2부 에키나코사이드는 DNA 산화 손상을 어떻게 치료하고 세포 사멸을 억제합니까?

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3. 실험적 부분

3.1. 세포와 화학

인간 결장직장 선암종 SW480 세포주는 ATCC에서 구입했습니다. 세포는 10% 소태아혈청(FBS)(Gibco)과 1%(Gibco)를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양되었습니다.v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37도.에키나코사이드중국 상하이의 Yuanye Biotechnology에서 구입했습니다(HPLC > 98%). 스톡 용액은 DMSO(Sigma-Aldrich)에서 준비하고 작업 용액은 세포 배양 배지에서 준비했습니다.

3.2. MTT 생존력 분석

세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1 × 104개 세포로 12시간 동안 시딩한 다음에키나코사이드또는 24시간 또는 48시간 동안 0.01% DMSO. 결국, 20μL의 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,{10}}디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 용액(5 mg/ PBS, pH 7.2 중 mL(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 인큐베이션했습니다. MTT를 포함하는 배지를 제거한 후, 150 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 10분 동안 인큐베이션하고 BioRad 680 마이크로플레이트 판독기(Hercules, CA, USA)로 570 nm에서의 흡광도를 측정했습니다. 각 실험은 3회씩 두 번 수행되었습니다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석되었습니다.

3.3. 콜로니 형성 분석

세포를 6-웰 플레이트에 웰당 1 × 104의 밀도로 12시간 동안 시딩한 다음에키나코사이드또는 10일 동안 {{0}.01% DMSO. 플레이트를 PBS로 세척하고 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올로 고정하고 크리스탈 바이올렛 용액(Sigma-Aldrich)(25% 메탄올 중 0.5%)으로 염색했습니다. 플레이트를 밤새 건조시킨 후 이미지를 촬영했습니다. 크리스탈 바이올렛 결정을 70% 에탄올에 용해하고 595 nm에서의 흡광도를 BioRad 마이크로플레이트 판독기로 측정했습니다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.

3.4. DAPI 형광을 이용한 DNA 단편화 분석 더럽히는 것

약물 처리 후 {{0}웰 플레이트의 세포를 PBS로 1회 세척하고 PBS 중 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)(Sigma-Aldrich)에 20분 동안 고정한 다음 4로 염색했습니다. ,6-디아미디노-2- 페닐린돌(DAPI)(Sigma-Aldrich)(0.2 ug/mL)을 실온에서 10분 동안 처리합니다. PBS로 세척한 후, 세포를 VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 밀봉하였다. 핵 형태는 Olympus 형광 현미경으로 촬영되었습니다.

cistanche의 Echinacoside는 면역 체계를 강화할 수 있습니다

3.5. 세포주기 분석

세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1 × 104개 세포로 12시간 동안 시딩한 다음에키나코사이드또는 {{0}}.{11}}24시간 동안 DMSO 1%. 마지막으로 트립신(Invitrogen)으로 세포를 회수하고 PBS로 2회 세척한 후 -20도에서 2시간 동안 얼음처럼 차가운 에탄올(70%)로 고정하였다. 고정된 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 0.1% Triton X{10}}, 0.2mg/mL DNase-free RNase A(Sigma), 10ug/mL 요오드화 프로피듐(PI)이 포함된 300μL의 새로 준비된 PBS에 재현탁했습니다. (미국 인디애나주 인디애나폴리스 로슈). 암소에서 37도에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 나일론 메쉬(Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 통해 여과하고 FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences)에 로딩했습니다. 데이터는 ModFit 소프트웨어(Topsham, ME, USA)를 사용하여 분석되었습니다.

3.6. 아폽토시스 분석

세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1 × 104개 세포로 12시간 동안 시딩한 다음에키나코사이드또는 24시간 동안 0.01% DMSO. 결국 제조사의 지시에 따라 Annexin V-FITC Apoptosis detection kit(Best, Shanghai, China)를 사용하여 세포를 검사하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 결합 완충액에 재현탁시켰다. Annexin V-FITC 및 Propidium Iodide (PI) (Roche) 각각 5 μL를 순차적으로 첨가하고 세포를 암실 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences)에 로딩했습니다. 데이터는 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석되었습니다.

3.7. 면역형광염색 53BP1

SW480 세포는 24-웰 ​​플레이트의 둥근 커버슬립에 시딩되었습니다. 로 치료 후에키나코사이드또는 {0}}.01% DMSO, 24시간, 세포를 4% PFA로 20분 동안 고정하고 실온에서 1시간 동안 15% FBS(0.1% Triton X-100)로 차단 온도. 고정된 세포를 블로킹 용액에 1:1000으로 희석한 토끼 항 BP1 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)로 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 Cy conjugated로 염색했습니다. 염소 항 토끼 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)는 실온에서 1시간 동안 차단 완충액에 1:500으로 희석되었습니다. PBS에서 3 x 5분 동안 세척한 후 커버슬립을 DAPI가 포함된 VECTASHIELD 장착 배지의 유리 슬라이드에 밀봉했습니다. 이미지는 Zeiss LCM 510 공초점 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 촬영했습니다.

3.8. 8-oxoG 통합 분석

세포내 8-oxoG는 Alexa 488-접합 아비딘(Invitrogen)으로 염색하여 측정했습니다[25]. 세포를 12-웰 플레이트의 둥근 커버슬립에 접종했습니다. 로 치료 후에키나코사이드또는 {{0}}.{11}}24시간 동안 1% DMSO, 세포를 얼음처럼 차가운 메탄올로 2{17}}분 동안 고정한 후 트리스 완충 식염수(TBS)에서 배양 (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)로 15분 동안 샘플을 실온에서 1시간 동안 0.1% Triton X{13}} 및 15% FBS가 포함된 TBS에서 차단한 다음 차단 용액에서 Alexa 488-접합 아비딘(0.5ug/mL)으로 1시간 동안 염색했습니다. 37도에서 . PBS에서 3 x 5분 동안 세척한 후 커버슬립을 VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories)의 유리 슬라이드에 밀봉했습니다. Zeiss LCM 510 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하고 분석했습니다.

3.9. 웨스턴 블롯 분석

{{0}}웰 플레이트에서 성장하고 처리한 세포를 RIPA 완충액(150mM NaCl, 1.{7}}% IGEAL CA-630, {{12 }}.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 및 50mM Tris, 1mM PMSF, pH 8.0)(Sigma). 총 단백질 농도는 제조업체의 지침에 따라 BCA 키트(Dingguo, Changchun, China)로 측정했습니다. 샘플을 95도에서 10분 동안 변성시키고 4~12% SDS-PAGE 젤에서 분리한 다음 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼습니다. 막은 TBST의 5% 무지방 우유에서 2시간 동안 차단되었고 1차 항체(Bcl-2, sc{22}}, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Bax, Santa Cruz)와 함께 배양되었습니다. , sc-493; to c, Santa Cruz, sc{24}}; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, USA; caspase 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs{29}} R; 53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) 4도에서 밤새. PBS로 세척한 후, 막을 HRP-컨쥬게이션된 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 배양하고 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 키트(Transgen Biotech, Changchun, China)로 시각화했습니다. Imager(Tanon, Shanghai, China)에서 사진을 캡처하고 분석했습니다.

3.10. 세포 측정 로스

세포 내 ROS는 세포 기반 ROS 분석 키트(Beyotime Biotechnology, Haimen, China; S0033)를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정되었습니다. 끝에에키나코사이드처리 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 37도에서 30분 동안 10μM 디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 트립신 처리하고 FACSCaliber 유세포 분석기(BD Biosciences)로 분석했습니다. 세포 내 ROS 수준은 세포의 평균 DCF 형광 강도로 표현되었습니다.

3.11. 미토콘드리아 막 측정 잠재적인

제조업체의 지침에 따라 JC{0}} 염료(Beyotime Biotechnology, C2006)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 측정했습니다. 제어 및에키나코사이드-처리된 세포를 JC{1}}와 함께 20분 동안 배양한 후 Olympus 형광 현미경으로 검사했습니다.

3.12. 통계 분석

GraphPad Prism Software를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 계산되었으며p < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

에키나코사이드안에시스탄체: 신경보호효과

4. 결론

이 연구에서 우리는에키나코사이드다양한 인간 암 세포주에서 놀랍게도 우리는

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인간 SK-HEP{1}} 간암, MCF{2}} 유방암 및 SW480 결장직장암 세포의 증식을 억제했습니다. 추가 분석은 Echinacoside가 G1 단계에서 SW480 세포를 정지시키고 미토콘드리아 관련 고유 세포자멸 경로를 활성화함으로써 카스파제 의존성 세포자멸사를 유도한다는 것을 발견했습니다. 세포 주기 정지는 G1/S-CDK 차단제 및 DNA 합성 억제제 CDKN1B(p21)의 상향 조절과 관련이 있었고, 세포 사멸은 항-세포사멸 단백질 Bcl{13}}의 하향 조절 및 세포사멸 촉진 Bax의 상향 조절과 관련이 있었습니다. 뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위의 손실. 세포 내 산화된 형태의 구아닌인 8-oxoG의 상당한 증가는 dNTP 및/또는 DNA 분자의 산화가 증가했음을 시사하며, 이는 SW480 암세포에서 세포 주기 정지 및 세포자멸사를 유발할 수 있습니다. 기본 메커니즘에키나코사이드산화 손상 및 세포 사멸에 대한 의 효과는 특성화되어야 하지만 이러한 결과는 Echinacoside를 항암 약물 개발을 위한 새로운 화학적 스캐폴드로 지지합니다.

감사의 말

이 연구는 길림성의 보조금(보조금 번호: 20130101120JC)과 길림 대학의 연구 기금(프로젝트 번호: 450091099029)의 지원을 받았습니다.

저자 기여

Liwei Dong은 대부분의 실험 작업을 수행하고 데이터를 분석하고 원고를 작성했습니다. Debin Yu와 Nuoting Wu는 MTT 및 집락 형성 분석을 수행했습니다. Hongge Wang과 Jiajing Niu는 면역염색과 Western blot 실험을 했습니다. Ye Wang은 세포 주기와 세포자멸사 실험을 도왔습니다. Zhihua Zou는 개념을 개발하고 데이터를 분석하고 이 연구의 구현과 원고 작성을 감독했습니다. 모든 저자는 제출된 원고를 승인했습니다.

이해 상충

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

에키나코사이드안에시스탄체~할 수 있다항염증

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