린 DH의 상대적으로 풍부한 시냅스보다 더 적은 수의 사용 가능한 시냅스가 더 빨리 포화되기 때문입니다. 이 경우 추가 시냅스를 사용할 수 없기 때문에 자극 프로토콜을 강화하거나 간격을 둔 자극 시합을 제공하는 것이 노화 해마에서 LTP를 추가로 향상시키지 않아야 합니다. 이 차이의 근간이 되는 메커니즘을 확인하려면 추가 작업이 필요합니다.

우리의 RNA 시퀀싱 결과는 유전자의 작은 하위 집합만이 HDAC3 결실에 의해 노화된 뇌에서 회복되는 기준에 맞는다는 것을 보여주었습니다(그림 3e). 따라서 젊은 뇌의 유전자 발현 프로필을 요약하는 대신 노화된 뇌에서 HDAC3를 삭제하면 Per1을 포함하여 장기 기억 형성에 매우 중요한 몇 가지 핵심 유전자의 경험 유도 발현이 복원되었습니다. Per1은 HDAC3의 국소 삭제가 경험 유도 Per1 발현을 복원하고 HDAC3이 OLM 훈련에 대한 반응으로 Per1 프로모터에서 물리적으로 제거되기 때문에 HDAC3에 의해 직접 조절되는 것으로 보입니다. 또한 Per1 표현식은 다음을 위해 필요합니다.메모리, DH에서 PER1 단백질의 siRNA 매개 녹다운이 장기간 손상됨에 따라메모리어린 쥐에서 형성, 과발현 개선메모리노화 마우스의 OLM에 대한 특히 Per1을 과발현하는 데 사용되는 두 렌티바이러스 시스템은 모두 등쪽 해마의 CA1b 영역에 있는 소수의 세포만 형질감염시키므로(보충 그림 6a, d), RNA 시퀀싱으로 이러한 구조의 존재를 확인해야 합니다(방법 참조 ). 이전 작업에서 지느러미 해마의 이 정확한 영역이 OLM36에 중요하다는 것을 보여주듯이, 이는 기억 관련 구조 내에서 Per1의 작은 초점 변경조차도 장기 기억 형성에 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 이것은 뇌 전체에서 Per1의 비특이적 결실이 어린 마우스의 기억 형성을 손상시킬 수 있음을 보여주는 이전 연구를 확장합니다6,28,29. 따라서 노화된 뇌에서 비정상적인 HDAC 매개된 Per1 억제는 장기 기억 형성 및 일주기 리듬 모두에서 노화 관련 손상으로 이어질 수 있는 주요 사건입니다. 이 연구는 Per1이 HDAC3가 노화 뇌에서 장기 기억을 조절하는 중요한 유전자임을 분명히 보여주지만, 다른 유전자가 HDAC3 결실의 기억 강화 효과에 가장 크게 기여할 가능성이 높습니다. 시냅스 가소성과 기억에 대한 HDAC3의 효과를 매개하는 것으로 제안된 다른 유전자에는 NF-κB34, FMRP37 및 Nr4a226이 있습니다. 현재 연구에서 우리는 Per1과 마찬가지로 HDAC3 결실에 의해 개선된 노화 뇌에서 손상된 발현을 나타내는 3개의 추가 유전자(그림 3f:Nr4a1, Egr1, Tsc22d3)를 확인했습니다. 이러한 서로 다른 유전자가 HDAC3 결실의 기억력 향상 효과에 어떻게 고유하게 기여하는지는 현재 불분명합니다. 특히, 이러한 모든 유전자는 장기 기억 형성38,39에 중요하고 PER16,28의 업스트림 및 다운스트림인 CBP/CREB 경로와 인터페이스합니다. PER1이 CREB 인산화6의 업스트림이므로 HDAC 매개된 Per1 억제가 CREB 인산화를 감소시켜 궁극적으로 Fmrp40,41 및 Nr4a 유전자 패밀리 구성원인 Nr4a1 및 Nr4a226과 같은 CREB 매개 유전자의 전사를 손상시킬 수 있습니다. HDAC3, PER1 및 이러한 다른 분자 플레이어 간의 복잡한 역학을 이해하는 것은 향후 연구의 중요한 목표가 될 것입니다.

현재 연구에서 우리는 노화 뇌에서 Per1을 과발현하기 위해 pLVX-v5Per1을 사용한 전장 Per1 cDNA 구성의 과발현 및 CRISPR-SAM 시스템을 사용한 내인성 Per1의 전사 활성화라는 두 가지 보완 방법을 사용했습니다. pLVX 매개 과발현이 Per1 mRNA의 큰 증가를 유도했지만(그림 5b), 이는 또 다른 기간 가족 구성원인 Per2의 증가를 동반했습니다(보충 그림 6b). 그러나 다운 스트림 유전자 Hes7의 발현은 pLVX-v5Per1에 의해 변경되지 않았습니다 (보충 그림 6c). 반면에 CRISPR-SAM 시스템은 Per2 또는 Hes7 발현의 표적 외 향상을 피하는 Per1 mRNA의 더 미묘한 증가를 생성했습니다(보충 그림 6e-f). 두 접근 방식 모두 장기적으로 유사하게 개선되었기 때문에메모리노화된 마우스에서 pLVX-v5Per1로 관찰된 Per2의 표적 외 증가가 관찰된 장기 기억 개선의 원인일 가능성은 낮습니다.

장기에 대한 24시간 주기 효과메모리전통적으로 등쪽 해마와 같은 기억 형성과 관련된 말초 구조의 변경을 유발하는 SCN 내의 조절 장애에서 비롯된 것으로 믿어집니다. 일주기 리듬과 장기 기억 형성 사이의 명확한 연결에도 불구하고 DH에서 개별 일주기 시계 유전자의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 가소성 관련 유전자 캐스케이드가 일주기 진동을 보여주기 때문에 기억은 하루 중 시간과 밀접하게 연결되어 있습니다.메모리24시간 주기의 특정 기간에 더 쉽게 획득할 수 있습니다. 예를 들어, 상황 공포 조건화는 MAPK 인산화 수준이 최고조에 달하는 낮에 더 강하게 획득됩니다3. 또한, 노화가 24시간 주기 리듬의 붕괴를 수반한다는 것이 잘 문서화되어 있는데, 아마도 중심 24시간 주기인 SCN(교차상핵)의 변화로 인해 발생합니다(검토용). 일주기 시계의 이러한 교란이 신체의 연령 관련 손상과 어떻게 관련되어 있습니까?메모리열린 질문입니다. 우리의 결과는 HDAC3가 노화된 해마에서 경험 유발 Per1을 제한하여 장기 기억에서 관찰된 손상에 기여할 수 있음을 시사합니다. 따라서 Per1의 후성 유전적 억제는 일주기 리듬과 장기 기억 형성 모두에서 연령 관련 손상 사이의 중요한 인터페이스를 나타낼 수 있습니다.

핵심 표준 24시간 주기 시계 유전자 중에서 Per1은 해마 장기에 극적인 영향을 미칠 독특한 태세를 갖추고 있습니다.메모리. Per1은 주로 SCN 출력 경로에 관여하는 것으로 보이며 해마와 같은 SCN 하류의 말초 시계에서 중요한 역할을 합니다. 또한, 최근 연구는 Per1이 CREB 인산화를 제어하여 낮/밤 주기 전반에 걸쳐 공간 기억 형성을 "게이트"할 수 있다고 제안합니다6,28,29. 실제로, 해마 Per1 mRNA 상향 조절은 쥐에서의 작업을 포함하여 적어도 3개의 다른 RNA-seq 연구에서 컨텍스트 또는 공간 학습 후에 관찰되었으며 Per1이 종에 걸쳐 학습 후 일반적으로 상향 조절됨을 나타냅니다20,43,44. 현재 연구의 결과와 함께 이 작업은 PER1 발현이 해마 장기 기억 형성에 매우 중요함을 나타냅니다. 밤에 발생하거나 노화와 함께 발생하는 PER1의 감소는 해마를 손상시킬 수 있습니다.메모리. 현재까지,

Per1과 관련된 연구메모리형성은 해마 6,28,29,45,46와 같은 기억 관련 구조 외에도 핵심 24시간 주기 시계 및 기타 영역에서 Per1 발현을 방해하는 전역 녹아웃에 전적으로 의존하여 해마 PER1이 다음을 위해 특별히 필요한지 여부를 결정하는 것이 불가능합니다. 기억 형성. 실제로, 전체 Per1 삭제는 일부 보고서에서 24시간 주기 리듬에 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 등쪽 해마에서 직접적으로 PER1 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 처음으로 보여줍니다.메모리어린 생쥐에서는 등쪽 해마에서 Per1의 국소 과발현이 노화 생쥐의 기억력을 향상시킬 수 있습니다. 등쪽 해마의 선택적 결실 HDAC3(Per1을 조절함)은 현재 연구에서 일주기 활동 패턴에 영향을 미치지 않았으며(보충 그림 4), 등쪽 해마의 전해질 병변조차도 일주기 리듬에 영향을 미치기에 불충분하기 때문에 등쪽 해마 내에서 Per1을 조작하면 중앙 일주기 시계의 기능에 영향을 미칩니다. 그럼에도 불구하고, Per1의 경험 유발 증가 또는 Per1의 바이러스 매개 과발현은 일주기 활동 패턴에 영향을 미치지 않고도 해마 뉴런 내에서 다른 시계 유전자와 같은 다른 분자 플레이어의 일주기 진동에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 잠재적인 상호 작용 파트너 식별을 포함하여 Per1이 메모리 형성을 변경하는 기능을 이해하는 것은 향후 작업의 목표가 될 것입니다.

함께, 이 결과는 핵심 24시간 시계 유전자 Per1이 지역 내에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다.메모리SCN에서의 기능과 독립적인 역할인 기억 형성을 변경하는 구조. 보다 일반적으로, 이것은 24시간 주기가 변화한다는 전통적인 가설에 도전합니다.메모리형성은 핵심 24시간 시계의 변경에 의해 주도되며 대신 24시간 시계 유전자가 해마 세포에서 보다 자율적인 역할을 하여 하루 중 시간을 기반으로 한 기억 형성을 통제한다는 가설을 뒷받침합니다.

행동 양식

쥐. 젊은 성체 마우스는 테스트 당시 2~4개월이었고 노화 마우스는 18~20개월이었습니다. 모든 마우스는 C57BL/6J이거나 C57BL/6 배경에서 유지되었습니다(HDAC3 plus/plus 및 HDAC3flox/flox 마우스). 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었고 조명은 12시간 명암 주기로 유지되었습니다. 모든 행동 테스트는 조명 주기 동안 수행되었습니다. 모든 실험은 동물 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 지침에 따라 수행되었으며 캘리포니아 대학 어바인의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

수술. 마우스를 이소플루란(유도, 4%, 유지 1.5-2.{4}}%)으로 마취하고 정위 상태로 두었다. 주사바늘은 0.2 mm/15 s(AP, −2.{9}} mm; ML, ± 1.5 mm, DV, - 1.5 mm 상대적인 Bregma의 속도로 등쪽 해마까지 내려갔습니다. ). 목표 깊이에 도달하고 2분 후 1.{15}} ul의 바이러스 또는 siRNA를 6 ul/h의 속도로 DH에 양측으로 주입했습니다. CRISPR-SAM 렌티바이러스 주입의 경우 세 가지 바이러스의 칵테일을 같은 속도로 반구당 1.5μL의 최종 부피로 주입했습니다. 주사 바늘은 바이러스가 확산될 수 있도록 주사 후 2분 동안 제자리에 유지되었습니다. 그런 다음 인젝터를 0.1mm 올려서 15초당 0.1mm의 속도로 제거하기 전에 1분 더 방치했습니다. 바이러스 주입은 행동 분석 2주 전에 수행된 반면 siRNA 녹다운은 훈련 2일 전에 수행되었습니다. 모든 주입 실험에서 동물은 무작위로 다른 주입 조건에 할당되었습니다(모두 AAV-CaMKII-Cre가 주입된 HDAC3 plus/plus 및 HDAC3flox/flox 마우스 제외). 모든 행동 실험에서 각 바이러스 조건 내의 동물은 홈케이지/훈련된 그룹에 무작위로 할당되었고 모든 조건(물체, 상자 등)은 그룹 간에 균형을 이루었습니다.

AAV 제작. AAV2.{1}}CaMKII-Cre는 Penn Vector Core에서 구입했습니다(역가: 1.81 × 1013 GC/ml). AAV2.{7}}HDAC3(Y298H)-v5의 경우 해마 cDNA에서 야생형 HDAC3을 증폭하고 산물을 CMV 프로모터 및 -globin 인트론의 제어 하에 변형된 pAAV-IRES-hrGFP(Agilent)에 복제했습니다. 3x-FLAG 태그, IRES 요소 및 hrGFP를 벡터에서 제거하고 V5 태그로 교체하여 HDAC3(플라스미드 MW91)에 대한 C-말단 융합을 허용했습니다. 점 돌연변이를 생성하기 위해 아미노산 298(플라스미드 MW92)에서 티로신 대신 히스티딘 잔기를 코딩하도록 뉴클레오티드를 변경했습니다. 빈 벡터 제어의 경우 HDAC3 코딩 서열은 존재하지 않았지만 다른 모든 요소는 남아 있습니다(플라스미드 MW87). AAV는 Penn Vector Core에 의해 만들어졌고 최종 역가는 qPCR에 의해 결정되었습니다(AAV-HDAC3(Y298H): 6.48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1.35 × 1013 GC/ml).

렌티바이러스 생산. CRISPR/dCas9 SAM(Synergistic Activation Mediator) 시스템의 경우 dCas9- VP64-GFP(#61422-LVC) 및 MS2-용 Addgene에서 렌티바이러스 플라스미드를 구입했습니다. P65-HSF1_Hygro(#61426-LVC) 구성물(역가 8×106TU/ml 이상). Per1 sgRNA의 경우 Per1 프로모터(AGAGGGAGGTGACGTCAAAG)의 CRE 요소에 해당하는 안티센스 가이드 서열을 복제하고 Addgene sgRNA(MS2) 복제 백본(#61427)에 삽입했습니다. 대조군 sgRNA는 가이드 서열이 플라스미드에 복제되지 않은 것을 제외하고는 동일했습니다. Per1 sgRNA(역가: 6.8 × 107 IFU/ml) 및 대조군 sgRNA(3.5 × 107 IFU/ml) 모두에 대한 렌티바이러스는 USC 약학 렌티바이러스 연구소에서 생산되었습니다.

pLVX-V5Per1 과발현 구조의 경우 Addgene pCMV-Sport{6}}mPer1 플라스미드(#16203)에서 전체 길이의 야생형 Per1을 증폭하고 수정된 pLVX-EF{10}IRES-mCherry에 제품을 복제했습니다. 척추(Takara, #631987). IRES 및 mCherry 요소를 제거하고 V5 태그로 대체하여 PER1(플라스미드 MW206)에 대한 N-말단 융합을 허용했습니다. 빈 벡터(EV) 대조군의 경우, PER1 코딩 서열은 존재하지 않았지만 다른 모든 요소는 남아 있었습니다(플라스미드 MW93). pLVX-v5Per1(역가: 1.3 × 108 IFU/ml) 및 pLVX-EV(역가: 1.5 × 108 IFU/ml)에 대한 렌티바이러스는 USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory에서 생산되었습니다. 모든 렌티바이러스 구축물은 EF1 프로모터 하에 발현되었다.

pLVX-v5Per1 및 CRISPR-SAM의 세포 배양 검증. pLVX-v5Per1이 Per1 mRNA의 과발현을 생성하는지 확인하기 위해 마우스 HT22 세포(Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031)를 Lipofectaine LTX(Invitrogen)를 사용하여 pLVX-v5Per1 또는 pLVX-EV(그림 5a)로 형질감염시켰다. 마찬가지로 CRISPR-SAM 시스템이 Per1 전사를 효과적으로 유도할 수 있는지 확인하기 위해 HT22 세포를 dCas{18}}VP64(lenti MS{20}}P{21}}HSF{22}}Blast Feng Zhang Addgene 플라스미드 #61425의 선물), MS{24}}P{25}}HSF1(lenti dCAS-VP64_Blast는 Feng Zhang의 선물, Addgene 플라스미드 #61426) 및 Per1 sgRNA(Per1 sgRNA) 또는 비표적화 대조군 sgRNA(ctrl sgRNA)(lenti sgRNA(MS2){34}}zeo 백본은 Lipofectamine LTX(Invitrogen)를 사용하는 Feng Zhang, Addgene 플라스미드 #61427의 선물이었습니다. 세포를 24시간 또는 48시간 후에 수확하고, 용해시키고, 위에서 설명한 바와 같이 mRNA를 단리하였다. qRT-PCR은 표 S4에 나열된 Per1, Per2 및 Hes7 프라이머와 프로브를 사용하여 위에서 설명한 대로 수행되었습니다.

siRNA. Per1 녹다운 실험을 위해 Per1을 표적으로 하는 Accell SMARTpool small interfering RNA(siRNA, Dharmacon, GE)를 ddH20에서 최종 총 농도 1{5}} μM으로 희석하고 DH(1.0 ul/side)에 주입했습니다. Accell non-targeting pool siRNA를 대조군(총 농도, 10μM)으로 사용하였고 동일한 방법으로 주입하였다. siRNA 실험을 위해, 마우스를 위에서 설명한 대로 취급하고 적응시켰고, 습관화 마지막 날 다음날 수술을 수행하였다. 마우스는 수술 후 하루 종일 회복되었으며 다음 날(수술 후 ~48시간) 최대 표적 녹다운을 보장하기 위해 훈련을 받았습니다. 녹다운을 보장하기 위해 테스트 후 ~1시간 후에 마우스를 희생시키고 등쪽 해마의 펀치를 웨스턴 블롯으로 처리하여 PER1 단백질의 녹다운을 보장했습니다.

물체 위치 및 물체 인식메모리작업. 개체 위치 및 개체 인식 메모리 작업을 위해 마우스를 4일 동안 하루 2분 동안 처리한 다음 개체가 없는 상태에서 연속 6일 동안 하루 5분 동안 상황에 적응했습니다. 훈련하는 동안 마우스를 두 개의 동일한 물체(100ml 비커, 향신료 통 또는 유리 촛대)에 노출시키고 10분 동안 탐색하도록 했습니다. 머무름 테스트 중(장기적으로는 24시간 후메모리또는 단기 기억의 경우 60m 후), 마우스를 5분 동안 탐색하도록 허용했습니다. 개체 위치메모리, 두 개의 친숙한 개체 중 하나가 새 위치로 이동되었습니다. 물체 인식용메모리, 개체 위치는 일정하게 유지되었지만 개체 중 하나가 새 항목으로 대체되었습니다. 객체 인식 메모리에 대한 습관화는 OLM 테스트가 완료된 후 최소 1주일 후에 시작되었으며 새로운 컨텍스트와 익숙하지 않은 객체가 사용되었습니다48. 마우스 머리가 물체를 향하고 1cm 이내로 왔을 때 또는 코가 물체에 닿았을 때 탐색을 채점하였다. 총 탐색 시간(t)을 기록하고 소설 항목에 대한 선호도를 차별 지수(DI{2}}(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100%)로 표시했습니다. 교육 세션의 경우 테스트 시 이동하도록 지정된 개체를 새로운 개체로 사용하여 교육 및 테스트 DI를 직접 비교할 수 있습니다. 테스트 중 2초 미만 또는 훈련 중 3초 미만 동안 두 개체를 모두 탐색한 마우스는 추가 분석에서 제외되었습니다. 훈련(DI > ±20) 동안 한 개체에 대한 선호도를 나타낸 마우스도 제거되었습니다. ANY-maze 행동 분석 소프트웨어(Stoelting Co)를 사용하여 습관화 세션을 분석했습니다(이동한 거리 및 속도를 결정하기 위해). 모든 습관화, 훈련, 테스트 및 채점은 실험 그룹에 대해 눈이 먼 실험자들에 의해 수행되었습니다.

상황에 대한 두려움을 조건화하십시오. 상황적 공포 조건화를 위해 마우스를 먼저 5일 동안 처리했습니다. 수집하는 동안 마우스는 일반적으로 강력한 장기 기억을 생성하는 프로토콜인 2초(0.75mA) 충격이 뒤따르는 2분 28초 동안 컨텍스트에 노출되었습니다. 마우스는 제거되기 전에 추가로 30초 동안 컨텍스트에 남아 있었습니다. 마우스는 처리되었지만 훈련되지 않은 홈케이지 컨트롤과 함께 훈련 후 60m를 희생했습니다. 동결 거동은 Ethovision 11 소프트웨어(Noldus)12를 사용하여 측정되었습니다.

높은 플러스 미로. 플러스 미로는 실험군에 대해 무지한 실험자가 수행하였다. ORM 완료 1주일 후, 마우스의 하위 집합이 플러스 미로에서 테스트되었습니다. 미로의 두 팔은 열려 있고(30 × 5 cm) 두 팔은 둘러싸여 있으며(30 × 5 × 15 cm) 중앙 플랫폼(5 × 5 cm)으로 연결되어 있습니다. 미로는 바닥에서 40cm 높이에 있습니다. 마우스는 열린 팔 중 하나를 마주하는 중앙 플랫폼에 각 마우스를 배치하는 것으로 구성된 장치에서 5분 동안 테스트되었습니다. 피험자들 사이에 미로를 70% 에탄올로 청소했습니다. 닫힌 팔과 열린 팔에서 보낸 시간의 백분율은 ANY-maze 소프트웨어를 사용하여 기록되었습니다.

일주기 리듬 분석. 젊은({0}}mo) 및 노화(18-mo) HDAC3 plus/plus 및 HDAC3flox/flox 마우스를 12시간의 명암(LD) 주기로 사육하고 수용했습니다. AAV-CaMKII-Cre 주입(상기 기재) 2주 후, 마우스를 7일 동안 격리된 12시간 LD 연행실로 옮겼다. 그런 다음 마우스를 빛이 차단된 활동 분석실로 옮겨 광학 빔 모션 감지기(Philips Respironics)를 사용하여 운동 활동을 분석했습니다. 마우스를 추가 3주 동안 일정한 어둠(DD)으로 전환하기 전에 광 보호된 방에서 LD 주기 연행의 2주 동안 활성을 모니터링했습니다. 활성 모니터링은 DD 단계 전반에 걸쳐 계속되어 DH의 HDAC3 결실이 내인성 일주기 리듬에 영향을 미치는지 여부를 결정했습니다. 데이터는 Minimitter VitalView 5.0을 사용하여 수집되었으며 Clocklab 소프트웨어(Actimetrics)는 자유 활동의 시작을 결정하는 데 사용되었습니다. Tau 값은 이 시작의 기울기를 얻고 Clocklab 소프트웨어로 최소 제곱 맞춤을 계산하여 계산되었습니다.

면역조직화학. 행동이 완료된 후 마우스를 경추 탈구로 안락사시키고 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 이소펜탄으로 급속 냉동했습니다. 20마이크로미터 슬라이스를 등쪽 엉덩이 캠퍼스 전체에 걸쳐 수집하고 슬라이드에 해동하여 -8{8}}도에서 보관했습니다. 슬라이드는 4% 파라포름알데히드(10-분)로 고정되었으며, 0로 투과되었습니다.{49}}0.1M PBS(5-분)에서 1% Triton X{10}} , 8% 정상 염소 혈청(Jackson)으로 1시간 동안 차단했습니다. 슬라이드를 HDAC3(1:250, Abcam, 클론 Y415, ab32369) 또는 V5(1:1000, Abcam, ab9116)에 대한 토끼 항체 또는 GFP(1:250, Aves Labs, #GFP1010). 다음 날, 슬라이드를 세척하고 염소 항토끼 Alexa 488(HDAC3 및 V5; 1:1000, ThermoFisher, #A{36}}) 또는 염소 항닭 Alexa 488(GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A{41}}) 어둠 속에서. 그런 다음 슬라이드를 PBST로 세척하고 형광 nissl 염색인 NeuroTrace 530/615(1:50; ThermoFisher, #N21482)에서 50분간 배양했습니다. 비특이적 자가형광51을 소멸시키기 위해 슬라이스를 0.01% Triton이 포함된 PBS로 세척하고 물로 헹구고 50mM 암모늄 아세테이트 완충액의 10mM CuSO4에서 10-분 동안 인큐베이션했습니다. 슬라이스를 다시 물로 헹구고 PBS로 세척하고 VectaShield Antifade 장착 매체(Vector Laboratories)로 덮었습니다.

모든 이미지는 VS110 스캐너 소프트웨어가 포함된 20x apochromatic 대물렌즈(개구수 0.75)가 있는 Olympus Scanner VS11{2}}으로 수집되었습니다. 모든 처리 그룹은 각 슬라이드에 표시되었으며 슬라이드의 모든 이미지는 비포화 조건에서 동일한 노출 시간으로 캡처되었습니다. 면역 표지 강도는 CA1에서 세포층의 광학 밀도를 샘플링하고 동일한 이미지에서 배경 형광 샘플을 빼서 ImageJ로 정량화했습니다. 모든 AAV 실험에서 등쪽 해마의 CA1 영역에서 바이러스를 발현하지 못한 동물은 분석에서 제외되었습니다. 이미징 및 정량화는 실험 조건에 대해 무지한 실험자들에 의해 수행되었습니다.

웨스턴 블롯. PER1 녹다운을 확인하기 위해 테스트 후 2시간 후에 Per1 siRNA와 대조군 siRNA 마우스를 희생하고 뇌를 급속 동결했습니다. 뇌를 관상으로 절단하고 5{19}}0μm 슬라이스에서 1mm DH 펀치를 수집했습니다. 펀치는 Dounce 균질화기를 사용하여 Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Thermo Fisher)가 있는 T-PER 완충액(Thermo Fisher)에서 균질화되었습니다. 변형된 Bradford 분석(BioRad)을 사용하여 단백질 용해물을 정량하고 5{31}} ug 총 단백질 용해물을 7.5% NuPAGE Bis-Tris 젤(Thermo Fisher)의 각 레인에 로딩했습니다. 겔은 200볼트에서 50분 동안 작동되었고 블롯은 4도에서 15V에서 밤새 니트로셀룰로오스 막(Novexi, LC2001)으로 이동되었습니다. 다음 날, 막을 차단 완충액에서 1시간 동안 배양하고(0.01% Tween 20이 포함된 Tris 완충 식염수 중 5% 무지방 우유), 세척(TBS 중 0.1% Tween 20)한 다음, 1차 항체(1:500, 토끼 항-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) 1차 항체 완충액(TBS 중 3% BSA, 0.1% Tween 포함)을 4도에서 밤새. 그런 다음 막을 세척하고 토끼에 대한 HRP 결합 마우스 항체(1:10,{37}}, Jackson Laboratories, light chain-specific, #{39}})에서 1시간 동안 배양했습니다. 멤브레인을 세척하고 Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce, 34077)를 사용하여 현상했습니다. 선형성을 검증하기 위해 다중 필름 노출이 사용되었습니다. 블롯을 세척하고 Restore Western Blot Stripping Buffer(Thermo Fisher #21059)로 10m 동안 스트립핑하고 다시 세척한 다음 GAPDH에 대한 토끼 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778)로 밤새(4도) 다시 프로빙했습니다. ). 전체 길이 PER1 및 GAPDH 블롯은 보충 그림 5에 나와 있습니다. 상대 광학 밀도는 실험 조건에 대해 무지한 실험자가 ImageJ(미국 국립 보건원)를 사용하여 스캔한 필름에서 계산되었습니다. 모든 값은 GAPDH 발현 수준으로 정규화되었습니다.

qRT-PCR. DH 펀치(위에서 설명)에서 조직을 수집하고 처리할 때까지 -80도에서 동결했습니다. RNA는 RNeasy Minikit(Qiagen, #74104)을 사용하여 분리되었고 cDNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, 04379012001)를 사용하여 생성되었습니다. 프라이머 및 프로브는 Roche Universal ProbeLibrary(표 S4)에서 파생되었으며 Roche Light-Cycle 480 II 기계(Roche)에서 다중화에 사용되었습니다. 모든 값은 Gapdh로 정규화되었습니다. 분석 및 통계는 Pfaffl 방법52,53에 기반한 Roche 독점 알고리즘과 REST 2009 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9개가 분석에 포함되었습니다. 각 그룹의 cDNA 라이브러리는 TruSeq RNA 샘플 준비 가이드(Illumina)에 따라 준비되었습니다. 각 마우스의 총 RNA 250나노그램을 폴리-T 올리고가 부착된 자기 비드로 정제하고 열 조각화했습니다. 그런 다음 첫 번째 및 두 번째 가닥 cDNA를 합성하고 정제했습니다. 말단이 무디어진 후, 어댑터 결찰 동안 템플릿의 연결을 방지하기 위해 3' 말단을 아데닐화하였다. 각 그룹에 대해 고유한 어댑터 세트를 cDNA 끝에 추가하고 라이브러리를 PCR로 증폭했습니다. 라이브러리의 품질은 Bioanalyzer로 평가하고 상용 시퀀싱 라이브러리(Illumina)에서 준비한 표준 곡선을 사용하여 qRT-PCR을 사용하여 정량화했습니다. 샘플은 시퀀서의 각 플로우 셀에 표시되는 각 행동 그룹과 함께 다중화되었습니다. 각 라이브러리의 10nM은 4개의 멀티플렉스 라이브러리에 풀링되었고 단일 판독 50bp 시퀀싱 동안 Illumina HiSeq 2500 기기에서 시퀀싱되었으며 University of California, Irvine의 Genomic High-Throughput Facility에서 실행되었습니다. 각 라이브러리에 대한 결과 시퀀싱 데이터는 후처리되어 FastQ 파일을 생성합니다. 그런 다음 Illumina CASAVA 1.8.2 소프트웨어와 사내 소프트웨어를 사용하여 데이터를 역다중화하고 필터링했습니다. 품질이 낮은 판독값(Illumina의 표준 품질 테스트에 실패함)과 PhiX 컨트롤 게놈에 성공적으로 정렬된 컨트롤 판독값은 분석에서 제거되었습니다. 나머지 시퀀스의 품질은 시퀀싱 실행의 기본 호출 단계에서 실시간으로 생성된 PHRED 품질 점수를 사용하여 추가로 평가되었습니다(보충 그림 3a).

참조 게놈 및 전사체에 대한 정렬. 각 실험의 판독값은 짧은 판독값 정렬기 ELAND v2e(Illumina) 및 Bowtie24를 사용하여 참조 게놈 및 해당 전사체에 별도로 정렬되었습니다. 두 도구에 의해 알려진 엑손 또는 스플라이스 접합에 대해 고유하게 정렬된 판독은 판독의 25bp 단편에서 2개 이하의 불일치가 있는 전사체에 포함되었습니다. 읽기는 고유하게 정렬되지만 읽기의 25bp 단편에서 2개 이상의 불일치가 있는 경우 분석에서 제거되었습니다. 유사하게, 참조 게놈의 여러 위치와 일치하는 판독값은 분석에서 제거되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 참조 게놈 및 전사체에 할당된 읽기 비율은 각 복제 그룹에 대해 보고됩니다(보충 그림 3b). 그 결과 샘플당 평균 약 3천만 개의 읽기가 발생했습니다.

렌티바이러스 주입 후 pLVX 및 CRISPR-SAM 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 행동에 따라 그룹당 3마리 동물의 하위 집합에서 해마 샘플에서 RNA 시퀀싱을 실행했습니다. 생체 내에서 렌티바이러스에 감염된 세포의 수가 너무 작아서 RT-qPCR(보충 그림 6a, d)을 사용하여 적절한 전사체의 존재를 안정적으로 감지할 수 없었기 때문에 RNA-seq를 보다 민감한 방법으로 사용하여 존재를 감지했습니다. 이 성적표의. 업데이트된 버전의 게놈 어셈블리 및 게놈 주석은 각각 원래 mm10 마우스 게놈 및 mm10 마우스 게놈 주석에 플라스미드 구성의 서열 및 주석을 추가하여 구축되었습니다. Tuxedo Suite54의 읽기 정렬 도구인 TopHat을 사용하여 읽기를 게놈에 매핑하고 내인성 마우스 참조 게놈과 비교하여 플라스미드 전사체에 고유한 히트만 플라스미드 구성에 "일치된 읽기"로 간주했습니다. 그런 다음 일치하는 읽기 수를 각 샘플의 각 구성에 대해 정량화했습니다.

유전자 발현 및 차등 분석. 유전자 발현 수준은 각 복제에 대한 읽기 정렬 결과에서 직접 계산되었습니다. 표준 RPKM 값55, 매핑된 읽기 백만 개당 엑손 모델의 킬로베이스당 읽기)가 이 연구에서 사용된 시퀀싱 데이터 및 각 복제에 포함된 각 유전자에 대해 추출되었습니다.

OLM 후 상향 또는 하향 조절된 유전자를 식별하기 위해 각 그룹 쌍(홈케이지 대 훈련 후 6{26}} m)에 대해 Cyber ​​T56,57을 사용하여 차등 전사 분석을 수행했습니다. 현재 연구를 위해 훈련된 18-개월된 HDAC3 plus/plus 및 HDAC3flox/flox 마우스 외에도 {{10}}개월된 C57 야생형 마우스의 RNA 시퀀싱 데이터를 동일하게 처리했습니다( 이전 연구20)의 homecage 및 OLM-trained in the same way as the same way from the Differential analysis를 사용했습니다. 각 그룹에 대한 동물(생물학적 복제)의 수는 다음과 같습니다. Young HDAC plus / plus HC: 6, Young HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3 plus / plus HC: 6, Old HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, 기존 HDAC3flox/flox OLM: 8. 기술적 복제가 사용되지 않았습니다. 미분 표현을 결정하는 데 사용되는 p-값 임계값은 모든 그룹에 대해 0.05입니다. Benjamini & Hochberg(BH) q-값으로 측정한 FDR(False Discovery Rate)을 사용하여 FDR 임계값이 0.15인 다중 테스트를 수정했습니다. 이 3개 그룹(젊은 야생형, 노화 HDAC 플러스/플러스 또는 노화 HDAC3flox/flox)에 대한 경험(홈케이지와 비교) 후에 상향 조절된 유전자 세트를 교차시켜 두 개 이상의 그룹에 공통적인 유전자를 결정했습니다. 조직 특이적 발현, 유전자 온톨로지 용어58 및 KEGG 경로59,60에 대한 각 그룹의 농축은 행동 후 차등적으로 발현되는 유전자를 기반으로 DAVID61을 사용하여 평가되었습니다. 데이터 시각화는 파이썬의 경우 "matplotlib"와 R의 경우 "ggplot"을 사용하여 수행되었습니다.

염색질 면역 침전. Millipore ChIP 키트11,12,62의 프로토콜을 기반으로 DH 펀치에서 ChIP를 수행했습니다. 조직을 1% 포름알데히드(Sigma)로 가교하고, 용해 및 초음파 처리하고, 염색질을 2 ul의 항-H4K8Ac(Millipore #17-10099) 또는 4 ul의 항-HDAC3(Millipore #{{ 13}}) 또는 등가량의 정상 토끼 혈청(H4K8Ac 음성 대조군, Millipore) 또는 항-마우스 IgG(HDAC3 음성 대조군, Millipore). 세척 후 비드에서 염색질을 용출하고 DNA의 컬럼 정제 전에 proteinase K의 존재하에 역가교시켰다. 각 유전자의 프로모터에 대한 프라이머 서열은 프라이머 3 프로그램에 의해 설계되었습니다(표 S4). 5 ul의 입력, 항-H4K8Ac IgG/항-HDAC3 IgG, 또는 각 동물로부터의 항-토끼/마우스 IgG 면역침전물을 이중으로 조사하였다. ChIP-qPCR 데이터를 정규화하기 위해 백분율 입력 방법을 사용했습니다. 입력 샘플을 100%로 조정하고 IP 및 IgG 샘플 모두 100*AE^(조정된 입력 - Ct(IP)) 공식을 사용하여 이 입력의 백분율로 계산했습니다. 그런 다음 폴드 농축을 평균 IgG에 대한 ChIP의 비율로 계산했습니다. 플레이트 내 표준 곡선은 증폭 효율(AE)을 결정했습니다.

슬라이스 준비 및 녹음. 어린(대략 3-월) 및 노화(18-월) 생쥐에 정위적으로 바이러스를 주입했습니다. 첫 번째 실험을 위해 젊고 오래된 HDAC3 plus/plus 및 HDAC3flox/flox 마우스에 AAV-CaMKII-Cre를 양쪽 DH에 주입했습니다. 두 번째 실험을 위해 젊고 오래된 야생형 C57 마우스에 AAV-HDAC3(Y298H)을 한 반구의 DH에 주입하고 AAV-EV 대조군을 다른 반구에 주입했습니다. 주입 2주 후(최적의 바이러스 발현을 허용하기 위해)2 가로 해마 슬라이스(320μm)를 예열된(31 ± 1도) 인공 뇌척수액(124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM)이 있는 인터페이스 기록 챔버에 넣었습니다. KH2PO4, 1.5mM MgSO4, 2.5mM CaCl2, 26mM NaHCO3 및 10mM D-포도당). 슬라이스 표면은 따뜻하고 가습된 95% O2/5% CO2에 노출되는 동안 분당 1.75-2ml의 속도로 연속적으로 관류되었습니다. 적어도 2시간의 인큐베이션 후에 기록이 시작되었습니다.

필드 흥분성 시냅스 후 전위(fEPSP)는 2M NaCl로 채워진 단일 유리 피펫(2-3MΩ)을 사용하여 CA1b 지층 방사체에서 기록되었습니다. 자극 펄스(0.{13}}5Hz)는 CA1c에 위치한 양극성 자극 전극(트위스트 니크롬 와이어, 65μm)을 사용하여 Schaffer 측부 교감 투영에 전달되었습니다. 전류 강도는 최대 fEPSP 응답의 50%를 얻도록 조정되었습니다. 안정적인 기준선이 설정된 후 LTP는 5개의 ta 버스트로 구성된 단일 트레인으로 유도되었으며 각 버스트(100Hz에서 4개의 펄스)가 200ms 간격으로(즉, ta 주파수에서) 전달되었습니다. 자극 강도는 TBS 동안 증가하지 않았습니다. 데이터는 NAC 2.0 Neurodata Acquisition System(Theta Burst)으로 수집 및 디지털화되었습니다.

통계 분석. 통계 분석은 Prism 6(GraphPad)을 사용하여 텍스트 및 그림 범례에 표시된 대로 수행되었습니다. 우리의 분석 접근 방식은 이전에 게시된 작업12,2{14}},63,64을 기반으로 합니다. 표본 크기를 미리 결정하는 데 통계적 방법이 사용되지 않았지만 우리의 표본 크기는 이전 간행물12,20,64,65에서 보고된 것을 포함하여 현장에서 일반적으로 사용되는 것과 유사합니다. 데이터 분포는 그룹 간에 유사한 분산이 관찰되는 정상적인 것으로 가정되었지만 공식적으로 테스트되지 않았습니다. 실험에 비교할 두 그룹이 있는 경우 양측 스튜던트 t-검정이 사용되었습니다. 두 가지 요인(예: 연령 및 유전자형 또는 세션 및 그룹)을 비교할 때 양방향 ANOVA로 데이터를 분석한 후 Sidak의 다중 비교 사후 테스트를 수행했습니다. 모든 분석은 양측이 있으며 유의성을 위해서는 0.05의 값이 필요합니다. 모든 그림의 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 모든 실험에서 그룹 평균의 ±2SD 값은 이상값으로 간주되어 분석에서 제거되었습니다.

데이터 가용성. 이 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 합당한 요청이 있을 경우 교신저자에게 제공됩니다. RNA 시퀀싱 데이터는 NCBI의 유전자 발현 옴니버스에 기탁되었으며 GEO 시리즈 수탁 번호 GSE94832를 통해 액세스할 수 있습니다.

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