Part Ⅱ 소변에서 NGAL 검출 및 급성신장손상 진단을 위한 유로퓸 나노입자 측방유동면역측정법 개발

결과

1. 재조합 NGAL 단백질의 발현 및 정제

pSecTag2A-NGAL 재조합 플라스미드를 CHO 세포에 형질감염시켰다. NGAL-6×His 단백질은 주로 세포 상청액에서 발현되고 이후 Ni Sepharose에 의해 정제됩니다. 정제된 재조합 NGAL 단백질을 약 95% 순도로 얻었고 대략적인 분자량이 23.7kDa인 SDS-PAGE로 분석했습니다(그림 1A). 웨스턴 블롯은 또한 재조합 단백질 NGAL 발현 및 정제를 확인하였다(도 1B).

2. MAb 생성

먼저 서로 다른 전기장 세기에 따른 세포막 천공에 대한 DC 전압의 영향을 비교하였으며, 전기 융합 방식을 최적화하기 위해 펄스 진폭을 각각 400 V, 450 V, 500 및 550 V로 하였다. 이전 보고서에 따르면 세포 농도는 융합 효율에 상당한 영향을 미칩니다[16]. 분리된 비장 ​​세포와 SP2/0 골수종 세포의 혼합 현탁액을 약 2 x 106, 2 x 107 및 2 x 108 세포/mL의 서로 다른 농도로 융합 챔버로 옮겼습니다. 융합 효율은 450 V DC에서 가장 높았고 최적의 세포 농도는 2 × 107 세포/mL였습니다(그림 2).

3. MAb의 특성화

MAb는 단백질 A 컬럼에 의해 정제되었습니다. 정제된 MAb는 12% SDS-PAGE로 분리되었고, 환원 조건 하에서 분자량이 55 kDa 및 25 kDa인 두 개의 밴드가 관찰되었습니다. 170 kDa의 명확한 밴드는 2F4 및 1G1의 온전한 단백질인 비환원 조건에서 확인되었습니다(그림 3A). 웨스턴 블롯은 모든 MAb가 인간 NGAL 단백질에 특이적으로 결합함을 나타냈습니다(그림 3B). 세포 전기융합 및 서브클로닝 후, NGAL에 대한 항체 특이적 결합을 보장하기 위해 NGAL-6xHis 및 PCT- 6xHis를 사용한 간접 ELISA에 의해 하이브리도마의 상등액을 검출하였다. PCT-6xHis에 대한 교차 반응 없이 특정 NGAL 결합을 갖는 2개의 매우 양성인 하이브리도마(1G1, 2F4)가 MAbs의 생산 및 정제를 위해 성공적으로 선택되었습니다(그림 3C). 두 MAb의 친화도를 검출하기 위해 농도가 다른 항체와 NGAL 단백질 간의 상호작용을 BIAcore T200 시스템으로 분석했습니다. kinetic diagram은 2F4와 1G1의 친화도가 각각 4.5×10-7과 6.0×10-7임을 보여주었다(도 3D). 상업용 키트에 의해 검출된 두 MAb의 이소형은 IgG1이었습니다. 2F4 및 1G1-HRP 페어링의 차단율은 cELISA 검출에 의해 63%였으며, 이는 서로 다른 에피토프를 인식했음을 나타냅니다.

4. EU-NPS-LFIA 절차

표지로서의 EU-NPS와 샌드위치형 면역측정법을 기반으로 NGAL의 검출을 위해 LFIA가 확립되었습니다. MAb 2F4는 니트로셀룰로스 멤브레인에 코팅되었고 측면 유동 면역크로마토그래피 플랫폼에서 항체 페어링을 기반으로 EU-NPS-1G1과 페어링되었습니다. 도식적으로 나타낸 바와 같이(도 4), 니트로셀룰로스 막의 TL 및 CL은 MAb 2F4 및 염소 항-마우스 IgG로 코팅되었다. EU-NPS-1G1은 컨쥬게이트 패드에 라벨링되었습니다. NGAL 항원을 포함하는 샘플은 접합체 패드 쪽으로 이동하여 EU-NPS-1G1과 결합하여 항원-항체 복합체를 형성합니다. 이어서, 복합체는 샌드위치 복합체를 형성하기 위해 이동하는 동안 T-라인에서 mAb 2F4에 의해 포획되었다. 과량의 복합체를 염소 항-마우스 IgG와 결합시켰다. 테스트 스트립은 15분 후에 형광 검출기로 측정되었습니다.

5. 성과평가

검출기 및 포획 항체로서 항체 쌍(2F4- labled1G1)을 사용하여 형광 면역크로마토그래피를 확립하고 표준 곡선을 작성하여 EU-NPS-LFIA의 분석 성능을 평가하였다. 상대형광강도비(HT/HC)는 NGAL 농도에 따라 증가하였다. EU-NPS-1G1은 mAb 2F4에 대한 반응을 보였다(도 5A). 고용량 후크 영향은 항원 농도가 3000 ng/mL에 도달했을 때 감지되지 않았습니다. 회귀 방정식은 다음과 같이 표시됩니다: y=0.0012 x + 0.0059 (R2=0.99), 여기서 y는 HT/HC의 비율을 나타내고 x는 NGAL의 농도를 나타냅니다(그림 1). 5B). 검출 한계(LOD)는 NGAL 농도인 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 지침 EP17-A2에 의해 계산된 0.36 ng/mL(blank 표준 편차의 3배, n=20)였습니다. 1-1500 ng/mL[17] 범위에서 선형 관계를 가졌습니다.

6. 정밀도

면역학적 방법의 정확성과 재현성을 평가하기 위해 intra-assay와 interassay의 회복 실험을 수행하였다. 다양한 농도(50, 200 및 800ng/mL)의 NGAL 표준 물질이 음성 소변 샘플에 추가되었습니다. Intra-assay 정밀도는 1일 동안 각 스파이크 농도에서 3회 반복하여 계산하였고 Inter-assay 정밀도는 15일 동안 연속적으로 3일마다 각 스파이크 농도에서 3회 반복하여 계산했습니다[18]. 결과는 표 1에 나와 있으며, 계산된 분석 내 변동 계수(CV)는 2.57~4.98%(n=10)로 ​​10%보다 낮습니다. 검정간 CV는 4.11~7.83%(n=15) 범위였으며 역시 10% 미만이었습니다.

Intra-assay 및 inter-assay 정밀도는 두 개의 평가 장치(Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd 및 Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd)로 검증되었으며 결과는 결국 일관성이 있습니다. 이러한 결과는 개발된 LFIA의 정밀도가 높은 수준이고 재현성이 허용 가능한 수준임을 설명했다.

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7. 특이성

테스트 스트립의 특이성은 크레아티닌, 포도당 및 요소 질소를 포함하여 정상 및 다양한 농도의 소변 샘플에 내인성 물질을 추가하여 평가되었습니다. 표 2에 나타난 바와 같이, 결과는 모든 상대편차(RD)가 ±10% 범위에 있음을 나타냈으며, 이는 항원-항체 상호작용이 안정적이며 테스트 스트립의 특이성이 NGAL에 대해 허용 가능함을 나타냅니다.

8. 임상 샘플 테스트

임상 샘플 결정을 위한 EU-NPS-LFIA 기반 NGAL의 적용 능력을 평가하기 위해, 26개의 낮은 가치 샘플(11–70 ng/mL), 19개의 중앙값을 포함하는 총 83개의 소변 샘플 가치 샘플(110–800 ng/mL), 38개의 고가 샘플(800–1740 ng/mL)이 ARCHITECT 소변 NGAL 분석에서 측정되었습니다. 회귀곡선의 상관계수(R2) 결과는 0.9829(p<0.01)로 두 검출방법이 유의미한 선형관계(x는 ARCHITECT 분석기로 얻은 NGAL의 농도, y는 개발된 테스트 스트립) (그림 6). 따라서 NGAL 결정을 위해 개발된 EU-NPS-LFIA는 임상 시험에서 매우 정확했습니다.

논의

인간 소변에서 NGAL 검출 및 AKI 진단을 위한 EU-NPS-LFIA가 본 연구에서 개발되었습니다. AKI의 현재 진단은 혈청 크레아티닌(sCr) 농도로 확인되며, 신장 기능의 최소 50%가 손상되지 않는 한 일정합니다[19]. AKI는 COVID-19 중증 환자의 89%에서 발생했으며, 대부분의 환자는 혈장 크레아티닌[20]보다 일찍 나타날 때 주로 핍뇨를 보였습니다. 바이오마커는 입원 시 높은 수치를 증가시켰고 이는 사망률 증가와 관련이 있습니다. NGAL은 이러한 바이오마커 중 하나이며, 그 수치는 COVID-19 입원 환자[21]의 사망 위험과 양의 상관관계가 있을 수 있습니다. AKI에서 여러 연구에서 소변의 NGAL 농도가 sCr 농도와 유의미하게 관련되어 있음을 발견했습니다[22]. 최근 몇 년 동안 NGAL 검출을 위한 다양한 전기화학적 및 면역학적 방법, 전기화학적 결정, 고상 근접 결찰 분석 및 무효소 전기화학적 면역분석법이 개발되었습니다[23, 24]. 그러나 이러한 기술에는 정확한 장비, 전문 인력 및 결과에 대한 전문적인 해석이 필요합니다. 따라서 소변 내 NGAL 농도에 대한 효과적이고 편리한 검출 분석법을 개발하는 것이 이 장애의 모니터링에 중요합니다. 기존의 방법에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 융합 효율이 낮아 기능성 항체를 얻는 데 어려움이 있었고, 융합 효율을 높일 수 있는 전기 융합 매개변수를 최적화하여 생존 가능한 하이브리도마를 제조하고 2개의 항-NGAL MAbs를 얻었습니다. MAb는 친화력이 높을 뿐만 아니라 고품질 진단 분석을 확립하는 데 사용되는 다른 에피토프를 향합니다.

허바 시스탄체

최근 몇 년 동안 광전기화학적 면역센서와 3개의 전기화학적 면역센서, 고체상 근접 결찰 분석법, 측면 유동 분석법을 포함하여 여러 NGAL 신속 진단 면역분석법을 개발하기 위한 많은 연구가 보고되었다[25]. 한 연구에서 면역 센서는 스크린 인쇄 변형 탄소 전극에 고정된 NGAL 포획 항체에 의해 만들어졌으며 SPCE에 샌드위치를 ​​형성하는 PB-NP로 장식된 g-C3N4 나노시트에 NGA에 대한 2차 항체를 라벨링하여 추가했습니다[24]. 다른 연구에서는 전기분무 그래핀/폴리아닐린(G/PANI) 위에 증착된 전기중합 아닐린으로 수정된 스크린 인쇄 전극(SPCE)에 고정된 NGAL에 대한 항체를 개발했습니다[25]. 2건의 보고서에서는 LOD가 그래핀 나노시트보다 나노하이브리드의 전기촉매 효율이 향상된 N 원소를 갖는 g-C3N4 나노시트와 NGAL의 LOD에 따라 0.6 pg/mL에서 21.1 ng/mL까지 폭넓게 변화함을 보여주었다. 검사법은 면역센서, 접합복합체, 항체에 따라 다양하다[26]. 이러한 연구에 따르면 서문 섹션에서 언급한 다양한 형광 나노 입자를 기반으로 LFIA의 감도를 향상시킬 수 있음을 깨달았습니다. 형광 프로브로 LFIA에 라벨링된 고감도 나노입자는 지난 수십 년 동안 지속적으로 연구되어 왔으며 금 나노입자가 가장 널리 사용되지만 기존 라벨을 기반으로 하는 측면 흐름 테스트의 적용은 식별이 불량하고 신호가 약하다는 점에서 제한적입니다. 27]. 현재 NGAL 검출을 위한 다양한 플랫폼에 NGAL 개발에 사용할 수 있는 항체가 있지만 UCP 기술 기반 측면 유동 분석 외에 NGAL 검출 실험을 한 EU-NPS 라벨 기반 LFIA에서는 사용할 수 없다[28 , 29].

형광 면역분석법은 다양한 검출 분야, 특히 성숙한 양자점에서 장점이 있으며, 감도는 MAb 및 형광 물질에 의해 영향을 받고 EU-NPS 및 특정 MAb에 의해 형광 프로브를 사용하여 크게 향상될 수 있습니다[30 ]. EU-NPS는 검출 분야에서 성숙된 형광 LFIA 스트립에 적용되었으며 분석 감도, 특이성 및 안정성에 대해 LFIA의 여러 이점을 향상시켰습니다[31]. EU-NPS의 뛰어난 특성으로 인해 이 방법에서 NGAL의 검출 한계는 0.36 ng/mL인 반면 평균 소변 NGAL 수치는 건강한 개인의 경우 약 7.0 ng/mL였습니다[32] . NGAL의 EU-NPS-LFIA 개발 및 적용은 아직 초기 단계에 있으며, 이 분석은 COVID-19 환자를 대상으로 혈청 및 소변 샘플의 NGAL을 테스트해야 합니다. .

결론

이 연구에서 우리는 두 개의 마우스 항-NGAL MAb(2F4, 1G1)를 성공적으로 얻었고 EU-NPS로 표지하여 측면 흐름 면역 기술을 확립했습니다. EU-NPSLFIA는 15분 이내에 1- 3000 ng/mL의 넓은 범위에서 NGAL을 감지하는 것으로 밝혀졌으며 감지 감도는 0.36 ng/mL에 도달했습니다. 이러한 항-NGAL MAb는 소변 샘플에서 NGAL 검출의 형광 LFIA에 안정적으로 활용될 수 있으므로 AKI 진단에 적용할 수 있어야 합니다.

Cistanche tubulosa

급성 신장 손상에 대한 Cistanche 추출물의 효과

급성 신부전으로도 알려진 급성 신장 손상(AKI)은 신장 기능의 갑작스러운 감소와 관련된 일반적인 의학적 상태입니다. AKI는 특히 치료하지 않고 방치할 경우 심각한 이환율과 사망률을 유발할 수 있습니다. 따라서 환자의 예후를 개선하기 위해서는 조기 진단과 신속한 치료가 필수적입니다.

Cistanche deserticola 식물에서 추출한 Cistanche 추출물은 중국 전통 의학에서 다양한 건강 상태를 치료하는 데 사용되었습니다. 최근 연구에 따르면 Cistanche 추출물이 AKI 치료에 도움이 될 수 있음이 밝혀졌습니다.

연구에 따르면 Cistanche 추출물이 AKI에 대한 치료 효과를 발휘하는 잠재적인 메커니즘이 확인되었습니다. 여기에는 염증 억제, 산화 스트레스 감소, 세포 사멸 경로의 하향 조절 및 조직 재생 촉진이 포함됩니다. 또한 Cistanche 추출물은 AKI의 결과로 발생할 수 있는 신장 섬유증의 진행을 예방하는 것으로 나타났습니다.

동물 연구에 따르면 Cistanche 추출물의 투여는 AKI 모델의 신장 기능에 보호 효과가 있어 사구체 여과율이 개선되고 세뇨관 세포 손상이 감소하며 혈액 요소 질소 및 혈청 크레아티닌 수치가 감소합니다. 인간 피험자에 대한 임상 실습에 대한 추가 연구는 심장 수술 관련 AKI 환자의 요소 질소 및 크레아틴의 혈청 수준이 추가로 증가하는 것을 방지하면서 소변 배출량 및 사구체 여과율(GFR)이 증가함을 나타냅니다.

그러나 이상적인 복용량, 장기 안전성 프로파일 및 준비 표준화와 관련하여 몇 가지 질문이 남아 있습니다. Cistanche 추출의 최적 용량 및 투여 요법을 평가하기 위해서는 추가적인 고품질 무작위 대조 시험이 필요합니다.

전반적으로 증거는 Cistanche 추출물이 AKI에 효과적인 치료법일 수 있음을 시사하지만 더 확실한 권장 사항을 위해서는 더 광범위한 연구와 테스트가 필요합니다. 결론적으로, 몇 가지 한계에도 불구하고 Cistanche 추출물은 AKI의 중증도를 감소시키는 잠재력을 보여줍니다. 조기 발견과 신속한 치료는 환자의 결과와 삶의 질을 향상시킬 수 있습니다. 환자는 안전을 보장하고 부작용을 피하기 위해 대체 요법에 참여하기 전에 의료 제공자와 상담해야 합니다.

Cistanche의 효과

참조

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모리인 1 , 원왕 섭 2 , 호류 2 , 레이류 1 , 루당 1 , 원동 2 , 천민호 1 , 왕혜연 1

1 항체 공학을 위한 길림 협력 혁신 센터, 길림 의과 대학, 132013 Jilin, PR China.

2 연구소 연구소, 길림 의과 대학, 132013 Jilin, PR China.