PART Ⅰ: 공생 유산균 Bulgaricus 6c3 균주, 이눌린 및 프락토올리고당의 투여는 황산인독실 및 신장 손상의 농도를 감소시킵니다
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales,JoseS.Merino,Sindy T.Diaz-Castillo & et al.
1. 소개
만성 신장 질환(CKD)는 영구적인 변경으로 간주됩니다.신장구조, 기능 또는 가장 심각한 경우에는 둘 다. CKD는 개인의 건강과 삶의 질에 직접적인 영향을 미칩니다[1,2]. 생리학적 수준에서 CKD 유발 변화는 크레아티닌, 시스타틴 Cor ureic 질소의 혈청 수준 증가로 자주 관찰됩니다. 예를 들어, 미국 인구의 15%가 이 병리학의 영향을 받는 것으로 결정될 정도로 CKD 진단이 강화되고 인구에 대한 인식이 높아졌습니다[3]. 질병의 진행과 위에서 언급한 대사 산물의 영향은 심혈관 및 위장 시스템을 포함한 신체의 여러 시스템에 심각한 영향을 미치며, 이러한 대사 산물의 존재는 전자의 사망률 증가와 관련이 있습니다. 후자의 동화, 운동성 및 투과성에 영향을 미칩니다[4,5]. 위장 변화는 장의 대사 산물의 흡수를 증가시켜 전신 염증을 지속시키는 데 기여하며, 이는 차례로 정상 미생물군의 구성과 대사 기능에 영향을 미치고 장내 세균 불균형을 유발할 수 있습니다[6].
CKD와 장내 세균총의 불균형은 식단의 변화뿐만 아니라 암모늄 농도 증가에 따른 내강 pH의 증가로 설명될 수 있습니다[7]. 말기 CKD 환자는 건강한 개인과 비교할 때 대변에 있는 여러 박테리아 분류군의 풍부함에 현저한 차이가 있습니다[8]. 특히, 세균속 수준에서 CKD 환자는 Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella, Allobaculum의 증가와 Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactococcus의 감소를 나타냅니다. , Leuconostoc, Alkaliphilus 및 Pseudomonas [9-11]. 열악한 신장 정화 또는 장내 세균 불균형으로 인해 독성 대사 산물을 생성하는 병원체를 대사 및 억제할 수 있는 박테리아 속이 감소하여 증가합니다[12]. Wong et al. [8]은 진행성 CKD를 앓고 있는 환자가 우레아제, 우리카제와 같은 효소를 보유하는 박테리아 그룹과 p-크레졸 및 인돌을 생산하는 박테리아 그룹의 증가를 보여주었다.
다음을 포함한 혈액 내 요독정체 대사 산물(URM) 축적인독실 설페이트(IS), p-크레실 설페이트(pCS), 트리에틸아민 및 트리메틸아민 N-옥사이드(TMAO)[5]는 CKD의 촉진제로 가정됩니다[13]. 이다(인독실 설페이트)가장 잘 알려진 요독 인돌은 근위 세뇨관에서 분비됩니다.신장그리고 그것은 세균성 트립토파나제에 의한 트립토판의 대사에서 유래합니다. 동물 모델의 증거는 IS가(인독실 설페이트)신장 기능에 영향을 줄 수 있고 내피 세포에서 산화 스트레스를 생성하고 복구 기전을 억제하며 간질 세뇨관 섬유증을 촉진하는 세관의 세포를 손상시킬 수 있습니다. 이는 금속단백분해효소의 조직 억제제(TIMP)인 TGF{0}}의 유전자 발현을 증가시키기 때문입니다. -1) 및 콜라겐[14]. 그럼에도 불구하고 장내 미생물총의 불균형과 독성 대사산물의 생산은 수정될 수 있습니다. 특정 프로바이오틱스와 프리바이오틱스를 보충하면 특정 요독 독소의 생성을 감소시키고 정상적인 미생물군을 회복할 수 있다고 설명되었습니다[5]. 예를 들어, 메타 분석 연구에 따르면 프로바이오틱 균주 보충제를 투여받는 CKD 환자는 항염증성 사이토카인을 증가시키고 요독 독소 수준을 감소시켰다[15,16]. 일부 연구에서는 probiotics와 prebiotics의 조합인 synbiotics의 투여가 CKD의 진행을 감소시킬 수 있고 유리한 결과를 얻을 수 있다고 보고했습니다[12]. 현재 연구의 맥락에서 이눌린 유형 프럭탄은 관련 프리바이오틱스입니다. CKD의 진행을 감소시키고 pCS 및 IS와 같은 URM을 감소시키는 능력[17](인독실 설페이트)[18]. Panza et al. (2017)은 2-5 병기 CKD 환자에게 프로바이오틱스 L.acidophlilus 및 Bifidobacterium longum + fructooligosaccharides(FOS)를 투여했으며 치료를 받지 않은 환자가 유의하게 더 많은 pCS를 갖고 있으며(인독실 설페이트)synbiotic 치료를 받은 환자보다 혈액 내에서 [19]. 이 작업에서 우리는 먼저 IS를 감소시키는 프로바이오틱 균주의 능력을 평가했습니다.(인독실 설페이트)시험관 내에서 가장 유망한 것을 선택합니다. 그런 다음, 이 균주를 프리바이오틱스 이눌린 및 프락토올리고당(FOS)과 결합하여 추정되는 신바이오틱을 얻었다. 이 프리바이오틱스는 pCS와 IS를 감소시킬 수 있음을 보여주기 때문에 선택되었습니다.(인독실 설페이트)혈중 농도 [17,18]. 마지막으로, 추정되는 신바이오틱의 효율성을 생체 내에서 테스트하여 혈액 IS를 평가했습니다.(인독실 설페이트)및 크레아티닌 수치 및신장및 다음을 포함하는 랫트 모델(Sprague-Dawley rats)을 사용한 심장 손상신장결핍(신절제) 및 치료되지 않은 동물.
2. 결과
2.1.IS를 감소시킬 수 있는 균주의 분리(인독실 설페이트)시험관 내
36개의 유제품 샘플에서 84개의 균주가 감별 배지로 사용되는 브로모페놀 블루(MRS-BFB)가 보충된 MRS 한천에서 분리되었습니다. 이 배지를 통해 유산균을 구별할 수 있습니다. pH 3에서 집락은 노란색으로 착색되고 pH 5에 가까우면 파란색으로 착색됩니다[19]. 분리된 84개 균주 모두를 시험관 내에서 테스트하여 IS 감소를 매개하는 능력을 결정했습니다.(인독실 설페이트). 이를 위해 균주를 2.8mM IS가 보충된 MRS 배지에서 배양하였다.(인독실 설페이트)48시간 후 IS(인독실 설페이트)고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정했습니다. 균주 lc2, 6c3 및 VIc2는 상당히 감소할 수 있었습니다(p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(인독실 설페이트)IS를 줄이기 위해 시너지 효과를 발휘했는지 평가하기 위해(인독실 설페이트). 세 가지 균주가 모두 IS의 존재 하에 함께 배양되었을 때(인독실 설페이트), IS 농도(인독실 설페이트)또한 유의하게 감소되었지만 균주 단독에 의해 달성된 것보다 적으므로 시너지 활성의 가능성이 배제되었습니다(표 1).
1 번 테이블.시험관 내 감소,인독실 설페이트(IS)는 박테리아 균주에 의해 매개되는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 평가됩니다.
2.2. 선택된 균주의 식별
IS를 감소시키는 능력으로 인해 선택된 3가지 균주(인독실 설페이트)DNA의 PCR 증폭 후 16S rRNA 시퀀싱에 의해 확인되었습니다. 균주 1c2는 분자 분석에서 Streptococcus thermophilus에 대한 LacZ 프라이머로 증폭된 그람 양성 사슬 형성 구균이었습니다. 균주 6c3 및 VIc2는 둘 다 그람 양성 간균이었고 LbG 프라이머로 증폭하여 Lactobacillus 속을 식별했습니다. 16SrRNA 시퀀싱의 분석을 통해 균주 lc2를 Streptococcus thermophilus(97.3% 유사성, 접근 번호: AY188354.1)로, 균주 6c3을 Lactobacillus bulgaricus(99.7% 유사성, 접근 번호: CR954253으로, 접근 번호: CR954253)로 식별할 수 있었습니다. 99.5% 유사성, 액세스 번호: AY773947.1). 세 가지 균주 중 하나만 선택하여 신바이오틱을 준비하고 다음 분석을 수행했습니다. Streptococcus thermophilus 1c2 균주는 낮은 성장률을 보여 폐기하였다. 나머지 두 균주 중에서 Lactobacillus bul-garicus 6c3 균주가 Lactobacillus acidophilus VIIc2 균주보다 프로바이오틱 기능과 안전성 특성이 우수하여 선택하였다.
2.3. 혈액 크레아티닌 및 IS에 대한 Synbiotic의 효과(인독실 설페이트)레벨
프로바이오틱 L. bulgaricus 6c3은 프리바이오틱스 Inuline 및 FOS와 결합하여 동결건조되었으며, 프로바이오틱 농도는 동결건조 제품 g당 10도 CFU입니다. 신바이오틱 처리된 Sprague-Dawley 쥐(Lac) 그룹에 매일 10g의 신바이오틱을 음용수와 함께 투여했습니다. 신장을 절제하지 않은 군(Nef)과 신장을 절제하지 않은 대조군은 신바이오틱을 투여하지 않았다. 혈청 크레아티닌 및 IS(인독실 설페이트)랫트의 수준은 분석의 시작(신장절제술 후 1주) 및 종료 시 HPLC에 의해 측정되었습니다. 더욱이, 모든 그룹의 동물의 헤마토크릿을 기록하였다. 분석 종료 시 혈청 크레아티닌 수준의 변화는 유의하게 달랐습니다(p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(인독실 설페이트)신바이오틱을 투여하지 않은 신장 적출(신장 결핍) 동물에 해당하는 Nef 그룹에서만 수치가 유의하게 증가했습니다(38.8%)(p<0.05).>(인독실 설페이트)수준은 대조군에서 유의하지 않은 0.5% 증가를 보였고 Lac 그룹에서 유의하지 않은 0.8% 감소를 보였습니다(그림 2). 신장 절제된 동물 그룹을 비교했을 때 신바이오틱(Nef)을 섭취하지 않은 그룹은 IS 수치가 유의하게 더 높았습니다.(인독실 설페이트)신바이오틱(락)을 섭취한 그룹에 비해 Lac군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 크레아티닌과 IS 사이의 가능한 상관 관계를 검색하는 데이터 분석(인독실 설페이트)수준에서는 이 상관관계가 존재하지 않는 것으로 나타났습니다(보충 자료: 그림 S{0}}S3). 마지막으로, 헤마토크릿의 결과는 세 그룹 간에 유의한 차이를 보이지 않았습니다(그림 3).
그림 1. (a) 16주 신바이오틱 투여의 시작과 끝에서 Sprague-Dawley 쥐의 혈청 크레아티닌 수준. (b) 95% Tukey 동시 신뢰 구간이 있는 최종 크레아티닌 농도에 대한 평균의 차이(구간이 0을 포함하지 않는 경우 해당 평균은 상당히 다릅니다). Nef: 신바이오틱을 투여받지 않은 신장 절제된 쥐, Lac: 신바이오틱을 투여받은 신장 절제된 쥐, 대조군: 가짜 신장 절제된 쥐.
그림 2.(a) 혈청인독실 설페이트(IS) 신바이오틱의 16주 투여 시작 및 종료 시 Sprague-Dawley 쥐의 수준.(b) 최종 IS에 대한 수단의 차이(인독실 설페이트)95% Tukey 동시 신뢰 구간의 농도(구간이 0을 포함하지 않으면 해당 평균이 크게 다름). Nef: 신바이오틱을 투여받지 않은 신장 절제된 쥐, Lac: 신바이오틱을 투여받은 신장 절제된 쥐, 대조군: 가짜 신장 절제된 쥐.
2.4.조직학적 분석은 공생제 투여가 CKD의 진행을 감소시키는 것으로 나타났습니다.
실험이 끝나면 쥐를 안락사시켜 왼쪽에서 샘플을 얻었습니다.신장및 조직학적 분석을 위해 처리될 심장. 섬유증 면적은 정보 도구 Image-Pro Plus 3.0(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)를 사용하여 Masson's trichrome(MT) 염색으로 결정되어 손상된(즉, 섬유증) 면적의 백분율을 계산합니다. (표 2) 및 2광자 여기 현미경법에 의해 2광자 방출에 의해 콜라겐을 검출하는 방법으로, 콜라겐이 2차 고조파를 생성하도록 하며, 이는 공초점 현미경으로 가시화될 수 있는 특정 이미지를 조직에 가깝게 얻고 조직 내부의 콜라겐 분포. MT 염색으로 평가한 신장의 섬유증 면적을 비교할 때, 섬유증 면적은 sham-1과 비교할 때 Snbiotic 투여군에서 Nef 그룹에서 25% 더 크지만 Lac 그룹에서 12%만 더 큰 것을 관찰할 수 있었습니다. 신장 절제된 대조군 동물. 이 염색 절차로 관찰된 병변은 보우만 캡슐의 정수리 층과 Nef 및 Lac 그룹의 동물의 근위 및 원위 세뇨관의 기저막에 위치했습니다. Synbiotic을 투여하지 않은 동물을 포함한 Nef 그룹의 경우, 섬유성 조직의 발달과 함께 복잡한 세뇨관 세포의 세포질 손실이 관찰되었습니다. 신장 조직을 2광자 여기현미경으로 분석한 결과, 메쉬형 구조를 갖는 모든 시료에서 콜라겐이 관찰되었다. Nef 그룹과 Lac 그룹은 대조군보다 더 많은 병변을 보였고 섬유화 영역이 하나만 발견되었습니다(그림 4). 2광자 여기 현미경으로 관찰했을 때 어떤 샘플에서도 신장 소체에서 병변이 발견되지 않았습니다.
표 2.Masson's trichrome 염색에서 섬유증 부위의 백분율신장조직 학적 섹션. 결과는 평균에 표준 오차를 더한 값으로 표시됩니다.
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| 그림 3.synbiotic의 16주 투여 종료 시 Sprague-Dawley 쥐의 헤마토크릿 값. Nef: 신바이오틱을 투여받지 않은 신장 절제된 쥐, Lac: 신바이오틱을 투여받은 신장 절제된 쥐, 대조군: 가짜 신장 절제된 쥐. | 그림 4.Sprague-Dawley 쥐의 신장 조직학적 단면.(AC): 네프론의 Masson 삼색 염색. 섬유화 영역은 파란색으로 관찰됩니다(화살표).(DF): 2광자 여기 현미경으로 관찰된 동일한 조직. 섬유성 조직은 녹색으로 관찰됩니다. Nef: 신바이오틱을 투여받지 않은 신장 절제된 쥐, Lac: 신바이오틱을 투여받은 신장 절제된 쥐, 대조군: 가짜 신장 절제된 쥐. 눈금 막대∶ (AC) 현미경 사진의 경우 100μm, (DF) 현미경 사진의 경우 50μm. |
2.5.Synbiotic의 투여는 심장 섬유증을 약화시키지 않았다
심장에서, MT 염색은 신장 절제된 쥐의 조직에 섬유증 부위의 존재를 보여주었지만, 대조군 동물에서는 이러한 부위가 없었다. 래트에서 CKD의 유도는 신장 절제된 래트에서 신바이오틱 치료의 투여에 의해 예방되지 않은 심장 섬유증을 생성합니다(그림 5).
그림 5.Sprague-Dawley 쥐의 심장에 대한 Masson's trichrome(MT) 염색. 섬유성 영역은 파란색으로 염색됩니다(화살표). Nef: 신바이오틱을 투여받지 않은 신장 절제된 쥐, Lac: 신바이오틱을 투여받은 신장 절제된 쥐. 대조군: 가짜 신장 절제된 쥐. 스케일 바 100 um.
