3부 DsbA-L은 미토콘드리아 매개 관형 세포 사멸에서 VDAC1과 상호작용하고 급성 신장 질환의 진행에 기여합니다
Jun 14, 2023
7. PT-VDAC1-KO 생쥐의 생성
AKI에서 VDAC1의 역할을 조사하기 위해 우리는 신장의 근위 세뇨관에서 VDAC1의 녹아웃을 특징으로 하는 마우스 모델을 확립했습니다. 그림 7a는 PT-VDAC1-KO를 생성하는 데 사용되는 육종 프로토콜을 보여줍니다. RT-PCR은 PT-VDAC1-KO 마우스의 유전자형을 결정하는 데 사용되었습니다. 이것은 Cre 유전자의 416-bp DNA 단편 floxed allele과 370-bp DNA 단편을 증폭함으로써 수행되었습니다(그림 7, b; 레인 4 및 6). 야생형 마우스(PT-VDAC1-WT)에는 Cre 유전자가 없었습니다(그림 7, b, 레인 2 및 3). Immunoblot 분석은 PTVDAC1-KO 생쥐의 신장 피질에서 VDAC1의 발현 수준이 허혈 또는 모의 치료 후 PTVDAC1-WT 생쥐의 발현 수준보다 낮음을 나타냅니다(그림 7c 및 d). 이것은 VDAC1의 면역 조직 화학 염색에 의해 추가로 확인되었습니다 (그림 7e). 이 데이터는 PT-VDAC1-KO 마우스 모델을 성공적으로 설정했음을 확인했습니다.
그림 7. PT-VDAC1-KO 마우스 모델의 생성 및 특성. (a, b) PTVDAC1-KO 생쥐의 생성을 위한 육종 프로토콜과 VDAC1 및 PEPCK-Cre 대립유전자의 야생형 및 플록스 대립유전자의 유전자형 PCR 검출. (c) IR 손상 후 PT-VDAC1-KO 및 PT-VDAC1-WT 한배 새끼 마우스의 신장 피질 조직을 사용한 VDAC1 및 b-tubulin의 면역블롯 분석. (d) 그들 사이의 그레이 스케일 이미지 분석. ( e ) IR 손상 후 야생형 및 VDAC1 마우스의 신장 피질 조직에서 VDAC1의 면역 조직 화학 염색. 원본 배율 x 400. Scar Bar:100µM. 각 실험(c & e)은 비슷한 결과를 얻기 위해 독립적으로 6번 반복되었습니다. 단방향 ANOVA는 다중 그룹 비교(d)에 사용되었습니다. # 피<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.
8. PTVDAC1-KO 생쥐에서 I/R 유발 신장 손상, 관형 세포 사멸 및 미토콘드리아 손상이 개선됨
PT-VDAC1-WT 및 PT-VDAC1-KO 생쥐의 한 배 새끼는 허혈(28분) 후 재관류 손상(48시간)으로 치료했습니다. 그런 다음 추가 검사를 위해 혈액 샘플과 신장 조직을 수집했습니다. 우리는 PT-VDAC1-KO가 BUN 및 크레아티닌 수준에서 I/R 유발 상승을 현저하게 억제한다는 것을 발견했습니다(그림 8a 및 b). 둘째, 조직학적 및 TUNEL 분석은 PT-VDAC1-KO가 I/R 유발 조직 손상 및 신장 세포 사멸을 현저하게 약화시킨다는 것을 추가로 입증했습니다(그림 8c, d, f 및 g). 세 번째로, EM 분석은 PT-VDAC1-KO가 I/R 유발 미토콘드리아 손상을 상당히 약화시킨다는 것을 발견했습니다(그림 8e 및 h). 마지막으로, 면역블롯팅은 PT-VDAC1-KO 생쥐가 절단된 카스파제-3의 감소된 수준, 미토콘드리아에서 Bax 축적 감소, 세포질로의 Cyt-c 방출 속도 감소를 보였다는 것을 확인했습니다(그림 8 I-o). 이 데이터는 VDAC1이 I/R 유발 AKI도 중재함을 나타냅니다.
그림 8. PT-VDAC1-KO 생쥐에서 IR 유발 신장 손상, 관상 세포 세포 사멸, 미토콘드리아 손상, Bax, Cyt-c 및 절단된 caspase3 발현의 약화. PT-VDAC1-KO 및 PT-VDAC1-WT 한배새끼 마우스의 양쪽 신장 동맥을 28분 동안 고정한 다음 48시간 동안 풀어 IR 모델을 확립했습니다. (a) 번. (b) 혈청 크레아티닌. (c) 헤마톡실린 및 에오신 염색. (d) TUNEL 양성 세포의 대표 섹션. (e) 미토콘드리아 형태의 전자 현미경 검출. (f) 관형 손상 점수. (g) TUNEL 양성 세포의 수. (h) 미토콘드리아 손상 점수. (i) 면역블롯은 절단된 caspase3, VDAC1 및 DsbA-L의 발현뿐만 아니라 미토콘드리아 및 세포질 분획에서 BAX 및 Cyt-c의 발현을 분석합니다. b-튜불린 및 GAPDH는 각각 전체 용해물 또는 세포질 로딩 대조군으로 사용되었습니다. COX IV는 미토콘드리아 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (j-p) 그들 사이의 그레이스케일 이미지 분석. 원본 배율 x 400. Scar Bar: c 및 d에서 100µM e에서 20µM. 각 실험(c-e&i)은 유사한 결과를 얻기 위해 독립적으로 6번 반복되었다. 단방향 ANOVA는 다중 그룹 비교(a, b, f-h&j-p)에 사용되었습니다. # 피<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.
Cistanche tubulosa
9. PT-VDAC1-KO 마우스에서 DsbA-L 악화 I/R 유발 신장 손상의 과발현이 약화됨
허혈성 손상 동안 DsbA-L의. IR의 마우스 모델이 확립되기 1주일 전에 각 마우스의 꼬리 정맥에 DsbA-L 플라스미드를 주입했습니다(주입은 이번 주 동안 두 번 수행됨). DsbA-L의 과발현은 BUN 및 크레아티닌 발현의 IR-유도 상승, 신장 손상 및 신장 세포사멸을 악화시켰고; 이러한 효과는 PTVDAC1-KO 마우스에서 약화되었습니다(그림 9a-d, e 및 f). Immunoblot 결과는 DsbA-L의 과발현이 분열된 caspase-3의 IR 유도 증가, 미토콘드리아에서 Bax의 축적, Cyt-c의 세포질로의 방출을 강화했음을 추가로 나타냈습니다. 이러한 효과는 PT-VDAC1-KO 마우스에서 감소했습니다(그림 9g 및 h-1). 총체적으로, 이러한 결과는 VDAC1이 허혈성 손상 동안 DsbA-L의 효과를 매개한다는 것을 추가로 입증했습니다.
그림 9. PT-VDAC1-KO 마우스에서 DsbA-L 악화 I/R 유발 신장 손상의 과발현이 약화되었습니다. PT-VDAC1-KO 및 PT-DsbA-L-WT 마우스를 DsbA-L 플라스미드 유무에 관계없이 처리한 다음 IR 모델을 확립했습니다. (a) 분. (b) 혈청 크레아티닌. (c) 헤마톡실린 및 에오신 염색. (d) TUNEL 양성 세포의 대표 섹션. (e) 관형 손상 점수. (f) TUNEL 양성 세포의 수. (g) 면역블롯은 절단된 caspase3, VDAC1 및 DsbA-L의 발현뿐만 아니라 미토콘드리아 및 세포질 분획에서 BAX 및 Cyt-c의 발현을 분석했습니다. b-튜불린 및 GAPDH는 각각 전체 용해물 또는 세포질 로딩 대조군으로 사용되었습니다. COX IV는 미토콘드리아 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (h-n) 그들 사이의 그레이스케일 이미지 분석. 원래 배율 x 400. Scar Bar:100mM. 각 실험(c-e)은 유사한 결과를 얻기 위해 독립적으로 6번 반복되었다. 단방향 ANOVA는 다중 그룹 비교(a, b 및 f-n)에 사용되었습니다. # 피<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.
Cistanche 보충 교재
10. PTDsbA-L-KO 생쥐에서 I/R로 유발된 신장 손상의 약화는 VDAC1의 과발현에 의해 감소되었습니다.
DsbA-L 매개 세뇨관 손상이 VDAC1에 의존하는지 추가로 확인하기 위해, PTDsbA-L -WT 및 PT-DsbA-L -KO 마우스의 한배 새끼 마우스를 먼저 I/R 처리에 노출시킨 다음 꼬리 정맥을 통해 주사했습니다. VDAC1 과발현 플라스미드로. BUN 및 크레아티닌 수치의 I/R 유도 증가는 PT-DsbA-L-KO 마우스에서 개선되었습니다. 그러나이 효과는 VDAC1의 과발현에 의해 방지되었습니다 (그림 10a 및 b). HE 및 TUNEL 염색은 PT-DsbAL-KO 마우스에서 IR-유도된 신장 조직 손상 및 신장 세포 아폽토시스의 상대적 정도가 감소되었고 이러한 효과가 VDAC1의 과발현에 의해 차단되었음을 보여주었다(도 10c-f). Immunoblotting은 PT-DsbA-L-KO 생쥐가 더 낮은 수준의 절단된 caspase-3, 미토콘드리아에서 더 낮은 수준의 Bax 축적 및 세포질로의 더 낮은 Cyt-c 방출 속도를 가짐을 보여주었습니다. 그러나 이러한 효과는 VDAC1의 과발현에 의해 제거되었습니다(그림 10g-m). 이러한 데이터는 DsbA-L이 VDAC1에 의존하는 방식으로 허혈성 손상을 촉진한다는 사실을 뒷받침합니다.
그림 10. PT-DsbA-L-KO 개선된 IR 유도 마우스 신장 손상은 VDAC1의 과발현에 의해 감소되었습니다. PT-DsbA-L-KO 및 PT-DsbA-L-WT 마우스를 VDAC1 플라스미드로 처리하거나 처리하지 않고 처리한 다음 IR 모델을 확립했습니다. (a) 번. (b) 혈청 크레아티닌. (c) 헤마톡실린 및 에오신 염색. (d) TUNEL 양성 세포의 대표 섹션. (e) 관형 손상 점수. (f) TUNEL 양성 세포의 수. (g) 면역블롯은 절단된 caspase3, VDAC1 및 DsbA-L의 발현뿐만 아니라 미토콘드리아 및 세포질 분획에서 BAX 및 Cyt-c의 발현을 분석했습니다. b-튜불린 및 GAPDH는 각각 전체 용해물 또는 세포질 로딩 대조군으로 사용되었습니다. COX IV는 미토콘드리아 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (hm) 그들 사이의 그레이 스케일 이미지 분석. 원래 배율 x 400. Scar Bar:100mM. 각 실험(c, d, g)은 독립적으로 6번 반복하여 유사한 결과를 얻었다. 단방향 ANOVA는 다중 그룹 비교(a, b, e, f 및 h-m)에 사용되었습니다. # 피<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.
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11. PT-DsbA-LKO 또는 PT-VDAC1-KO 생쥐에서 CLP 유발 신장 손상이 약화됨
패혈증 유발 AKI는 임상 실습에서 AKI의 또 다른 일반적인 원인입니다. PT-DsbA-L 또는 VDAC-WT 및 PT-DsbA-L 또는 VDAC1-KO의 한배새끼는 CLP 모델에 노출된 후 수술 후 18시간에 안락사되었습니다. 결과는 PT-DsbA-L 또는 VDAC1- KO 생쥐가 BUN 및 크레아티닌 수치의 CLP 유발 상승과 신장 조직 손상 및 신장 세포 사멸의 증가 수준을 현저하게 감소시켰음을 나타냅니다(그림 S1 및 S2 a-f). ). Immunoblotting은 PTDsbA-L 또는 VDAC1-KO 생쥐가 또한 절단된 caspase-3 수준 감소, 미토콘드리아 내 Bax 축적 수준 감소, 세포질로의 Cyt-c 방출 속도 감소를 보였다는 것을 확인했습니다(그림 S1 및 S2 g-n). 종합적으로, 이 데이터는 DsbA-L과 VDAC1이 모두 패혈성 AKI의 진행을 매개한다는 것을 보여주었습니다.
12. VAN 유발 신장 손상은 PT-DsbAL-KO 또는 PT-VDAC1-KO 생쥐에서 약화되었습니다.
Vancomycin(VAN)에 의해 유발된 AKI도 AKI의 중요한 모델입니다. PT-DsbA-L 또는 VDAC1-WT 및 PT-DsbA-L 또는 VDAC1-KO의 한배새끼에게 연속 7일 동안 VAN(600mg/kg)을 복강내 주사했습니다. 결과는 PT-DsbA-L 또는 VDAC1-KO 마우스가 VAN에 의해 유발된 BUN 및 크레아티닌 수치의 상승, 신장 조직 손상 및 신장 세포 사멸을 현저하게 감소시켰음을 나타냅니다(그림 S3 및 S4 an-f). Immunoblot 분석은 PTDsbA-L 또는 VDAC1-KO 생쥐가 절단된 caspase-3의 감소 수준, 미토콘드리아에서 Bax 축적 정도 감소, 세포질(그림 S3 및 S4 g-m). 요약하면, 이 데이터는 DsbA-L과 VDAC1이 모두 VAN 유발 AKI를 매개한다는 것을 보여주었습니다.
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13. DsbA-L 매개 I/R 유도 HK-2 세포 사멸은 VDAC1과 관련이 있었다
상기 결과는 DsbA-L이 BUMPT 세포의 아폽토시스에 관여한다는 것을 밝혔지만, 인간 신세뇨관 세포에서 DsbA의 기능은 여전히 불분명하다. DsbA-L siRNA를 HK2 세포에 형질감염시킨 다음 2시간 동안 ATP 고갈에 노출시키고 2시간 동안 회복시켰다. Immunoblot 결과는 DsbA-L siRNA가 I/R에 의해 유도된 cleaved caspase-3 및 VDAC1 발현 증가, 미토콘드리아 내 Bax 축적 증가, 세포질 내 Cyt-c 생산 증가를 현저하게 개선했음을 보여주었습니다. 그림 S5 및 h). 데이터는 또한 HK2 세포 아폽토시스에서 DsbA-L의 역할이 I/R 처리 동안 VDAC1과 관련이 있음을 시사했습니다.
14. DsbA-L 매개 I/R 유도 HK-2 세포 아폽토시스는 VDAC1에 의존적이다
HK2 세포 사멸에서 DsbA-L의 역할이 VDAC1에 의존하는지 여부를 추가로 확인합니다. 먼저, HK2 세포를 VDAC1 플라스미드 유무에 관계없이 DsbA-L siRNA 플러스로 공동 형질감염시킨 다음 2시간 동안 ATP 고갈 및 2시간 동안 회복에 노출시켰다. Immunoblot 결과는 DsbA-L siRNA가 I/R에 의해 유도된 cleaved caspase-3 및 VDAC1 발현 증가, 미토콘드리아 내 Bax 축적 증가, 세포질 내 Cyt-c 생성 증가를 현저하게 약화시켰음을 나타냅니다. 이 효과는 VDAC1 플라스미드의 과발현에 의해 반전되었습니다(그림 S6a-h). 둘째, HK2 세포는 DsbA-L 플라스미드 유무에 관계없이 VDAC1 siRNA 플러스로 공동 형질감염된 다음 I(2h)/R(2h)에 노출되었습니다. 면역블롯 결과는 VDAC1 siRNA가 절단된 카스파제-3 및 VDAC1 발현의 I/R 유도 증가, 미토콘드리아에서 Bax 축적 증가, 세포질로의 Cyt-c 생성 증가를 현저하게 개선한 것으로 나타났습니다. DsbA-L 플라스미드의 과발현에 의해 강화되지 않았다(도 S7a-h). 데이터는 VDAC1이 I/R 처리 동안 HK-2 세포에서 DsbA-L의 pro-apoptosis 역할을 매개한다는 것을 명확하게 확인했습니다.
Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h 및 Dongshan Zhang a,b *
중화인민공화국 응급의학과
b 중화인민공화국 후난성 창사 중남대학교 제2향야병원 응급의학 및 난치병연구소
c 중화인민공화국 안과
d 중화인민공화국 비뇨기과
e 중화인민공화국 흉부외과
f 중화인민공화국 제2향야병원 일반외과
g 중화인민공화국 후난성 창사 중남대학교 보건학과
h 중화인민공화국 심천 남부과학기술대학교 제1부속병원 지난대학교 제2임상의과대학 심천인민병원 내분비과
1 Xiaozhou Li와 Jian Pan은 이 연구에 동등하게 기여했습니다.
