접촉:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp : 008618081934791

Pls 1 부에 여기를 클릭하십시오

Cistanche 허브는 매우 좋은 신경 보호 효과가 있습니다.

2.6. Caspase-3/7 활성 측정에 의해 결정된 사이토키닌의 항세포사멸 효과

상기 기술된 PI 염색 분석법에 의해 나타난 바와 같이, SAL은 SH-SY5Y 세포의 사멸률의 증가를 유도하였다. SAL이 아폽토시스 및 괴사 둘 다와 관련되기 때문에[51] 우리는 또한 세포를 CKs에 노출시킨 후 아폽토시스의 특이적 마커로서 카스파제-3 및 7 (casp-3/7)의 활성화를 조사하였다 [52] 각각의 시험 화합물로 처리한 후 기록된 Caspase-3/7 활성은 500 uM SAL (100%로 설정됨)으로 처리한 후 기록된 것에 대하여 정규화하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 잘 알려진 카스파제 억제제 Ac-DEVD-CHO (특이적, 아폽토시스 관련 대조군으로서 포함됨)는 서브마이크로몰 농도에서 카스파제-3/7 활성을 강하게 억제하였다 (각각 0.05 및 0.5 uM에서 SAL 단독으± 처리된 세포에서 36.3 내지 2.66 및 25.2 ± 2.69% 수준). 유사한 수준의 억제는 신경변성의 상이한 시험관내 SH-SY5Y 세포 기반 모델에서 이전에 ob-서빙되었다[53]. 양성 대조군 NAC는 또한 카스파제-3/7 활성을 각각 100 uM 및 1000 uM±서 SAL-유도된 수준의 88.7 ± 1.87% 및 78.5 및 2.56%로 유의하게 감소시켰다. 테스트 된 CK는 카스파제 -3/7 활동에 다양한 영향을 미쳤습니다. 흥미롭게도 CK 리보시드로부터, 오직 cZR만이 0.1 uM에서의 활성에 유의한 영향을 미쳤고(각각 83.3 ± SAL-유도 수준의 4.33%로 감소), 1 uM에서의 iPR은 casp-3,7의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 마지막으로, K3G는 10 uM에서 최대 효과로 카스파제-3/7 활성을 감소시켰다(SAL-유도 수준의 81.7 ± 4.31%까지). 전반적으로, SAL-건강한 대조군 세포에 비해 카스파제-3/7 활성의 1.6배 증가를 유도하였고(CTR, 도 4), 이전 연구의 결과에 따라, 유사한 SAL 농도(400 uM)와 동일한 세포주가 사용되었다[54]. NAC는 여러 모델에서 카스파제-3/7 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.신경죽음 [55~58항]. 그러나, 여기에 제시된 결과는 SH-SY5Y 세포 기반 SAL-유도 모델에서 그들의 카스파제-3/7의 첫 번째 시연을 제공한다.신경죽음. 양성 대조군은 CKs와 유사한 방식으로 500 uM SAL에 의해 유도된 카스파제-3/7 활성을 감소시켰지만, cZR 및 K3G는 서브마이크로몰 또는 마이크로몰 농도에서도 효과적이었다. PD (SH-SY5Y 세포 [17] 및 섬유아세포[15]에서 프로테아좀 억제제 MG 132- 또는 H2O2 유도 독성) 및 헌팅턴병(PC12 세포에서의 혈청 기아 모델[19])과 관련된 스트레스 모델을 사용한 다른 연구들은 또한 CKs K 및 tZR이 항세포자멸제(caspase-3) 활성을 가질 수 있고[17], K 및 tZR 둘 다 항노화 활성을 가질 수 있다는 것을 보여주었다[17,19]. 또한, casp-3,7 활성화 감소와신경 보호활성은 SAL 및 SAL 관련 모델에 대해 보고되었다[54,59,60].

그림 4. PD.의 SAL-유도 모델에서 카스파제-3/7 활성은 적어도 4개의 독립적인 날에 삼중으로 작용한다. *P는 500 uM SAL을 갖는 차량과 비교하여, #P는 500 uM SAL이 없는 차량과 비교하였다.

2.7. 글루타메이트 유도 세포사체 모델에서 사이토키닌 신경보호 활성의 확인

SH-SY5Y 세포가 모든 NMDA 수용체 서브유닛을 발현하지 않기 때문에[61], 글루타메이트(Glu) 독성의 가장 가능성 있는 메카니즘은 산화 스트레스의 대규모 유도를 갖는 시스틴/글루타메이트 Xc-항포터의 막힘이다[62]. 이전의 저자들은 이미 SH-SY5Y 세포에서 글루타메이트-유도된 세포 사멸과 괴사증 사이의 연관성을 입증했으며[63], 글루타메이트-유도된 독성에서 카스파제-3 활성화의 중요성이 그들을 병동에 노출시킨다[62,64]. 몇몇 연구는 또한 글루타메이트 중독 후 철 구동 세포 사멸 (ferroptosis)의 발생을 보여 주었고 [62,65,66], Xc-antiporter 시스템의 봉쇄에 따른 세 가지 유형의 세포 사멸 (괴사, 아폽토시스 및 페로 폽토시스)의 발생을 나타냈다. 에 대한 포괄적 인 평가를 완료하기 위해신경 보호테스트의 잠재력사이토키닌글루타메이트-유도된 세포사멸 분석 시스템은 공지된 분석 패널에 포함되었다.신경 보호철 킬레이터 데페록사민 (DFO) 및 네크로톤증 네크로스타틴-1 (NEC-1)의 억제제[67]를 양성 대조군으로 한다. 여기서, SH-SY5Y 세포를 48시간 동안 분화시킨 다음, 160 mM Glu로 처리하거나 이들을 다양한 공동처리로 처리하였다.사이토키닌농도 (0.1-10 uM)를 24 시간 동안 PI로 염색했습니다. 이 모델에서, 세포 사멸에 대한 Glu의 효과는 100% PI 신호였으므로, 시험 화합물에 의한 세포 사멸의 감소가 평가되었다. Glu는 건강한 SH-SY5Y 대조군에 비해 세포 사멸의 거의 4배 증가를 유도하였다(26.1 ± 0.42%). 양성 대조군의 스크리닝 및사이토키닌양성 대조군 NEC-1 (50 uM, 76.6 ± 2.51 %)과 DFO (10 uM, 84.2 ± 4.54 %)가 글루타메이트에 의해 유도되는 세포 사멸을 감소시켰다는 것을 밝혀냈다. 그림 5A에 표시된 바와 같이,사이토키닌, 단 세 개사이토키닌보호 할 수있었습니다.신경세포-유사 SH-SY5Y 세포는 양성 대조군과 유사한 방식으로 유사하다. 가장 활동적인사이토키닌트랜스-제아틴(tZ)(0.1 uM, 79.5 ± 2.91%; 1 uM, 81.3 ± 2.77%)과 시스-제아틴(CZ)(0.1 uM, 82.1 ± 3.29%; 1 uM, 86.2 ± 2.89%)과 키네틴(K)(1 uM, 88.0 ± 3.76%; 10 uM, 79.9 ± 3.44%)이었다. 그들의 유망한 활성을 확인하기 위해, 직교 분석법을 사용하여이 모델에서 CKs의 생물학적 효과를보다 자세히 설명했습니다 : 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 분석 [68], 이는 또한 Glu 처리 후 독성의 극적인 (4 배) 증가를 나타냈다. 흥미롭게도, LDH 방출의 결정은 우리가 CK의 활동과 양성 대조군 (NEC-1 및 DFO)을 구별 할 수있게 해주었습니다. CKs는 적당하지만 유의한 보호 활성을 가졌다 (tZ는 사망률을 0.1 uM에서 91.9 ± 1.40 %로 감소시켰다; cZ는 0.1 uM에서 92.3 ± 1.15 %, 1 uM에서 1.56 %± 91.7 %로 감소시켰다; K는 92.2 ± 1 uM에서 1.06 %)로 감소했습니다. 양성 대조군 NEC-1 및 DFO는 더 강한 보호 효과를 나타냈지만 훨씬 더 높은 농도에서 효과적이었다(76.9 ± 50 및 10 uM에서 각각 2.94% 및 81.6 ± 3.74%로 감소). LDH 분석은 PI 염색으로 얻은 적응증을 검증하고 양성 대조군의 관찰 된 효과는 공개 된 데이터와 일치했다 [69,70]. HT22 세포에서 Glu-유도 세포 사멸 모델에서 K의 효과에 관한 연구 결과 [18] 및 tZ, cZ 및 K와 같은 대표적인 CK의 효과에 대한 우리의 관찰은 CK가 산화 스트레스와 관련된 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 유망한 후보자임을 보여줍니다 [71]. 마지막으로, tZ 및 cZ는 더 낮은 농도에서 효과적이었고 산화 스트레스 및 카스파제-3,7 활성화의 수준에 미치는 영향에 대한 추가 연구를 위해 K와 함께 선택되었기 때문에 선호되었습니다.

시스탄체개 이용 후기의 효과에신경 보호

2.8. SH-SY5Y 세포에서 글루 유도된 산화 스트레스에 대한 사이토키닌의 영향

이전 모델과는 달리, Glu는 상이한 경로에 의해 SH-SY5Y 세포에서 산화 스트레스를 유도할 수 있다. 하나는 시스틴 / 글루타메이트 (Xc-) 항 포터의 막힘에 기초하며, 이는 글루타티온 (GSH) 고갈과 수퍼 옥사이드 디스뮤타제 (SOD) 활성에 부정적인 영향을 미칩니다 [62]. 글루-매개된 세포 사멸은 또한 SH-SY5Y 세포에서 Rac-NADPH-옥시다제-구동 ROS (특히 수퍼옥사이드 라디칼) 형성을 추정적으로 수반한다[72]. 이들 발견은 Glu-유도된 모델에서 세포 사멸의 주요 원인이 OS라는 것을 나타낸다. 모델 내에서,신경세포-유사 세포를 Glu 및 시험된 화합물과 공동처리하고, DHE에 의해 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 6A에서 볼 수 있는 바와 같이, 글루 처리된 세포에서 적색 DHE 형광의 극적인 상승이 관찰되었고, 이는 양성 대조군 물질 및 시험된 CKs에 의해 개선되었다. 현미경 관찰에 기초하여, 수퍼옥사이드 수준의 정량화는 DHE 검정에 의해, SAL 유도 세포에 있는 것과 유사한 방식으로 글루-유도된 세포에서 수행되었다. 결과는 Glu 단독에 의해 유도 된 수준 (100 %로 설정)에 대하여 정규화되었으며, 이는 단지 4 h 이내에 수퍼 옥사이드 수준의 극적이고 거의 3 배 증가를 일으켰습니다.신경세포- SH-SY5Y 세포와 유사한 건강한 대조군 세포의 수준에 비해 (CTR : 33.79 ± 1.45 %). 도 6B에 나타낸 바와 같이, tZ, cZ, 및 K와 같은 CKs는 Glu-중독된 세포에서 수퍼옥사이드 수준을 유의하게 감소시켰다: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM 및 10 uM K는 Glu 단독으로 처리된 세포에서 81.0 ± 4.03, 80.6 ± 3.89, 81.8 ± 3.39 및 83.8 ± 2.32% 수준으로 감소시켰다. 이러한 수준은 괴사증 억제제 NEC-1 (5 uM에서 80.5 ± 3.19 % 및 50 uM에서 80.4 ± 2.70 %)과 철 킬레이터 DFO (10 uM에서 80.2 ± 3.80 %)로 얻은 수준과 비슷합니다. Glu-유도된 세포사 모델, 특히 양성 대조군의 효과로 수득된 결과는 이전의 보고와 일치한다[70,73]. CKs가 Glu-유도 또는 유사한 모델에서 OS-감소 효과를 갖는다는 이전의 증거는 K가 HT22 세포-기반 Glu-유도된 세포사 모델에서 강력한 OS-환원제(대략 23 uM에서)라는 것을 입증하는 것으로 제한된다[18]. 우리는 K가 SH-SY5Y 세포에서 더 낮은 농도 (1-10 uM)에서 OS 감소 효과를 나타냈다는 것을 발견했습니다. 또한, 과산화수소-분해 활성을 포함하는 인간 섬유아세포에 대한 tZ의 유익한 장기 효과가 관찰되었으며[15], 이는 tZ 및 cZ가 Glu-유도된 세포사 모델에서 간접적인 OS-감소 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 또한 다른 보고서는 CKs 매개 OS 감소 효과와 보호 활동 사이의 연관성을 지적했습니다 [22,74-76]. 종합하면, tZ, cZ 및 K는 전반적으로 다른 강점에도 불구하고 긍정적 인 대조군의 것과 비교할 수있는 놀라 울 정도로 강력한 OS 감소 효과를 나타 냈습니다.신경 보호효과.

그림 5. (A) 사망률신경세포글루타메이트(Glu)에서 SH-SY5Y 세포와 유사-유도된 세포 사멸의 모델; (b) 글루-유도된 독성(LDH-방출)의신경세포- SH-SY5Y 세포와 유사. 적어도 삼일 동안 삼중으로 증가한다.* P는 160 uM Glu를 갖는 차량과 비교하여, #P는 160 uM Glu가 없는 차량과 비교된다.

그림 6. (a) Glu-유도된 산화 스트레스(OS) 및 인간에서 지시된 화합물의 OS-환원 활성신경세포-유사 SH-SY5Y 세포는 디하이드로에티듐 (DHE) 표지 후 형광 현미경으로 시각화되었다. 막대 = 50 um. 이미지 표시신경세포유사 SH-SY5Y 세포를 DMSO (대조군)에 의해 처리하고, 160 mM 글루타메이트 (Glu) 단독으로, 함께 : 10 uM 데페록사민 (+DFO), 50 uM 네크로스타틴-1 (+NEC-1), 0.1 uM tZ (+tZ) 및 0.1uM cZ (+cZ)를 4시간 동안 DHE에 의해 염색하였다. (b) 글루-유도된 수퍼옥사이드 라디칼 형성신경세포-유사 SH-SY5Y 세포 후 4 h. 그래프는 Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더(오스트리아 테칸)를 사용하여 DHE 염색된 세포의 정량화를 표시한다. 독립적 인 다섯 일 안에 세 배로 늘립니다.

*P는 160 uM Glu를 갖는 비히클과 비교하여, #P는 160 uM Glu가 없는 차량과 비교하였다.

2.9. 글루-유도된 세포사멸 모델에서 카스파제-3/7 활성에 대한 사이토키닌의 효과

Glu는 SH-SY5Y 세포에 대해 Xc-항포터 막힘과 관련된 HT22 세포에 대한 이전에 보고된 효과와 유사한 독성 효과를 갖는다. 따라서, 비-세포사멸 세포 사멸 기작(ferroptosis, necroptosis 등)은 카스파제-3의 발현과 어느 정도 발현되지만[62] NR1의 NMDA 서브유닛은 SH-SY5Y 세포에서 더욱 강하게 발생할 수 있다[61]. 따라서, 두 세포주에서 세포 사멸의 최종 단계는 다를 수 있다. 카스파제-3 활성의 기여 역할은 SH-SY5Y 세포의 Glu-유도된 세포 사멸 모델에서 많은 연구에서 관찰되었다[62,77-79]. 이 분석에서,신경세포-유사 SH-SY5Y 세포를 여기에서 160 mM Glu로 처리하였고, 이는 카스파제-3/7 활성의 상승을 유도한다. SH-SY5Y 세포의 글루-유도 사멸에서 아폽토시스의 역할을 해명하기 위한 노력에서, 특정 카스파제-3/7 억제제인 Ac-DEVD-CHO가 적용되었고 강력한 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다: 50 nM에서 카스파제-3,7 활성을 23.70 ± 처리된 세포에서 1.01% 수준으로 감소시켰다.

Glu 단독과 0.5 uM에서 거의 완전히 활성을 차단했습니다 (7.22 ± 1.05 %의 정규화 된 수준으로 감소; 건강한 세포에서 관찰 된 수준과 비교할 수 있음).

그림 7과 같이 7.8 ± 0.39%). 양성 대조군의 적용은 카스파제-3,7 활성의 점진적인 용량-의존적 감소를 가져왔다. 흥미롭게도, NEC-1은 50 uM에서 최대 효과와 함께 약간의 효과를 보였고 DFO는 10 uM에서 더 강력한 억제 활성을 가졌다 (활성은 각각 1.85 및 75.8 ± 80.5로 감소 ± 3.00 %). 반면에, 1uM에서의 tZ(89.5 ± 2.50%), 0.1uM에서의 cZ(87.4± 1.62%), 1uM에서의 K(91.0± 2.06%)에서의 k에 의해 casp-3,7에 대한 약간의, 그러나 유의한 효과가 달성되었다. 종합하면, 결과는 두 양성 대조군 모두 테스트 된 CK보다 더 강한 카스파제 -3/7 활성 감소 활성을 가졌지 만 CK는 훨씬 낮은 농도에서 효과를 나타냈다는 것을 보여줍니다. 전반적으로, 결과는 카스파제-3/7 활성의 조절이 강력한 데 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다.신경 보호Glu-유도된 세포사멸 모델에서 DFO[58]와 같은 작용제의 활성[79,80]. 그러나이 섹션에서 볼 수 있듯이 NEC-1도신경 보호활성은, 다른 유형의 세포 사멸이 뉴런-유사 SH-SY5Y 세포의 글루-유도된 사멸에 관여할 수 있음을 시사한다[63,67,81]. 카스파제-비의존성 메카니즘이 글루-유도된 세포 사멸에 관여한다는 징후는 또한 HT22 세포에 대한 NEC-1[70], DFO[69] 및 K[18]의 효과의 분석에서 얻어졌다.

그림 7. Glu에서의 카스파제-3/7 활성-산화 손상의 모델신경세포- SH-SY5Y 세포와 유사. 적어도 네 개의 독립적 인 날에 세 배로 늘립니다. *P는 160 uM Glu를 갖는 비히클과 비교하여, #P는 160 uM Glu가 없는 차량과 비교하였다.

3. 결론

요약하면, 우리의 연구는 CK와 그 대사 산물이신경 보호SAL의 유도 모델에서의 활동파킨슨 병및 Glu-유도된 인간 분화된 SH-SY5Y에서 산화적 손상신경셀. K3G, cZR 및 iPR은 생물학적으로 유의한 것으로 밝혀졌다.신경 보호활동. 더욱이, 활성 CKs는 양성 대조군 물질 NAC보다 낮은 (서브마이크로몰 및 마이크로몰) 농도에서 효과적이었다. K3G, cZR 및 iPR은 또한 생존력, 세포독성, 산화 스트레스 및 카스파제-3,7 활성(iPR 제외)에 긍정적인 영향을 미쳤다. 직교 시연은 항산화 스트레스 활성이 SAL 유도 세포 사멸 모델에서 CK의 보호 효과에 중요한 역할을한다는 것을 강력하게 나타냅니다. 테스트 된 CK (tZ, cZ 및 K)의 패널에서 세 가지 대사 산물 만 보호됩니다.신경세포SH-SY5Y 세포와 유사한 방식으로 산화적 손상의 Glu-유도 모델에서 철 킬레이터 NEC1 및 괴사증 억제제 DFO와 유사한 방식으로 유도된다. 그들의 유망한 활성을 확인하기 위해, 우리는 직교 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 분석에서 그 효과를 테스트했습니다. CK는 적당하지만 중요한 보호 활동을했습니다. 이것은 대조 물질의 상응하는 활동보다 약했지만, 조절의 차이에도 불구하고신경건강, 테스트 된 세 CK 모두 양성 대조군 물질과 마찬가지로 수퍼 옥사이드 라디칼 형성의 강력한 감소를 자극했습니다. CKs는 또한 SH-SY5Y 세포에서 글루-유도된 산화 스트레스에 대해 NEC1 및 DFO의 것과 유사한 효과를 나타냈지만, 이들 화합물은 CKs보다 카스파제-3/7 활성에 대해 더 강한 억제 효과를 가졌다. Glu-유도된 세포사가 HT-22 세포에 대한 DFO 및 NEC-1의 효과에 대한 연구에서 보여진 바와 같이, 카스파제-의존성 경로에 의존하지 않기 때문에[70], CKs는 산화 스트레스를 감소시킴으로써 카스파제-의존성 및 -비의존적 세포사를 명백히 조절할 수 있다[18,82]. 진행중인 연구에서, CKs의 상세한 작용 메커니즘 및 / 또는 미토콘드리아 효과에 대한신경또는 성상세포 세포가 조사될 것이다.

시스탄체경험를 위해증권 시세 표시기그리고기억

4. 재료 및 방법

4.1. 화학물질 및 시약

사이토키닌표준은 OlChemIm (Olomouc, 체코 공화국)으로부터 얻어졌다. Calcein AM (1 mg / mL 용액) 및 LDH 방출 키트 및 Neurite 유출 키트는 ThermoFisher에서 구입했습니다. 프로피듐 요오드화물, 디히드로에티듐, 카스파제-3/7 분석 완충액의 성분, DMEM/F12 1:1 배지, 소 태아 혈청, 트립신, ATRA, 솔슬리놀 하이드로브로마이드, 글루타메이트 모노나트륨 염, 데페록사민, N-아세틸시스테인, Ac-DEVD-CHO, 및 세포 배양을 위한 DMSO를 시그마 알드리치(Merck)로부터 구입하였다. Ac-DEVD-AMC 기질은 엔조 생명과학에 의해 공급되었다.

4.2. ORAC 라디칼 제거 활성 분석

시험관 내에서 자유 라디칼을 제거하는 화합물의 능력은 산소 라디칼 흡광도 능력 (ORAC) 검정에 의해 결정되었다. 간략하게, 플루오레세인 (100 uL, 500 mM) 및 25 uL의 시험된 화합물 용액을 37oC에서 예비 인큐베이션된 96-웰 마이크로플레이트에 첨가하였다. 다음에, 25 uL의 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3.SH-SY5Y 세포 배양

ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입한 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y를 둘베코의 변형된 Ea-gle's 배지 및 Ham's F12 영양소 혼합물(DMEM: F-12, 1:1)에서 성장시키고, 가습된 5% CO2 분위기에서 37oC에서 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포는 최대 20회까지 계대배양되었고, 배지는 일주일에 두 번 또는 세 번 변화되었다. 세포 밀도는 각 실험에 대해 100 uL 배지의 총 부피의 96-멀티웰 플레이트에서 계획된 검정 (웰 당 5000, 7000, 10,000, 또는 20,000 세포)에 대해 적절하게 설정되었다. 시딩 다음날, 1% FBS DMEM/F12 배지의 ATRA를 최종 농도 10uM로 세포에 첨가하고, 분화를 유도하고, 더 긴 신경돌기의 형성을 허용하고, 증식을 감소시키기 위해 추가로 48시간 동안 배양을 계속하였다.

4.4. 현미경 검사

현미경 사진신경세포유사 SH-SY5Y 세포는 DM IL LED 형광 현미경(라이카 마이크로시스템즈, 만하임, 독일)을 사용하여 검정을 위한 적절한 여기 필터, 또는 DP73 고성능 디지털 카메라(올림푸스, 도쿄, 일본)를 사용한 브라이트필드 셋업을 사용하여 수득하였다. 염색에 대한 신호 대 잡음비가 적당했기 때문에, 콘트라스트는 결과적인 관찰에 영향을 주지 않으면서 ImageJ 소프트웨어(피지)에서 약간 조정되었다. 원본 이미지는 보충 자료에 포함되어 있습니다.

4.5. 세포막 염색 (신경돌기 발육 키트, 인비트로젠™)

신경세포48시간 분화 절차에 의해 수득된 SH-SY5Y 세포(웰 당 5000개 세포)와 유사-유사 SH-SY5Y 세포를 제조사의 권고에 따라 약간의 변형으로 뉴라이트 발육 키트(Invitrogen™)로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 키트와 함께 제공된 막 염색 염료의 용액(96개의 멀티웰 플레이트에 대한 프로토콜에 따름)을 PBS에 37 oC에서 20분 동안 표지하고, PBS로 다시 세척하고, 형광 현미경 (각각 533 및 585 nm 여기 및 방출 파장을 갖는)으로 보았다.

4.6. 세포 치료

분화 절차 후, 분화 배지를 0.1, 1 및 10 uM (세포 독성 시험을 위해 웰 당 7000 세포 포함)의 농도로 테스트 화합물로 보충 된 1 % DMEM / F12 배지로 변경하거나 500 uM (웰 당 7000-10,000 세포 포함) 또는 160 mM Glu (웰 당 20,000 세포 포함)의 독소 SAL과 함께 분석 유형 (생존력, 세포 사멸 등). 대조군 세포는。를 포함하는 배지로 처리하였다. DMSO의 0.1 %.

4.7. 세포 생존력과 세포 사멸

의 생존 가능성신경세포96-웰 마이크로플레이트 (웰 당 약 7000개의 세포와 함께)에서 성장하는 SH-SY5Y 세포와 유사한-유사 SH-SY5Y 세포를 24시간 처리 후 경미한 변형을 갖는 칼세인 AM 검정에 의해 평가하였다[31]. 사용된 PBS 중의 칼세인 AM 용액은 0.75 uM 농도를 가졌고, 인큐베이션 시간은 50분으로 설정하였다. 각 웰에서 살아있는 세포의 수는 각각 495 및 517 nm 여기 및 방출 파장을 갖는 무한 M200 Pro 마이크로플레이트 리더 (오스트리아 테칸)를 사용하여 결정하였다.

의 세포사멸신경세포-유사 세포 (SAL 모델: 웰 당 10,000 세포; Glu-model: 웰 당 20,000개의 세포)를 작은 modifi-양이온으로 Stone et al. 2003에 의해 보고된 바와 같이 PI 분석법에 의해 결정하였다[83]. 간략하게, SAL로 유도된 모델의 배지는 흡인되어 PBS 중의 PI의 1 ug/mL 용액으로 변경되었지만, 글루 유도를 받은 세포는 부착도가 약하여 PBS 중의 PI 용액 1mg/mL를 첨가하여 최종 농도 1ug/mL를 얻었다. 두 경우 모두에서, 세포를 실온에서 추가로 15-25분 동안 인큐베이션한 다음, PI 형광을 각각 535 및 617개의 여기 및 방출 파장을 갖는 무한 M200 Pro 리더(오스트리아 테칸, 그뢰디그)에 의해 측정하였다. 독소 단독으로 얻어진 PI 형광을 100% 세포사멸로 설정하였다.

4.8. 디하이드로에티듐(DHE) 분석법에 의한 산화 스트레스 측정

세포를 분화시키고 SAL-유도에 대해 이전 섹션에서 기술된 바와 같이 처리하였다 (웰 당 10,000 세포, 24 h 또는 Glu-유도 (웰 당 20,000 세포, 4 h). 처리 후, 세포를 330 s 동안 500 x g에서 원심분리한 다음, 배양 배지를 PBS 중의 10 uM DHE 용액으로 교체하였다(흡인 후). 세포를 갖는 96-멀티웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한 다음, DHE 형광을 각각 500 및 580 nm 여기 및 방출 파장을 갖는 무한 M200 Pro 마이크로플레이트 리더(오스트리아 테칸, 그뢰디그)에 의해 측정하였다. SAL 또는 Glu 단독으로 수득된 생성된 DHE 형광은 100% 수퍼옥사이드 라디칼 형성으로 설정되었다. DHE 염색된 세포의 예시적인 형광 현미경 사진을 마이크로플레이트 판독기로 DHE 측정 후에 수득하였다.

Cistanche 식물은 아주 좋은 신경 보호 효과가 있습니다.

4.9. 카스파제-3/7 활성의 측정

원-스텝 카스파제-3/7 검정은 이전에 공개된 절차에 따라 수행되었다[84]. SAL-유도 및 Glu-유도를 실시한 배양을 위해, 반응 혼합물 (카스파제-3,7 완충액 및 96-멀티웰 플레이트 중의 세포와 성분)을 각각 37 oC에서 2 h 및 3 h 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 카스파제-3/7 활성을 각각 346 및 438 nm 여기 및 방출 파장을 갖는 인피니트 M200 Pro 마이크로플레이트 리더(오스트리아 테칸)에 의해 측정하였다.

4.10. 통계 분석

실험은 삼중으로 수행되었고 3 내지 5 (n = 3-5) 독립적 인 날에 반복되었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 모든 측정 변수에 대한 값은 SEM± 평균으로 표현되며, 이는 Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 계산되었으며, 이는 또한 수치를 생성하는 데 사용되었습니다. 통계적 분석은 PAST (ver. 1.97) 소프트웨어 패키지에 의해 수행되었다 [85]. 분화 실험을 위해, 학생 t-검정을 사용하였다. 나머지 실험은 순차적 Bonferroni 보정을 사용한 Mann-Whitney 포스트 혹 테스트를 사용한 비모수 Kruskal-Wallis 테스트에 의해 평가되었습니다. p 의 값< 0.05="" was="" considered="">

보충 자료: 원본 이미지는 온라인에서 확인할 수 있습니다.

저자 기여도 : 저자의 기여는 다음과 같습니다 : 조사, 방법론, 검증, 데이터 분석, G.G., C.W.D., 및 J.G.; 작문 - 원본 초안 준비 G.G., C.W.D., 및 M.S.; 데이터 큐레이션, 자금 조달, 감독, 작문 - 검토 및 편집, C.W.D., M.S. 및 P.K. 모든 저자는 원고의 출판 된 버전을 읽고 동의했습니다.

기금 :이 작업은 체코 공화국 Olomouc에있는 Palacky University의 내부 보조금 기관 (IGA_PrF_2020_021), 체코 보조금 기관 (20-15621S) 및 유럽 지역 개발 기금 - 프로젝트 ENOCH (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/0000868) 및 Palacky University의 기부 기금에서 학생 보조금.

기관 검토 위원회 성명서: 해당 사항 없음.

정보에 입각한 동의서: 해당되지 않습니다.

데이터 가용성 설명: 데이터는 문서 또는 보충 자료에 포함되어 있습니다.

감사: 저자는 뛰어난 기술 지원에 대해 Dita Jordovd, Jana Hrubešovd 및 Lucie Koplikovd에게 감사드립니다. 또한 저자는 원고의 영어 편집에 대해 영국 Sees-editing Ltd.에 감사드립니다.

이해 상충 : 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

샘플 가용성: 화합물의 샘플은 저자로부터 입수할 수 없습니다.