1부 쥐 모델에서 스타틴과 함께 사용할 때 Herba Cistanches의 보조제 가치

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 홍콩 중문대학교 중국의학연구소, 샤틴, 홍콩, 신계.

2 중국 서부의 식물화학 및 식물 자원의 국가 핵심 연구소, 홍콩 중문 대학교, 샤틴, 홍콩, 신계.

3 임상 약리학부, 의약 및 치료학과, 홍콩 중문대학교, 샤틴, 홍콩, 신계. Elaine Wat와 Chun Fai Ng는 이 작업에 동등하게 기여했습니다. 자료에 대한 서신 및 요청은 CBSL(이메일: claralau@cuhk.edu.hk)로 보내야 합니다.

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추상적인

스타틴은 근육 독성 문제가 있는 것으로 잘 알려져 있습니다.허바시스탄체스(HC)는 전통적으로 허리와 무릎의 통증에 사용되는 한약재입니다. 우리의 이전 시험관 연구에서는 스타틴 유발 근육 독성으로부터 보호할 수 있다고 제안했습니다. 그러나 생체 내 보호 효과는 조사된 적이 없습니다. 이 연구의 목적은 수성 추출물이허바시스탄체(HCE)는 쥐에서 심바스타틴으로 유발된 근육 독성을 예방할 수 있고 Herba Cistanche E가 고지방식으로 유발된 고콜레스테롤혈증과 간 콜레스테롤 상승을 줄이는 데 유익한 효과를 발휘하여 병용 요법에 사용될 때 심바스타틴의 용량을 줄일 수 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 우리의 결과로부터 Herba Cistanche E는 simvastatin으로 유발된 근육 중량 감소를 유의하게 회복시켰고 쥐의 혈장 크레아틴 키나아제 상승을 감소시켰습니다.허바시스탄체E는 또한 근육 글루타티온 수준의 심바스타틴 유도 감소, 근육 미토콘드리아 막 전위 및 심바스타틴 유도 근육 염증 감소를 개선했습니다. 또한, HCE는 고지방식이 마우스에서 간 중량, 총 간 지질 수준 및 혈장 지질 수준을 감소시킬 수 있습니다. 결론적으로, 우리의 연구는 다음과 같은 생체 내 증거를 제공했습니다.허바 시스탄체E는 심바스타틴에 의해 유발된 근육 독성에 대한 잠재적인 보호 효과가 있으며, 단독으로 또는 심바스타틴과 감량된 용량으로 병용할 경우 식이 유발성 비알코올성 지방간 및 고지혈증에 대한 유익한 효과도 있습니다.

스타틴이라고도 하는 HMG-CoA 환원효소 억제제는 중등도 및 고위험 심혈관 질환 위험이 있는 고콜레스테롤혈증 환자에게 유익한 것으로 잘 알려져 있습니다1. 세계에서 가장 많이 팔리는 처방약 중 하나인 스타틴은 메발로네이트 경로의 초기 단계에서 HMG-CoA가 메발론산으로 환원되는 것을 억제하여 내인성 콜레스테롤 합성을 감소시킵니다2, 3. 비록 스타틴이 일반적으로 내약성이 우수하지만 , 가장 중요하고 잘 알려진 임상 부작용 중 하나는 양성 근육통에서 중증 근육병에 이르는 골격근 이상입니다4, 5. 전화 인터뷰를 통해 프랑스인 10,409명을 대상으로 한 대규모 설문 조사에서 스타틴 치료는 근육 증상을 보고했으며 이 중 30%는 증상이 있는 환자의 치료를 중단했습니다6. National Lipid Association Statin Safety Task Force는 스타틴 요법을 받는 환자의 근육 관련 증상 관리에 대한 권장 사항을 제공했습니다. 일반적으로 5×ULN 이상의 크레아틴 키나아제(CK) 상승과 같은 중증 증상이 있는 환자의 경우 CK 수치가 다시 정상화될 때까지 스타틴 투여를 보류하는 것이 권고된다5. 이러한 부작용의 발생과 스타틴 유발 근육 독성에 대한 효과적인 치료법이 존재하지 않기 때문에, 스타틴 유발 근육 문제의 관리를 위한 새로운 치료법에 대한 모색이 요구되고 있다.

여러 메커니즘이 제안되고 스타틴의 부작용에 대한 책임이 있을 수 있지만 미토콘드리아 메커니즘은 스타틴1의 근육 독성 부작용에 연루된 것으로 믿어집니다. 메발로네이트는 콜레스테롤 전구체일 뿐만 아니라 셀레노단백질, 돌리콜 및 유비퀴논과 같은 중요한 화합물의 전구체이기도 합니다. 효과4. 스타틴은 또한 유비퀴논 고갈로 이어져 산소 소비와 ATP 합성을 감소시킬 수 있습니다9. 또한, 증가하는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 스타틴이 조직 미토콘드리아에 직접 작용하여 활성 산소 종(ROS)과 미토콘드리아 산화 스트레스를 증가시켜 세포 사멸을 유도하고 따라서 간 및 근육 손상에 기여할 수 있음이 입증되었습니다10, 11.

허바시스탄체스, 전체 건조 식물시스탄체데저티콜라YC Ma(Orobanchaceae family)는 중국 북부와 북동부의 사막 지역에서 주로 자라는 기생 식물입니다12. 한의학 이론에 따르면 한약재는 단맛, 따뜻함, 짠맛13이 있습니다. 그것은 주로 발기 부전, 불임, 조루와 같은 증상이 있는 신장 결핍을 치료하는 데 사용되는 양 기운을 돋우는 중국 강장제입니다. 그것은 또한 전통적으로 허리와 무릎의 통증에 대해 환자에게 처방되는 한약재이며 근육 문제 치료를 위한 중국 제제에서 일반적으로 사용됩니다12, 14. 흥미롭게도 이것은 현대 과학 연구에서 -근육 손상을 감소시키고 ATP 저장을 개선함으로써 운동 후 쥐에게 풍부한 다당류 및 페닐에타노이드가 풍부한 추출물의 피로 활성. 게다가, 최근 연구는 Herba Cistanches의 메탄올 추출물이 미토콘드리아 ATP 생성을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다.허바시스탄체스또한 생체 내 연구 17, 18에서 산화 스트레스와 ROS 활성을 감소시켜 다양한 기관에서 강력한 항산화제 및 자유 라디칼 제거제로 입증되었습니다. 우리 실험실에서 수행한 최근 연구에서 우리는 우리의허바시스탄체스수성 추출물은 L6 골격근 세포에서 심바스타틴에 의한 독성을 유의하게 예방할 뿐만 아니라 L6 세포에서 심바스타틴에 의한 ATP 생성 감소를 용량 의존적으로 회복시켰습니다.허바시스탄체스스타틴 유발 근육 독성으로부터 보호하는 수성 추출물19. 그럼에도 불구하고 생체 내 증거는 부족합니다.

따라서 우리는 다음과 같이 가정했습니다.허바시스탄체스수성 추출물(HCE)은 심바스타틴 유발 근육 독성에 유익한 효과를 나타낼 수 있습니다. 따라서 본 연구는 생체 내 동물 모델을 사용하여 HCE의 사용이 심바스타틴 유발 근육 독성을 감소시킬 수 있는지, 또한 HCE가 고지방식이로 유발된 고콜레스테롤혈증 및 간 콜레스테롤 상승을 감소시키는 데 유익한 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하는 것을 목적으로 했습니다. , 따라서 사용되는 심바스타틴의 용량을 줄입니다.

재료 및 방법

한약재 인증 및 추출.

의 원료 한약재허바시스탄체스(Cistanche Deserticola, 내몽고산)은 중국 광저우의 유명 공급업체인 Zi Xin에서 구입했습니다. Herba Cistanches는 이전에 설명된 대로 중국 약전 201013에 따라 박막 크로마토그래피 및 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 화학적으로 인증되었습니다.버바스코사이드그리고에키나코사이드(중국 국립 제약 및 생물 제품 통제 연구소에서 구입) 화학 표지. 화학물질 인증시 식물표본표본 표본허바시스탄체스바우처 표본 번호가 2014-3434인 홍콩 중문대학교 중국 의학 연구소 박물관에 기탁되었습니다.

허바시스탄체스수성 추출물은 이전에 설명된 대로 준비되었습니다19. 간단히 말해서, 생약초 1kg을 1시간 동안 담그고 10배 증류수를 사용하여 100도에서 1시간 동안 가열 환류하여 2회 추출하였다. 이어서, 수성 추출물(HCE)을 합하고 여과하고, 여액을 60도에서 감압 하에 농축시켰다. 농축된 추출물을 동결건조하여 건조시켰다. 수율의 백분율은 50.1% w/w였다. 추출된 모든 분말은 진공 포장되어 사용할 때까지 보관되었습니다.

실험 동물.

Simvastatin은 SR Pharmasolutions Ltd.에서 구입했습니다. 수컷 Sprague Dawley 쥐(180–200g)와 수컷 C57Bl/6J 마우스(8-주령)는 홍콩 중문 대학교의 실험 동물 서비스 센터에서 제공했습니다. 동물 실험은 홍콩 중문 대학의 동물 실험 윤리 위원회(Ref no. 12/074/MIS)의 승인을 받았습니다. 모든 실험 방법은 홍콩중문대학교 동물실험윤리위원회에서 지정한 승인된 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 쥐(케이지당 3마리)와 마우스(케이지당 5마리)는 12-h 명암 주기로 21도의 일정한 온도에서 정상적인 표준 우리에 수용되었습니다. 각 표준 케이지는 침구 재료로 아스펜을 포함했습니다. 모든 동물은 식이와 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다.

쥐의 스타틴 유발 근육 독성 연구.

모든 쥐를 무작위로 5개 그룹(n=5–10)으로 나누었습니다. 모든 동물은 정상적인 식사를 하고 있었습니다. 그들은 또한 매일 증류수 또는 심바스타틴을 투여받았고 HCE 치료 유무에 관계없이 위내 투여했습니다. 심바스타틴과 HCE를 모두 투여해야 하는 동물의 경우 심바스타틴 투여 후 3시간 후에 HCE를 투여하여 직접적인 허브-약물 화학적 상호작용을 방지했습니다. 약초 추출물 또는 심바스타틴은 알려진 농도의 증류수에 0.5% 메틸셀룰로오스에 용해되었습니다. 미리 계산된 부피를 개인의 체중에 따라 각 동물에게 위내로 주어 계산된 부피가 필요한 제안된 용량의 양을 포함하도록 하였다. 이러한 그룹의 세부 정보는 다음과 같습니다.

그룹 a) 일반식과 증류수(정상 대조군)

그룹 b) 일반식과 심바스타틴(640mg/kg)

그룹 c) 정상 식사 + 심바스타틴(640mg/kg) + 저용량 HCE(1.1g/kg 동물)

그룹 d) 정상 식사 + 심바스타틴(640mg/kg) + 고용량 HCE(2.2g/kg 동물)

그룹 e) 정상 식사 + 고용량 HCE(2.2g/kg 동물)

음식 섭취량은 매일 기록되었고 체중은 매주 2회 측정되었습니다. 4주 동안 치료를 받았습니다. 그 후 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물을 복강내로 동물을 마취시켰다. 심장 천자에 의해 혈액을 채취하고 응고되도록 하였다. 그런 다음 혈장을 원심분리(10분 동안 3,{4}} rpm)로 분리했습니다. 다양한 근육(대퇴사두근, 비복근, 가자미근, 전방 경골, 장지 신근)을 절제하여 분석할 때까지 -80도에서 보관하였다.

혈장 크레아틴 키나제 측정. 혈장 크레아틴 키나제(CK) 활성은 제조업체의 지침에 따라 Stanbio CK Liqui-UV® 키트(2910-430, Stanbio Laboratory, USA)를 사용하여 결정되었습니다.

근육 글루타티온 퍼옥시다제 측정. 근육 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)는 제조사의 지침에 따라 시판되는 키트(703102, Cayman Chemical, USA)를 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 근육 조직을 pH 7.4의 PBS로 세척하여 적혈구를 제거하고 5-10ml 저온 용해 완충액에서 균질화한 후 균질액을 4도에서 10,{6}}g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 상업용 키트를 사용하여 GPx 활성에 대해 분석했습니다.

근육 미토콘드리아 및 세포질 분획 준비. 근육 샘플의 미토콘드리아 및 세포질 분획은 제조업체의 지침에 따라 Mitochondria Isolation Kit(MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA)를 사용하여 준비했습니다. 간단히 말해서, 신선한 근육 샘플을 추출 버터로 전처리하고 작은 조각으로 자르고 추출 버퍼에서 균질화했습니다. 그 다음, 조직 균질물을 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 세포질 분획 분석을 위해 예약했습니다. 그런 다음 미토콘드리아 펠릿을 세척하고 다시 원심분리하여 미토콘드리아 분획 분석에 사용했습니다.

근육 미토콘드리아 반응성 산소 종(ROS) 측정. ROS는 이전 문헌에서 수정된 프로토콜로 측정되었습니다20. 간단히 말해서, ROS는 DCFDA 용액(C6827, Invitrogen, USA)을 사용하여 미토콘드리아 분획(50μg 단백질/ml)에서 측정되었습니다. 혼합물을 암실에서 37도에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 광활성화를 위해 기질 용액(10mM 피루베이트, 15mM 말레이트)과 함께 인큐베이션하였다. BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader로 485nm 여기 및 520nm 방출에서 5분마다 60분 동안 형광 강도를 측정했습니다. 형광 강도는 ROS 생성 측정을 위해 계산되었습니다.

근육 미토콘드리아 막 전위. 근육 샘플의 미토콘드리아 분획의 미토콘드리아 막 전위는 제조사의 프로토콜(MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA)에 따라 결정되었습니다. 이 절차는 J-응집체의 형성과 함께 JC-1의 흡수를 측정하는 고정 소수점 분석입니다. 간단히 말해서, 미토콘드리아 현탁액은 20μg의 단백질을 함유하도록 희석되었고 실온에서 7분 동안 JC{5}} 염색과 함께 인큐베이션되었습니다. 이 7-분은 용액의 관찰된 형광이 5-10분 후에 안정기까지 상승한 다음, 미토콘드리아 기질 내부와 외부의 JC 농도 균등화로 인한 JC 형광. 형광 강도는 490nm 여기 및 590nm 방출에서 BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader에 의해 측정되었습니다. 형광 강도는 전위 구배의 측정을 위해 계산되었습니다.

근육 조직학 및 염증 평가. 근육 내 염증 세포의 면역 조직 화학은 이전에 설명한 대로 CD68 및 CD163 염색에 의해 평가되었습니다. 5μm의 Parafn 섹션을 절단하여 Superfrost™ Plus 유리 슬라이드(Menzel-Gläser, Germany)에 부착했습니다. 1차 마우스 항-쥐 CD68, ED1 및 CD163 항체, ED2(Bio-Rad, USA)를 1:100 희석으로 섹션에 적용했습니다. 특정 염색은 EnVision™ Systems(Dako, Denmark)에 의해 1:200의 희석률로 2차 항체인 EnVision-HRP 폴리머-접합 항-마우스 IgG를 사용하여 검출되었고, DAB 용액(Dako, 덴마크)을 사용하여 검출되었다. 헤마톡실린으로 대조염색. 그런 다음 섹션을 히스톤 중 디부틸-프탈레이트(DPX)에 장착했습니다. 근육 내 호중구의 존재는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량적 면역조직화학에 의해 검출되었습니다.

근육 유전자 발현 분석. Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense PCR 어레이(PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA)를 사용하여 산화 스트레스와 관련된 유전자를 프로파일링하는 PCR 분석을 수행했습니다. 제조사의 지시에 따라 PCR 어레이를 수행하였다. 간단히 말해서, 변성 구아니딘 티오시아네이트 완충액(RNeasy 키트, Qiagen)에서 근육 샘플을 용해 및 균질화한 후 실리카 겔 기반 막에 선택적으로 결합하여 총 RNA를 분리했습니다. RNA는 RT2 First Strand Kit(SABiosciences, Frederick, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사되었습니다. 그런 다음 이 cDNA를 RT2 SYBR Green qPCR 마스터 믹스(SABiosciences, Frederick, USA)에 추가했습니다. 다음으로, 각 샘플은 Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense PCR-arrays(SABiosciences, Frederick, USA)에서 분취되었습니다. 모든 단계는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

쥐의 고지방식이 유발 고지혈증 및 간 지방증에 관한 연구.

모든 마우스를 무작위로 5개 그룹(n=8-10)으로 나누고 다음을 받았습니다. 그룹 a) 일반 사료(표 1); 그룹 b에서 e) 고지방식(21% 지방 및 0.15% 콜레스테롤 함유)(표 2). 동물이 비만을 유도할 수 있도록 8주 동안 식이요법을 하였다. 8주 후 모든 고지방식이 그룹은 simvastatin 투여 3시간 후에 증류수 또는 매일 simvastatin을 투여하고, 또는 HCE 치료를 위내 투여하였다. 약초 추출물 또는 심바스타틴을 알려진 농도의 증류수에 0.5% 메틸셀룰로오스(Sigma-Aldrich Corporation, USA)에 용해시켰다. 미리 계산된 부피를 개인의 체중에 따라 각 동물에게 위내로 주어 계산된 부피가 필요한 제안된 용량의 양을 포함하도록 하였다. 이러한 그룹의 세부 정보는 다음과 같습니다.

그룹 a) 일반식과 증류수

그룹 b) 고지방 식이와 증류수

그룹 c) 고지방식과 심바스타틴(50mg/kg)

그룹 d) 고지방 식이와 HCE(4.4g/kg)

그룹 e) 고지방식 + 심바스타틴(25mg/kg) + HCE(4.4g/kg)

음식 섭취량은 매일 기록되었고 체중은 매주 2회 측정되었습니다. 16-주 연구가 끝날 때 16-시간의 밤새 금식 후에 모든 마우스를 희생시켰습니다. 동물은 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물로 복강 내 마취되었습니다. 심장 천자에 의해 혈액을 채취하고 응고되도록 하였다. 혈장을 원심분리(10분 동안 3,{5}} rpm)로 분리했습니다. 간을 절제하고 분석할 때까지 -80도에서 보관하였다.

혈장 및 간 지질 측정.

혈장 중성지방, 콜레스테롤(11488872216 및 11489232216, Roche Diagnostics, Switzerland), 고밀도 및 저밀도 지단백 콜레스테롤(L-Type HDL-C 및 L-Type LDL-C, Wako Pure Chemicals Industries, Japan) 농도는 다음과 같이 측정되었습니다. 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하는 효소적 방법. 혈장 크레아틴 키나제(CK) 활성은 Stanbio CK Liqui-UV® 키트(2910-430, Stanbio Laboratory, USA)를 사용하여 결정되었습니다. 총 간 지질은 Bligh 및 Dyer24의 방법으로 추출한 후 중량 측정으로 결정되었습니다. 개별 간 지질은 이소프로판올(Sigma-Aldrich, USA)에서 가용화한 후 효소적으로(위에서 설명한 대로) 정량화되었습니다.

간 조직병리학 및 염증 평가. 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E 염색). 파라핀이 포매된 조직의 틱 섹션(5μm)을 마이크로톰으로 절단하고 SuperFrost Plus® 현미경 슬라이드(Thermo Scientific, USA)에 놓았다. 단면은 Harris 등의 방법에 따라 H&E 염색을 하였다. 26 및 히스톤 중 디부틸-프탈레이트(DPX)(Sigma-Aldrich, USA)25로 장착되었습니다.

Mac{0}} 염색 및 정량화. 파라핀이 포함된 조직의 두꺼운 부분(5μm)을 마이크로톰을 사용하여 절단하고 SuperFrost Plus® 현미경 슬라이드(Thermo Scientific, USA)에 놓았다. 항원 검색을 수행한 후 Peroxidase Block(Dako Cytomation, Denmark)으로 차단하였다. 1차 정제된 항-마우스 Mac{4}} 항체(BD Pharmingen, USA)를 1:50 희석으로 섹션에 적용했습니다. EnVision™ Systems(Dako, 덴마크)를 사용하여 특정 염색이 감지되었습니다. 슬라이드는 1:200의 희석에서 2차 항체인 EnVision-HRP 고분자 결합 항토끼 IgG와 함께 배양되었습니다. Mac{12}}은 DAB 용액(Dako, Denmark)을 사용하여 검출되었고 헤마톡실린으로 대조염색되었습니다. 그런 다음 섹션이 DPX에 마운트되었습니다. 간에서 대식세포의 존재는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량적 면역조직화학에 의해 검출되었습니다.

통계 분석. 처리군과 대조군 간의 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 테스트한 후 사후 Bonferroni의 다중 비교 테스트로 테스트했습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 6.0(GraphPad, USA)을 사용하여 수행되었습니다. p의 확률<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

결과

의 효과허바시스탄체쥐의 심바스타틴 유발 근육 독성에 대한 E. 근육량 및 혈장 크레아틴 키나제 측정. 5가지 다른 유형의 근육(사두근, 비복근, 가자미근, 앞쪽 경골, 장지신근)을 처리된 모든 쥐에서 분리했습니다. 근육 무게에 대한 다양한 처리의 효과는 그림 1a에 나와 있습니다. Simvastatin(640mg/kg)은 쥐의 대퇴사두근, 비복근 및 경골 전방 근육에서 상당한 체중 감소를 유도한 반면, 이러한 감소는 HCE에 의해 대퇴사두근 및 비복근 근육에서 용량 의존적으로 유의하게 회복되었습니다. 하지만허바시스탄체E는 심바스타틴으로 처리된 쥐에서 앞경골근의 무게를 회복시키는 경향을 나타내었지만, 이들 처리군 중 어느 것도 통계적 유의성에 도달하지 못했습니다. 대조군 쥐와 비교할 때 근육 중량에 대한 HCE 단독 치료의 유의한 효과는 관찰되지 않았습니다(그림 1a).

그림 1b는 쥐의 혈장 크레아틴 키나제(CK) 수준에 대한 다양한 처리의 효과를 보여줍니다. Simvastatin은 쥐에서 크레아틴 키나아제 활성의 유의한 증가를 유도했으며, 이는 두 용량 모두에서 HCE 공동 처리에 의해 유의하게 감소되었습니다. 또한 대조군과 비교하여 CK 수준에 대한 HCE 단독 치료의 유의한 효과도 없었다. 비복근은 심바스타틴 치료에 민감한 것으로 나타났고 질량으로 분리된 가장 큰 근육이므로 근육 글루타티온 과산화효소 측정(GPx), 미토콘드리아 MMP 및 ROS 측정, 근육 조직학 및 염증 평가를 포함한 추가 분석을 위해 이 근육을 선택했습니다. .

근육 글루타티온 퍼옥시다제(GPx) 측정. 근육 글루타티온 퍼옥시다제 수준을 측정하여 도 2a에 나타내었다. Simvastatin 투여는 쥐에서 근육 글루타티온 과산화효소(GPx) 측정의 감소 경향을 유도했습니다. 그러나 HCE는 1.1g/kg 및 2.2g/kg의 두 용량 모두에서 심바스타틴에 의한 근육 GPx 감소를 개선하는 경향을 나타냈습니다. 또한 정상 대조군 쥐와 비교하여 근육 GPx 수준에 대한 HCE 단독 치료의 유의미한 효과도 없었습니다.

미토콘드리아 막 전위(MMP) 및 ROS 측정. Simvastatin(640mg/kg) 치료는 근육 MMP의 상당한 감소를 유도했습니다(그림 2b). 이 감소는 HCE와 심바스타틴의 동시 치료를 받은 쥐에서 용량 의존적으로 개선되었습니다(그림 2b). 반면에 흥미롭게도 simvastatin 단독 치료군은 정상 대조군에 비해 근육 미토콘드리아 ROS 수준이 유의하게 감소했습니다(그림 2c). 그러나 심바스타틴 처리 쥐에게 HCE 처리를 하면 근육 미토콘드리아 ROS 수준을 정상 수준으로 회복시키는 용량 의존적 경향이 나타났습니다. 또한 미토콘드리아 MMP 및 ROS 측정 모두에 대해 정상 대조군과 비교하여 쥐에서 HCE 단독 치료의 유의한 효과가 없었습니다.

근육 조직학 및 염증 평가. 다른 치료를 받은 쥐의 비복근 근육을 조직학적으로 추가 분석하고 대표적인 염색 섹션이 그림 3a에 나와 있습니다. 대조군 동물은 정상 근육의 조직학적 부분을 보여주었다. 대조적으로, 심바스타틴으로 처리된 동물의 H&E 섹션은 염증 마커(노란색 화살표)의 침윤을 나타냈으며, 이는 심바스타틴과 HCE의 조합을 고려할 때 쥐의 근육 섹션에서 상당히 감소했습니다. 면역 조직 화학적 분석은 또한 그림 4b 및 5b에 표시된 각 대식 세포의 정량화와 함께 그림 4a 및 5a의 대식 세포 CD68 및 CD163의 존재에 대해 수행되었습니다. 근육 섹션의 면역 조직 화학적 분석은 심바스타틴 처리된 쥐(갈색 착색)에서 대식세포(CD68)의 존재를 밝혀냈으며, 이는 두 용량에서 HCE 공동 처리를 받은 쥐에서 유의하게 감소했습니다(그림 4b). HCE 단독 처리 동물에서도 유의한 염증이 관찰되지 않았습니다. 유사하게, 근육 섹션의 면역조직화학 분석은 심바스타틴으로 처리된 쥐에서 CD 양성 대식세포의 존재(갈색 착색)를 보여주었으며, 이는 2.2g/kg에서 HCE를 공동 처리한 쥐에서 유의하게 감소했습니다(그림 5b). ). HCE 단독 처리 동물에서도 유의한 염증이 관찰되지 않았습니다.

근육 유전자 발현 분석. 근육 내 산화 스트레스와 관련된 유전자에 대한 심바스타틴과 HCE의 영향을 확인하기 위해 산화 스트레스와 관련된 유전자를 프로파일링하는 PCR 분석을 쥐의 산화 스트레스 및 항산화 방어 PCR 어레이를 사용하여 수행했습니다. 심바스타틴 처리에 의해 유의하게 영향을 받는 유전자를 분석하여 Fig. 6에 나타내었다. 항산화제 조절 유전자의 발현 프로파일을 위해, 심바스타틴(640mg/kg) 처리 쥐는 항산화제 조절 유전자의 발현을 증가시켰다. Tese에는 글루타티온 퍼옥시다제(GPx) GPx1 및 GPx7과 Serpinb1b 및 club을 포함한 기타 퍼옥시다제가 포함됩니다(그림 6a). 두 용량(1.1 또는 2.2g/kg)의 HCE는 GPx 및 기타 퍼옥시다제의 이러한 심바스타틴 유도 증가를 정상 수준으로 감소시켰습니다. 반면, HCE 단독 치료는 GPx1의 발현 수준을 유의하게 증가시켰다. ROS 대사를 조절하는 유전자의 발현과 관련하여, simvastatin은 Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1, Ucp2를 포함한 다른 슈퍼옥사이드 대사 유전자의 발현을 유의하게 유도하였다. 유사하게, 두 용량 모두에서 HCE는 이러한 증가를 상당히 감소시켰습니다(그림 6b). 또한, 심바스타틴은 Apoe, Ccl5 및 Txn1을 포함한 산화 스트레스 반응 유전자의 발현을 유도한 반면, 이러한 발현은 HCE 공동 처리 동물에서 두 용량 모두에서 유의하게 감소했습니다(그림 6c). 반면, simvastatin은 Txnip의 유전자 발현을 유의하게 감소시켰다. Txnip 유전자 발현의 simvastatin 유도 감소에 대한 HCE의 유의한 효과는 없었다(그림 6c). Simvastatin은 또한 Slc38a1 및 Vim을 포함한 산소 수송체를 조절하는 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰습니다. HCE 공동 처리는 두 용량 모두에서 이러한 유전자의 발현을 감소시켰습니다(그림 6d).

Simvastatin과 HCE의 병용이 쥐의 음식 섭취와 체중에 미치는 영향. 그림 7a는 모든 처리 그룹에 대한 마우스의 일일 음식 섭취량을 보여줍니다. 고지방식이는 사료를 먹인 동물에 비해 동물의 일일 음식 섭취량을 크게 증가시켰습니다(p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

주간 체중 측정. 고지방식이 16주 후, HF를 먹인 동물은 음식을 먹인 동물보다 훨씬 더 많은 체중을 얻었습니다(그림 7b). 그러나, HF를 먹인 마우스와 모든 HF를 먹인 처리군 사이에는 유의미한 효과가 없었다. 심바스타틴과 HCE의 공동 치료를 받은 HF 공급 마우스와 HCE 또는 심바스타틴 단독 치료를 받은 HF 공급 마우스 간에도 유의한 차이가 없었습니다(그림 7b).

쥐의 고지혈증과 간 지방증에 대한 심바스타틴과 HCE의 병용 효과. 혈장 지질 및 크레아틴 키나아제 활성 측정. 모든 마우스의 혈장 지질 수준은 그림 8에 나와 있습니다. 일반 음식을 먹인 마우스와 비교하여 HF를 먹인 마우스는 혈장 총 콜레스테롤(TC) 수치가 유의하게 상승했으며 모든 처리군에서 유의하게 감소했습니다(그림 8a). . 심바스타틴과 HCE를 투여한 HF를 먹인 마우스는 심바스타틴만 투여한 HF 동물이나 HCE만 투여한 HF 동물에 비해 혈장 TC가 유의하게 낮았습니다(p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

심바스타틴 단독 치료를 받은 HF를 먹인 마우스에 비해 낮은 혈장 TG(p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">지질 측정.

HF 유발 간비대(간 비대)에 대한 다양한 처리군의 효과는 간당 지질 밀리그램으로 표시되는 총 간 지질 함량의 상당한 감소와 관련이 있습니다(그림 9a). 총 간 지질 함량은 일반 사료를 먹인 쥐에 비해 HF를 먹인 쥐에서 유의하게 더 높았습니다(3.{5}}배 더 높음, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

그림 9b와 c에서 볼 수 있듯이 간 총 콜레스테롤(TC)과 간 중성지방(TG)을 측정한 결과 HF를 섭취한 쥐는 일반 음식을 섭취한 쥐(즉, 3.{4} } TC, p의 배 증가<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

간 염증 평가. 면역조직화학 염색을 수행하여 대식세포(Mac{0}})의 존재를 염색했습니다(그림 10a). 간 섹션의 면역조직화학적 분석은 고지방식과 일반 사료를 섭취한 쥐 모두에서 Mac-3의 존재를 밝혔습니다(갈색 착색). 이 염증은 심바스타틴 처리 동물에서 더 증가했지만 통계적 유의성은 없었습니다. 흥미롭게도 심바스타틴을 병용하거나 병용하지 않은 HCE 치료는 고지방식이 마우스에서 염증을 유의하게 감소시켰습니다. 모든 치료군을 비교할 때, 심바스타틴 병용 치료 여부에 관계없이 HCE 치료도 심바스타틴 치료군에 비해 염증이 유의하게 낮았습니다(p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

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