에키나코사이드가 파킨슨병을 예방하는 방법
Mar 06, 2022
1부: Echinacoside에 의한 MTOR 신호 전달 경로를 통한 MPTP 유도 PD 마우스의 자가포식 조절 메커니즘
추상적인:
목적: 본 연구는에키나코사이드(ECH) mTOR 신호 전달 경로를 통한 자가포식 관련 지표, 특히 자가포식 기질 P62 및파킨슨 병(PD), PD 치료를 위한 새로운 전략 제공(파킨슨 병). 방법: 아급성 PD의 마우스 모델(파킨슨 병)1-메틸{1}}페닐-1, 2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 복강내 주사에 의해 확립되었습니다. 먼저, 각 군의 마우스에서 신경행동 증상을 평가하고, 고성능 액상으로 각 군의 선조체 내 모노아민 신경전달물질을 측정하였다. tyrosine hydroxylase(TH), - synuclein 및 LC3의 발현을 관찰하기 위해 Immunofluorescence 이중 염색법을 채택했습니다. 투과전자현미경을 이용하여 흑질내 미세구조의 변화와 자가포식소체의 형성을 관찰하였다. 그런 다음 Western blot으로 TH, -synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR 및 upstream protein AKT의 발현을 검출하였다. 결과: 모델군과 비교했을 때 신경행동 기능이 유의하게 향상되었다.ECH(에키나코사이드)그룹(P < {{0}}}.01)과="" 함께="" 뇌에서="" th,="" da="" 및="" dopac의="" 발현="" 증가(p="">< 0.01).="">ECH(에키나코사이드)Beclin 1과 LC{1}}II의 발현은 증가했지만(P < 0.01), P62와 -synuclein의 발현 수준은 유의하게 감소했습니다(P < 0.01).ECH(에키나코사이드)생존 신호 p-AKT/AKT의 발현 수준을 상향 조절하고 mTOR의 발현을 감소시킬 수 있다. 결론:ECH(에키나코사이드)mTOR의 발현을 억제하여 autophagy를 증가시켜 -synuclein의 제거와 autophagy 기질 P62의 분해를 촉진하고 신경 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.
키워드: 파킨슨병, MPTP,에키나코사이드, -시누클레인, P62, 자가포식, mTOR
소개
파킨슨병(PD)만성 진행성 신경퇴행성 질환이다. PD의 전형적인 병리학적 특징(파킨슨 병)루이소체의 형성이며, -시누클레인과 유비퀴틴이 루이소체의 주성분이다. 점점 더 많은 증거가 autophagy 조절 장애가 결국 잘못 접힌 단백질과 손상된 세포 소기관의 축적으로 이어진다는 것을 보여줍니다.54 autophagy-lysosome 경로는 ubiquitin-proteasome 경로에 의해 분해될 수 없는 단백질뿐만 아니라 경로 -시누클레인을 분해할 수 있습니다. 따라서 autophagy의 조절은 PD 치료를 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. (파킨슨 병). 자가포식은 세포내 응집체의 분해를 위한 주요 경로이며, mTOR 키나제는 자가포식의 주요 조절 부위입니다. 따라서 PD와의 관계를 규명하는 것은 이론적이고 실천적인 의의가 있다.(파킨슨 병) 및 mTOR 신호 전달 경로에 의해 조절되는 자가포식. α-시누클레인의 분해는 주로 비정상 단백질의 제거를 표적으로 하는 자가포식-리소좀 시스템에 의존하기 때문에 자가포식을 조절할 수 있는 신경보호 약물의 개발은 신경퇴행성 질환의 치료에 방향을 제시할 수 있다. ECH(에키나코사이드)의 분자식은 C35 H46 O20이다. 한약재인 Cistanche 페닐에타노이드 배당체의 주성분입니다. Stoll et al에 의해 처음으로 뿌리에서 분리되었습니다.에키네시아앵거스티폴리아 DC.ECH(에키나코사이드)광범위한 약리학적 효과가 있습니다. 항염, 항산화, 신경 보호, 학습 및 기억력 향상, 간 보호, 면역 조절, 항종양 효과가 있습니다. 본 연구는 PD의 핵심 병리학적 기전에서 출발하여(파킨슨 병), 신경 보호 효과의 조절을 조사하는 것을 목표로ECH(에키나코사이드)마우스 PD에서(파킨슨 병)autophagy-lysosomal 경로에서 MPTP에 의해 유도 된 모델.
재료 및 기구
실험동물
실험 그룹은 8주령의 SPF 등급의 수컷 C57BL/6J 마우스 108마리로 구성되었으며, 체중은 20-22g, 케이지당 4마리의 마우스로 22-25도를 유지했습니다. 쥐는 난징 중의과 대학에 있는 중국 과학원 상하이 실험 동물 센터에서 제공했으며 동물은 22~22도의 SPF 등급 방에서 국립 보건원 지침에 따라 인도적 보살핌을 받았습니다. 25도, 상대 습도 55%, 12-시간 주기 리듬 미만. 생쥐는 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었습니다.
주요 시약
MPTP(Sigma Company), 마우스 항-TH 단일클론항체(Sigma Company), Alexa Fluor 555 항토끼 항체(Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 항토끼 항체(Biyuntian Institute of Biotechnology), HRP -염소 항토끼 2차 항체(Biyuntian Institute of Biotechnology), 토끼 다클론-시누클레인 항체(Cell Signaling Technology Company), HRP-염소 항마우스 2차 항체(Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(에키나코사이드) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), 토끼 항p-AKT(Ser473) 항체(Cell Signaling Technology Company), Rapamycin(Cell Signaling Technology Company), 클로로퀸(Sigma Company), Wortmannin(Sigma Company), 토끼 다클론 LC3 항체(Abcam Company), 토끼 다클론 P62 항체(Enzo Life Science Company), 마우스 단클론-액틴 항체(Santa Cruz Company), Beclin 1 다클론 항체(Abcam Company).
재료 정보:
MPTP(America, Sigma Company), 마우스 항-TH 단일클론항체(America, Sigma Company), 토끼 다클론-시누클레인 항체(America, Cell Signaling Technology Company), HRP-염소 항-마우스 2차 항체(중국, Biyuntian Institute of Biotechnology) ),ECH(에키나코사이드) (중국, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), 토끼 항p-AKT(Ser473) 항체(미국, Cell Signaling Technology Company), Rapamycin(미국, Cell Signaling Technology Company), 클로로퀸(미국, Sigma Company), Wortmannin(America, Sigma Company), 토끼 다클론 LC3 항체(America, Abcam Company), 토끼 다클론 P62 항체(America, Enzo Life Science Company), 마우스 단클론-액틴 항체(America, Santa Cruz Company), Beclin 1 다클론 항체( 미국, Abcam Company).
에키나코사이드 치료파킨슨 병
실험 방법
실험 동물의 그룹화
108마리의 C57BL/6J 마우스를 무작위로 6개 그룹으로 나누었고 각 그룹에는 18마리의 마우스가 있었습니다. 세부내용은 정상대조군(정상식염수군, N군), 모델군(MPTP군, M군),ECH(에키나코사이드) 그룹(MPTP 플러스ECH(에키나코사이드), EH 그룹), 유도된 자가포식 그룹(MPTP + 라파마이신 그룹, RA 그룹), 자가포식 억제제 A 그룹(MPTP +ECH(에키나코사이드)플러스 클로로퀸 그룹, CQ 그룹), 자가포식 억제제 B 그룹(MPTP 플러스ECH(에키나코사이드)플러스 Wortmannin 그룹, WO 그룹). MPTP의 용량은 30mg/kg/d로 7일 동안 지속적으로 주입하였다.ECH(에키나코사이드) 30mg/kg/d로 위내 투여했습니다.9
실험 동물 및 약물의 모델링
N군과 EH군에는 생리식염수를 투여하고ECH(에키나코사이드) 각각 모델링 3일 전부터 모델링 후 7일까지. Rapamycin,1{4}} wortmannin,11 및 chloroquine은 MPTP의 마지막 주사 후 연속 7일 동안 투여되었습니다. 라파마이신의 꼬리 정맥 주사 용량은 2mg/kg/d로 계산되었습니다. 생쥐에서 클로로퀸의 복강내 주사 용량은 50mg/kg/d였습니다. 마우스에서 wortmannin의 꼬리 정맥 주사 용량은 0.7mg/kg/d였습니다(보충 그림 1).
신경 행동 관찰
문헌12에 따르면 약간의 수정을 가하여 자체 제작한 극 테스트 장치는 다음과 같습니다. 장치는 길이 55cm, 직경 1cm의 PV 튜브로 상단에 직경 2cm의 구형 돌출부가 있습니다. 장치를 마우스의 부착 지점으로 사용합니다. 마우스가 떨어지는 것을 방지하기 위해 장치를 검은색 테이프로 덮었습니다. 각 마우스는 테스트 동안 머리가 위로 향하게 하여 구형 돌출 지점에 배치되었습니다. 배치된 봉의 상단에서 내려오는 헤드까지의 시간(T-턴)과 배치된 봉의 상단에서 튜브 바닥까지 올라간 후 착지까지의 총 시간(T-total)을 기록하였다.
자발적인 활동
개방장 활동이라고도 하는 자발적 활동은 MPTP 손상 후 드문 활동을 감지하는 일반적인 지표입니다.13 본 연구에서는 개방장 실험 비디오 분석 시스템을 채택했습니다. 구체적인 조작은 다음과 같다. 실험 전 같은 그룹의 쥐 4마리를 관찰 상자(길이 25cm, 폭 25cm, 높이 100cm)에 넣었다.
25cm) 30분 적응. 그런 다음 30분 동안 연속적으로 비디오를 녹화했습니다. 30-분 관찰 시간 창에서 수직 이동 횟수(사육 횟수)는 5분의 3개의 불연속 간격으로 별도로 계산되었습니다. 비디오 분석 시스템은 마우스의 활동 궤적을 자동으로 분석하여 수평 이동의 지표로 30-분 총 거리(Total Distance)를 얻었습니다.
보행 분석
보행 분석: 문헌14에 따르면 자체 제작한 보행 분석 장치를 사용했습니다. 이 장치는 다음과 같습니다. 나무 산책로(길이 42cm, 너비
4.5cm, 높이 12cm), 한쪽 끝은 열려 있고 다른 쪽 끝은 다람쥐 케이지로 연결되었습니다. 다람쥐 케이지는 검은 천으로 덮여있었습니다. 파란색 잉크가 마우스의 발 바닥에 담겼습니다. 그런 다음 마우스를 통로의 열린 끝에 놓았다. 쥐는 자연스럽게 검은 천으로 덮인 다람쥐 우리의 끝으로 움직였다. 세 개의 가장 긴 앞다리와 뒷다리 보폭을 각각 측정하고 평균값을 취했습니다.
로타로드 테스트
마우스를 가변 속도 로타로드에 놓고 로타로드의 속도를 5분 이내에 4라운드/분에서 40라운드/분으로 증가하도록 조정했습니다. 로타로드 회전 시작부터 매번 로타로드에서 마우스가 떨어질 때까지의 시간을 낙하 대기 시간으로 기록했습니다. 고성능 액체 크로마토그래피 전기화학 검출(HPLC-ECD)을 통한 선조체의 모노아민 신경전달물질 함량 측정
샘플링 및 처리
마우스를 안락사시키고, 선조체를 얼음 위에서 신속하게 분리하고 무게를 쟀다. 뇌의 0.1g에 대한 5% 과염소산 1mL의 비율(습중량)에 따라 각 그룹의 표본을 해당 부피의 과염소산이 담긴 유리에 넣고 슬러리 튜브에서 균질화했습니다. . 균질물을 20분 동안 13,{5}} r/min의 낮은 온도에서 원심분리했습니다. 상층액을 취하여 원심분리를 반복하였다. 상층액은 추가 검출을 위해 저온 냉장고에 두었다. HPLC-ECD의 조건은 다음과 같습니다. Couloehemlll 53{19}}0 전기화학 크로마토그래피가 채택되었습니다. 검출 수단은 MD{12}}의 크로마토그래피 컬럼(3.0*150 mm; 3 um), MDTM{17}}의 이동상, 2uA의 감도를 갖는 5020 및 504 lb 셀이었습니다. 유속은 0.6mL/min, 전극 전위는 220mV, 컬럼 온도는 30℃로 하였다. 주입 부피는 20ul(첫 번째 10배 희석)이었습니다.
다음 신경전달물질의 함량은 도파민(DA), 디하이드록시페닐아세트산(DOPAC), 고바닐산(HVA), 노르에피네프린(NE), {{0}}하이드록시트립타민(5-HT), 5-하이드록시인돌아세트산(5-HIAA). TH, -Synuclein, LC3 및 p62의 면역형광 염색 마우스(그룹당 n=6)를 깊은 마취(5% 염소 수화물) 하에 안락사시키고 0.9% 염화나트륨으로 관류시켰습니다. 좌심실을 통해 4% 파라포름알데히드가 뒤따릅니다. 뇌를 신속하게 제거하고 24시간 동안 후고정한 다음 가라앉을 때까지 4℃에서 30% 자당을 함유하는 인산완충식염수(PBS)로 옮겼습니다. 조직을 파라핀에 포매하고 썰매 마이크로톰을 사용하여 흑색질(SNc; bregma에 대해 -2.8 ~ -3.8 mm 꼬리)을 통해 관상 섹션(30 μm)을 절단했습니다. 섹션을 탈랍하고 수화하고 내인성 과산화효소를 0.3% H2O2로 30분 동안 켄칭했습니다. 열 유도 항원 검색 후 슬라이드를 0.5% Triton-X100과 5% 소 혈청 알부민과 함께 각각 30분 동안 배양했습니다. 그런 다음 섹션을 항{34}}시누클레인 항체, 항-TH 항체, 항-LC3 항체, 항-p62 항체 및 상응하는 형광 2차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션했습니다. PBS에서 5분간 3회 세척한 후 , 절편을 비오틴화된 이차 항체에서 1시간 동안 배양한 다음, 아비딘-비오틴 복합체에서 30분 동안 배양하였다. 과산화효소 활성은 3.{45}}디아미노벤지딘으로 시각화되었습니다.
탐지웨스턴 블롯에 의한 단백질의
SNc 단백질을 추출하고(그룹당 n {0}} 마우스), 12-15% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. 막을 5% 무지방 우유로 실온에서 1.5시간 동안 차단하고 4℃에서 TH, synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR 및 GAPDH에 대한 항체와 함께 밤새 배양했습니다. . 다음날, 막을 0.1% Tween 20을 함유하는 트리스 완충 식염수로 헹구고 1.5시간 동안 상응하는 이차 항체와 혼성화시켰다. 강화된 화학발광을 사용하여 단백질을 시각화하고 면역반응성 밴드를 이미지 분석 소프트웨어(Gel Doc{18}}UV; Bio-Rad, Richmond, CA)로 분석하여 GADPH로 정규화된 -synuclein 및 TH 밴드의 광학 밀도를 계산했습니다.
항체 정보: 토끼 다클론 LC3 항체: 1:1000. 토끼 다클론성 P62 항체: 1:1000. Beclin 1 다클론 항체: 1:1000. 마우스 항 TH 단일클론 항체: 1:1000. 토끼 다클론-시누클레인 항체: 1:1000.
투과전자현미경에 의한 흑질의 미세구조 관찰
마우스(그룹당 n=6)를 5% 클로랄 수화물로 안락사시키고 빙냉 PBS로 좌심실을 통해 관류시킨 다음 PBS 중 4% 파라포름알데히드 및 1% 글루타르알데히드를 관류시켰다. 뇌를 제거하고 4℃에서 6시간 동안 2.5% 글루타르알데히드에 후고정시켰다. SNc를 약 1mm3의 블록으로 절단하고 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 PBS에 고정하고 추가 처리를 위해 4℃에서 보존하였다. 단편을 동일한 완충액의 1% 사산화 오스뮴에 후고정하고 등급 알코올을 통해 탈수하고 Epon 812(Shell Chemical Co., Houston, TX)에 포매했습니다. 초박형(50 nm) 절편을 초미세절단기를 사용하여 절단하고, uranyl acetate와 lead citrate를 사용하여 염색하고, 투과 전자 현미경(Leica TCS SP2CLSM, School of Medicine Electron Microscopy Center, Fudan University)으로 분석했습니다.
통계 분석
본 연구의 모든 측정 데이터는 평균±표준오차의 형태로 표현하였으며, 통계분석은 GraphPad Prism 5.{1}}(GraphPad Software Inc, San Diego, CA) 소프트웨어로 처리하였다. 피<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">
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