파트 Ⅱ 초고성능 액체 크로마토그래피-사중극자 비행시간 질량분석법과 A 1,1-디페닐{5}}피크릴히드라질 기반 분석을 사용한 재배 Cistanche Deserticola의 다른 부분의 화학적 프로필 및 항산화 활성 비교

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자세한 질량 스펙트럼 데이터와 제안된 단편화 패턴은 그림 7에 나와 있습니다. 위에서 식별된 6개의 PhG의 구조는 I-caffeic acid(CA), II-aglycone 및 III-sugar(Glc 및 Rha)의 세 부분으로 나뉩니다. . MS/MS 스펙트럼에서 caffeoyl 그룹과 Glc 및 Rha 잔기의 중성 절단에 해당하는 질량 결함은 PhG의 단편화 경로를 지배하고 진단 단편 이온을 생성합니다(그림 8). m/z 179, 161 및 135에서 추가 MS/MS 특성 단편 이온은 구조에 카페오일 치환기가 존재함을 추가로 시사했습니다. 이러한 단편화 기능을 사용하여 다음과 같이 단편화 경로를 자신 있게 제안할 수 있습니다.악티오사이드(그림 7c)는 CA 부분의 손실을 통해 m/z 461에서 단편을 생성한 다음 Rha의 추가 손실을 통해 m/z 315에서 이온을 생성했습니다. CA 부분은 m/z 179에서 발견되었으며, m/z 161 및 m/z 135에서 발견된 그것의 단편 이온은 각각 H2O와 CO2의 손실에 의해 생성되었습니다. Isoacteoside(그림 7d)는 m/z 461, 315, 179, 161 및 135에서 acteoside와 동일한 이온을 생성했습니다. 20 -Acetylacteoside(그림 7e)는 아세틸 및 그런 다음 m/z 461, 315, 179, 161 및 135에서 이온을 생성했는데, 이는 acteoside의 단편화 패턴과 동일했습니다. 한편, 20 -acetylacteoside는 CA 부분을 잃어 m/z 503에서 단편을 생성한 후 Ac 그룹을 잃어 m/z 461에서 이온을 생성했습니다. Tubuloside B(그림 6f)는 20 -아세틸락테오사이드. Echinacoside(그림 7a)는 CA 부분의 손실을 통해 m/z 623에서 단편 이온을 생성한 다음 Rha 및 Glc 부분의 순차적 손실로 m/z 477 및 315에서 단편 이온을 생성했습니다. m/z 461에서 단편 이온 전구체 이온에서 CA 및 Glc 부분을 잃음으로써 생성되었습니다. m/z 179, 161 및 135에서 특징적인 CA 이온도 발견되었습니다. Cistanoside A(그림 7b)는 CA 부분의 손실을 통해 m/z 637에서 단편 이온을 생성한 다음 각각 Rha 및 Glc 부분의 추가 손실에 의해 m/z 491 및 475에서 이온을 생성했습니다. 따라서 UPLC-PDA-QTOF/MS를 조합하여 사용하면 화합물의 화학 구조를 정확하게 설명하는 데 크게 기여할 수 있습니다.

2.7. 항산화제와 항산화제 특성 사이의 상관관계.

항산화제의 총 함량과 총 항산화 활성 사이의 상관관계 분석은 많은 연구에서 설명되었다[33-38]. 우리가 아는 한, 항산화 특성과 재배된 PhG 함량을 비교하는 연구는 부족합니다.C. 데저티콜라이러한 간결한 특성화 방법을 사용하는 부품. "정량적 분석" 부분에서 기술한 6가지 PhG 함량에 대한 예비 결과를 표 4에 요약하였고, "항산화능" 부분에서 기술된 바와 같이 DPPH 분석을 이용하여 결정된 항산화 활성(IC50)을 표 5에 나열하였다. 먼저, 각 부분의 총 항산화제 함량과 활성은 그림 9에 나와 있습니다. 분명히 다른 부분 사이에 눈에 띄는 차이가 있습니다. 실제로, 얻어진 결과는 재배된 항산화 활성이C. 데저티콜라줄기는 시장에서 구할 수 있는 줄기와 비슷했습니다. 이러한 결과는 줄기 추출물의 항산화 활성이 PhG 함량과 관련이 있을 수 있음을 시사했습니다. 따라서 재배된 줄기 추출물의 파이토케미컬은C. 데저티콜라DPPH 라디칼 소거 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 전반적으로, 우리의 결과는 총 PhG 함량과 항산화 활성 사이에 강한 상관 관계가 있음을 나타냅니다. r {0}}.92, ** p <>

또한, 총 항산화제 함량이 더 높은 특정 샘플은 축 및 꽃차례와 같은 높은 항산화 활성을 나타내지 않았습니다. 한편, 6개 부위 중 활성이 가장 높은 화관은 축과 꽃차례보다 총 항산화 함량이 낮았다. "정량적 분석" 섹션에 설명된 대로 그림 4는 개별 기여에 대한 예비 이해를 제공하기 위해 PhG 화합물의 상대적인 양을 보여줍니다. 이 연구에서 부분 최소 제곱(PLS) 회귀 분석[39-41]도 각 항산화제의 풍부함과 시험관 내 항산화 활성 사이의 상관 관계를 비교하기 위해 수행되었습니다. PLS 모델은 330 nm의 지문 크로마토그램에서 각 항산화제의 함량(설명자 매트릭스 X)과 모든 부분의 항산화 활성(반응 매트릭스 Y)을 사용하여 구성되었습니다. SIMCA-P 플러스 소프트웨어(버전 13.{18}}, Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 얻은 계수 플롯 및 투영 변수 중요도(VIP) 값은 그림 1{21}}에 나와 있습니다. 특히, IC5{24}} 값의 역수(1/IC5{27}})가 모델을 설정하기 위한 Y 변수로 선택되었습니다. IC5{30}} 값이 낮을수록 항산화 활성이 더 강하기 때문입니다. 도 10A에서 얻어진 회귀 계수 플롯에 따르면, 선형 회귀 모델은 액테오사이드를 제외한 모든 항산화제가 1/IC50과 양의 상관관계가 있음을 보여줍니다. 얻어진 PLS 보정 모델은 Y=0.50X1 더하기 0.57X2 - 0.11X3 더하기 0.32X4 더하기 0.58X5 더하기 0.24X6과 같은 회귀 방정식으로 표현됩니다. VIP 값은 모델에서 변수의 중요성을 반영합니다. VIP가 클수록 샘플 분류와 관련성이 높아집니다. 결과에서 알 수 있듯이 20 -아세틸락테오사이드는 항산화 활성에 중요한 기여자였습니다(그림 10B). 이 발견은 Yang et al[20]의 연구와 일치했습니다.

3 재료 및 행동 양식

3.1 공장 재료.교양 있는C. 데저티콜라Ningxia Province, Yongning County에 있는 Bencao Congrong 재배 기지에서 아낌없이 제공했으며 중국 베이징에 있는 중국 의학 아카데미 약용 식물 개발 연구소의 Jun Chen 교수가 인증했습니다. 재배의 여섯 가지 다른 부분C. 데저스티콜라 즙이 많은 줄기(R1), 꽃이 핌 축(R2), 꽃이 핌(R3), 꽃(씨가 없음)(R4), 꽃이 핌 줄기(R5) 및 화관(R6)이 포함됩니다. 자세한 샘플 정보는 그림 11에 나와 있습니다. 각 부품을 건조기에서 개별적으로 건조하고 분말로 부수고 40-망체를 통과한 다음 밀폐 용기에 적재하여 데시케이터에 보관했습니다. 이 샘플의 상품권 표본은 중국 베이징에 있는 중국 의학 아카데미 약용 식물 개발 연구소에 기탁되었습니다.

3.2. 화학물질 및 시약. Isoacteoside(Lot 130809), acteoside(Lot 130421) 및 echinacoside(Lot 121027)는 Chengdu Pure-Chem Standard Co. Ltd.(Beijing, China)에서 구입했으며, Cistanoside A, 20 -Acetylacteoside 및 tubuloside B를 분리했습니다. 그리고 재배된 것에서 정제된C. 데저티콜라저희 연구실에서는 98% 이상의 순도(HPLC)로 HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR을 통해 구조를 확인하고 기존 문헌과 비교하였습니다. 구조는 표 7에 나와 있습니다. DPPH, L-아스코르브산 및 Trolox는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 용매, 아세토니트릴 및 메탄올은 Merck(Darmstadt, Germany)의 HPLC 등급이었고 순도 96%의 포름산은 HPLC 등급(Tedia, Fairfield, OH, USA)이었습니다. Milli-Q 시스템(Millipore, Milford, MA, USA)을 통해 증류수로 탈이온수(18MΩ)를 준비했습니다. 기타 시약 및 화학물질은 분석 등급이었습니다.

3.3. 솔루션 준비

3.3.1. Standard Solutions.A 혼합 표준 스톡 솔루션에키나코사이드(501 µg/mL), 시스타노시드 A(64 µg/mL), 악테오시드(239 µg/mL), 이소악티오시드(22.6 µg/mL), 20 -아세틸락테오시드(278 µg/mL) 및 튜불로시드 B(46.2 µg) /mL)를 메탄올에서 제조하였다. 스톡 용액은 일련의 적절한 농도를 얻기 위해 메탄올로 희석하여 교정 곡선을 개발하기 위한 작업 용액으로 사용하고 사용하기 전에 4℃에서 보관했습니다.

3.3.2. 샘플 솔루션. 재배된 6가지 부분을 정확히 칭량한 분말(40mesh, 1g)C. 데저티콜라50 mL 메탄올을 각각 첨가하였다. 실온에서 30분간 침지한 후, 혼합물을 칭량하고 초음파 수조(40kHz, 250W, Kunshan, China)에서 실온에서 40분간 추출하였다. 냉각 후, 손실된 중량을 보충하기 위해 추가 메탄올을 첨가하였다. 모든 용액은 주입 전에 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과되었습니다. 상층액의 분취액(3 μL)을 분석을 위해 UPLC에 주입했습니다. 각 추출물을 3회 주입하였다.

3.3.3. DPPH 솔루션. DPPH 라디칼 스톡 용액(5 × 10-3 mol/L)은 실험 직전에 정확하게 칭량한 DPPH 시료를 메탄올에 녹여 빛을 차단하여 제조하였다. 그런 다음, 스톡 용액을 메탄올로 새로 희석하여 표준 용액(1 × 10-4 mol/L)을 얻었다.

3.4. UPLC-PDA 분석 조건. UPLC 분석은 컬럼 히터, 샘플 관리자, 바이너리 용매 관리자 및 포토다이오드 어레이 검출기를 포함하는 Waters Acquity UPLC 시스템(Waters, Milford, MA, USA)에서 수행되었습니다. Acquity UPLC BEH C18 컬럼(1.7 µm, 2.1 mm × 1{{1{12}}}}0 mm; Waters)에서 컬럼 히터를 30℃로 고정하여 크로마토그래피 분리를 수행했습니다. 이동상은 아세토니트릴(A)과 0.4mL/min의 유속에서 0.2% 포름산(B)을 포함하는 물로 구성되었습니다. 구배 용출 프로그램은 다음과 같이 사용되었습니다: 0-2분에서 5% A, 2-4분에서 5-15% A, 4-6분에서 15% A, 6-10분에서 15-20% A, 20 10~15분에 -35% A, 15~18분에 35% A, 18~18.1분에 35~5% A. 그런 다음 조성물을 재평형화를 위해 추가로 10분 동안 5% A에서 유지했습니다. 검출 파장은 330 nm로 설정하였다.

3.5. UPLC-ESI-Q/TOF-MS 분석. 조건 UPLC 조건은 섹션 3.4에서 설명한 것과 동일합니다. MS 분석은 음이온 모드에서 전자분무 인터페이스(ESI)가 장착된 Waters Xevo G2-XS QTOF 질량 분석기(Waters MS Technologies, Manchester, UK)에서 m/m에 걸친 전체 스캔 MS 스펙트럼으로 수행되었습니다. z 범위는 50–1200입니다. 소스에서 모세관 전압은 2000V, 소스 온도는 120℃, 탈용매 온도는 450℃, 콘 전압은 40V, 콘 가스는 30L/h, 탈용매 가스 유량은 600 패/시. MS/MS 실험은 MSE를 사용하여 수행되었으며 충돌 에너지는 20–40V였습니다. 모든 MS 데이터는 질량 정확도와 재현성을 보장하기 위해 Lock Spray 시스템을 사용하여 수집되었습니다. m/z 554.2615에서 류신-엔케팔린의 [M - H]- 이온은 음의 ESI 모드에서 잠금 질량으로 사용되었습니다. Waters Mass Lynx 4.1 소프트웨어(Waters MS Technologies, Manchester, UK)를 사용하여 데이터를 수집, 분석 및 처리했습니다.

3.6. 오프라인 DPPH 라디칼 소거 분석. 식물 추출물의 총 항산화 활성은 오프라인 DPPH 라디칼 소거 분석을 사용하여 평가되었습니다. 다양한 농도의 샘플 용액(2mL)을 1 x 10-4mol/L DPPH 용액(메탄올 중) 2mL와 혼합했습니다. 모든 샘플을 흔들어 실온의 암실에서 60분 동안 방치했습니다. DPPH 자유 라디칼의 감소는 ELISA 판독기(TECAN, Growing, Austria)에서 블랭크(샘플이 없는 메탄올)에 대한 517 nm에서의 흡광도를 판독하여 측정했습니다. 메탄올(2mL)만 이 실험의 대조군으로 사용했습니다. Trolox 및 L-ascorbic acid는 양성 대조군으로 사용되었습니다. DPPH 소거 백분율로 표시되는 시험된 샘플의 라디칼 소거 활성(% 억제)은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다. 퍼센트 억제=[(A 대조군 - A 샘플)/A 대조군] × 100 총 항산화 활성은 샘플 농도에 대한 억제 백분율을 표시하여 계산되었으며 DPPH 라디칼(IC50)의 50%를 제거하는 데 필요한 샘플 농도로 표시되었습니다. 모든 테스트는 세 번 수행되었으며 IC50 값은 평균 ± SD로 보고되었습니다.

3.7. 사전 컬럼 DPPH 분석과 결합된 UPLC-PDA. 본 연구에서는 2mL의 DPPH 용액(3 × 10-3 mol/L)과 1mL의 샘플 용액(12mg/mL)으로 재배된 C. Deserticola의 다른 부분을 혼합한 후 UPLC-PDA를 사용하여 추가로 DPPH 자유 라디칼 소거 반응 전후에 시료 용액의 특성 피크 변화를 감지하여 항산화 프로파일을 스크리닝하고 항산화 성분을 식별합니다. 각각의 다른 식물 부분에 대해 DPPH 분석 전후에 샘플 용액의 10 μL 분취량을 섹션 3.4에 설명된 것과 동일한 조건에서 UPLC 시스템에 별도로 주입했습니다. 샘플 용액을 DPPH 용액과 혼합한 후, 샘플 용액의 특성 피크의 변화가 330 nm에서 검출되었다.

3.8. 데이터 분석. 분석 데이터는 3회 반복 측정의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. IBM SPPS Statistics(Version 19; International Business Machines Corp., New York, NY, USA)를 사용하여 Pearson 상관 계수(r)를 결정하여 총 PhG 함량과 항산화 활성 간의 관계를 연구하기 위해 이변량 상관 분석을 수행했습니다. IC5{11}} 값도 SPPS Statistics 19를 사용한 프로빗 분석으로 계산되었습니다. DPPH 자유 라디칼 소거율과 총 PhG 함량은 OriginPro 8.5.1(Origin Lab Corp., Northampton, MA, USA)을 사용하여 표시되었습니다. 부분 최소 자승(PLS) 회귀는 SIMCA-P 플러스 소프트웨어(버전 13.0, Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 결정되었습니다.

4. 결론

널리 사용되는 한약재인 C. Deserticola 재배의 여러 부분을 그 품질에 대해 조사했습니다. 첫째, 재배된 6가지 부위의 특징적인 지문시스탄체데저스티콜라SES와 6가지 마커 화합물의 함량 동시 분석을 사용하여 샘플을 생성하고 평가했습니다. 둘째, UPLC를 사용하여 6가지 주요 화합물을 정량화하여 다른 부분에서 이러한 화합물의 분포 특성을 보여주었습니다. 그러나 그 결과가 한약의 활성과 직접적인 관련이 있을 수는 없었다. 따라서 재배된 C. Deserticola 샘플의 품질과 활성을 동시에 결정할 수 있는 더 나은 방법이 필요했습니다. 첫째, 우리는 오프라인 DPPH 라디칼 소거 분석을 사용하여 재배 된 항산화 활성을 평가했습니다.시스탄체데저스티콜라추출물과 줄기 추출물에서 가장 높은 활성을 발견했습니다. 또한, pre-column DPPH 분석과 결합된 UPLC-PDA를 적용하여 배양된 항산화제를 스크리닝하고 평가했습니다.시스탄체데저스티콜라줄기 추출물. 이 방법은 더 많은 화학적 정보를 제공할 뿐만 아니라 한약을 식별하고 평가하는 데 사용할 수 있는 일부 항산화 정보를 제공했습니다. 둘째, UPLC-PAD-QTOF/MS를 이용하여 줄기 추출물의 활성 성분을 분리 및 동정하여 치환기의 수와 위치를 확인하고 구조 분석의 정확도를 높였습니다. 마지막으로, 화학 성분과 시험관 내 항산화 활성 사이의 관계가 PLS 모델을 사용하여 확립되고 검증되었습니다.

결론적으로, 우리는 처음으로 재배된 C. Deserticola 샘플의 다른 부분의 화학적 조성 프로파일과 항산화 활성을 비교했습니다. 이러한 발견은 PhG 화합물의 분포, PhG 함량 및 재배된 C. Deserticola 샘플의 다른 부분의 항산화제에 대한 기여가 현재 연구까지 보고되지 않았기 때문에 특별한 관심을 받았습니다. 또한 PLS 분석은 항산화 활성에 대한 6가지 PhG의 개별 기여에 대한 예비 이해를 제공하기 위해 처음 설정되었습니다. 이 접근 방식은 재배된 C. Deserticola의 포괄적인 품질 평가에 대한 몇 가지 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 이 작업은 DPPH 라디칼 소거 활성과 재배된 C. Deserticola(r=0.92)의 다른 부분의 총 PhG 함량 사이의 강력한 상관 관계에 대한 첫 번째 보고서를 나타냅니다. 이러한 다양한 부분 중에서 줄기에는 PhGs가 풍부하고 강력한 항산화 활성이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 특히, 재배된 C. Deserticola의 폐기된 부분에는 일부 생리 활성 화합물이 포함되어 있어 대체 식이 보충제로 사용될 수 있습니다. 결과가 향후 재배 C. Deserticola의 활용에 유용한 정보가 되기를 바랍니다. 우리가 아는 한, 이것은 재배된 다양한 부분에서 천연 항산화제의 신속한 식별 및 정량화에 대한 최초의 보고서입니다.시스탄체데저스티콜라UPLC-PAD-QTOF/MS, 오프라인 DPPH 방법 및 UPLC-PAD-pre-columnDPPH 방법을 사용합니다. 우리의 결과에 따르면, 여기에서 개발된 방법은 복합 한약의 포괄적인 품질 관리를 위한 강력하고 의미 있는 도구를 제공할 수 있습니다. 우리나라에서는 "일대일로(一帶一路)" 이니셔티브의 지침에 따라 건강상의 이점이 있는 이 전통 작물을 사용하여 전 세계에 적용할 수 있는 신제품을 설계할 수 있습니다.

감사의 말

저자는 중국 의학 아카데미(CAMS) 의학 혁신 기금(CIFMS)(No. 2016-I2M-1-012)과 중국 국립자연과학재단(NationalNatural Science Foundation of China, No. 31570344).

저자 기여

Yue Shi와 Xiaomim Wang이 연구 설계에 참여했습니다. Xiaoming Wang, Jinfang Wang, Huanyu Guan, Rong Xu, Xiaomei Luo, Meifeng Su, Xiaoyan Chang, Wenting Tan 및 Jun Chen이 실험 수행을 담당했습니다. Yue Shi, Xiaoming Wang 및 Jinfang Wang이 데이터 분석을 수행했습니다. Yue Shi와 Xiaomim Wang은 원고 작성 및 편집에 기여했습니다. 이해 상충: 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

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