1부: 말기 신장 질환 환자에서 순환 내피 전구 세포의 재생 가능성을 향상시키는 새로운 접근법

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추상적인: 순환하는 골수유래 내피전구세포(EPC)는 신장을 비롯한 여러 장기의 혈관수복을 촉진하지만 말기에는 점차 감소신장병(ESKD) 환자, 이는 심혈관 결과 및 관련 사망률과 상관관계가 있습니다. 따라서 우리는 재조합 인간 릴랙신(RLX)의 혈관 형성 효과로 인간 골수 유래 중간엽 간질 세포(BM-MSC)의 조직 회복 효과를 강화하면 EPC 증식과 기능을 촉진할 수 있는지 확인했습니다. CD34 + EPC를 건강한 ESKD 환자의 혈액에서 분리하고 후기 EPC가 형성될 때까지 배양한 다음 BM-MSC 유래 조건 배지(CM;25% o), RLX(1 또는 10ng/mL) 또는 둘 모두로 자극했습니다. 결합된 치료. RLX 단독으로 시험관 내에서 EPC 증식, 모세관 형성 및 상처 치유를 자극한 반면, 이러한 측정은 건강한 환자와 ESKD 환자 모두에서 유래한 EPC에서 BM-MSC 유래 CM 및 RLX의 결합 효과에 의해 더욱 빠르고 현저하게 향상되었습니다. 이러한 발견은 ESKD 환자에서 EPC 수와 기능을 회복하고 향상시킬 수 있는 새로운 조합 요법을 확인함으로써 중요한 임상적 의미를 갖습니다.

키워드: 내피 전구 세포; 말기 신장 질환; 골수유래 간엽줄기세포; 릴렉신; 상처 치유; 혈관신생; 재건

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1. 소개

만성 신장 질환(CKD)는 사구체 여과율(GFR)의 감소로 정의되는 60mL/min/1.73m² 이하로 정의되는 세계적인 건강 문제로, 종종 말기(V기) 신장 질환(ESKD, 다음과 같이 정의됨)으로 이어집니다. GFR 15mL/min/1.73m2 이하[2]. CKD의 병리학적 특징은 신장 모세혈관 및 족세포의 감소, 신장 내피 세포의 파괴 및 신장의 발달과 관련된 세뇨관 위축을 포함합니다.신장 섬유증[3,4]. 이 과정에서 신장 내피가 손상되어 혈관 신생 및 신장 기능이 손상됩니다[5]. 수행원신장 손상, 골수 유래 내피 전구 세포(EPC)는 조직 복구를 촉진하기 위해 손상 부위에 모집됩니다[6]. EPC는 신장 내피 세포의 성숙 및 증식, 혈관 완전성, 손상된 내피 복구에 중추적인 역할을 합니다. 그러나 순환 EPC 수는 ESKD 환자[7-9]에서 점진적으로 감소하며, 이는 유해한 심혈관 결과[9,10] 및 장기 사망률과 상관관계가 있습니다.

중간엽 기질 세포(MSC)는 EPC 프로그래밍을 자극하여 혈관신생을 촉진하는 것으로 보고되었습니다. 그러나 MSC는 다양한 임상 시험에서 평가되었지만[13], 신장 내피 재생을 촉진하는 능력은 조사되지 않았습니다. 우리 연구실의 최근 연구에서 인간 골수(BM) 유래 MSC를 항섬유화제, 즉 재조합 인간(유전자{3}}) 릴랙신(serelaxin; RLX[14)과 결합하여 개선된 치료 가능성을 확인했습니다. 신장 손상,염증및 질병의 전임상 모델에서의 섬유증. RLX 단독으로 시험관 내에서 인간 혈액 유래 EPC 증식 및 산화질소(NO) 생산을 자극할 수 있지만 생체 내에서 생쥐의 혈관 형성을 자극할 수 있지만[18], BM-MSC와의 조합 효과가 EPC- 유도된 혈관신생 및 상처 치유. 따라서 이 연구는 건강한 대 ESKD 환자 유래 EPC 증식, 혈관신생 및 상처 치유에 대해 RLX와 BM-MSC 유래 조건 배지(CM)를 결합하는 치료 가능성을 평가했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1.말초혈액에서 EPC 분리 및 배양

서명된 환자 동의서를 받은 후 건강한 남성 대조군에서 약 {{0}} mL의 혈액을 호주 적십자 혈액 서비스(Australian Red Cross Blood Service)에서 수집했습니다. 대조적으로, 남성 ESKD 환자의 혈액은 건강 상태로 인해 Monash Medical Center에서 최대 5mL만 채취되었습니다. 모든 혈액 샘플은 수집 시간 24시간 이내에 처리되었습니다. 모든 혈액 샘플을 1X ​​Hank's 균형 염 용액(HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 총 부피 2{18}}mL로 희석했습니다. 그런 다음 혈액을 15 mL의 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 조심스럽게 5{20}} ml Falcon tube(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 넣고 400x에서 원심분리했습니다. g 상온에서 40분 동안 가열하여 이전에 설명한 밀도 구배 분리 방법을 사용하여 다른 성분으로부터 버피 코트를 분리합니다[19,20]. 구배 분리 후, 혈장 및 혈소판을 포함하는 상층은 혈청학적 피펫을 조심스럽게 삽입하여 제거하고, 내피 전구 세포(EPC)로 구성된 말초 혈액(PBMC)의 단핵 세포를 포함하는 버피 코트는 방해받지 않고 남겨둡니다. 펠렛을 2ml의 내피 세포 성장 배지(EGM){13}} 미세혈관(MV) 총알 키트(제품 #CC{14}}, Lonza, Hayward, CA, USA)에 재현탁했습니다. 소태아혈청(FBS) 5%, 히드로코르티손 0.04%, 인간 섬유아세포 성장인자(hFGF) 0.4%, 혈관 내피 성장인자(VEGF) 0.1%, 인슐린 유사 성장인자(IGF)로 보충 )-1, 아스코르브산, 인간 표피 성장 인자(hEGF) 및 겐타마이신 설페이트/암포테리신(GA-1000)을 사용하여 분리된 EPC를 배양합니다. 세포를 피브로넥틴 코팅된 배양 플레이트/플라스크에 접종하기 전에 CountessM Automated Cell Counter(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 세포를 계수했습니다.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50개 세포/콜로니)에서 콜로니 형성 단위(CFU) 분석을 사용합니다.

2.2. 배양된 BM-MSC에서 조건 배지(CM)의 준비

EPC 배양에 BM-MSC를 추가하면 측정할 EPC 관련 종점을 손상시킬 수 있으므로 이전에 분석에 사용된 바와 같이 EPC 기능에 대한 BM-MSC 유래 CM의 영향을 분석하는 것이 더 나을 것이라고 결정했습니다. 다른 끝점의 [19]. 간단히 말해서, BM-MSC는 16%의 태아 소 혈청(FBS)과 1%의 2{18}}0mM이 보충된 Alpha-Minimum Essential Media(-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia)에서 성장했습니다. L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신. 세포가 ~80% confluency에 도달하면 BM-MSC를 추가로 계대 배양하고 웰당 ~0.5x10도의 밀도로 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 24-48시간 동안 배양 상태를 유지했습니다. 세포 부착을 보장합니다. BM-MSC에서 조정 배지(CM)를 준비하기 위해 미리 예열된 1mL의 1X HBSS로 세포를 간단히 3회 세척했습니다. 세척 단계 후, 500μL의 혈청 및 성장 인자가 없는 내피 세포 기저 배지(EBM; 제품 #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA)를 세포에 첨가하고 추가 24시간 동안 5% CO, 37도에서 배양을 유지했습니다. 이 인큐베이션 기간이 끝나면 CM을 수집하고 10분 동안 400xg에서 원심분리하여 세포 파편을 제거했습니다. 500 μL 분취량의 CM은 나중에 사용할 때까지 -80도에서 보관되었습니다.

2.3. 기능 분석

2.3.1. 배양된 후기 EPC의 치료

후기 EPC가 수확되면 기능 분석이 수행되었습니다. 모든 실험은 3-6 구절에서 수행되었습니다. (i) 25% BM-MSC 유래 조절 배지(25% CM)[20], (ii)1 [RLX-1] 또는 10 [RLX-10의 효과를 조사하기 위해 기능 분석을 수행했습니다. ]ng/mL [18] RLX(임산부에서 발견되는 H2 릴렉신의 순환 수준을 나타냄[21]); 또는(i) 25% CM 및 1 또는 10ng/mL RLX의 조합된 효과;(iv) 20% FBS가 대조군 환자로부터 유래된 후기 EPC의 증식 및 관 형성(혈관형성) 잠재력에 대한 양성 대조군으로 사용되었습니다. . 처리군을 미처리 세포와 비교하였다.

2.3.2.생존 및 증식 분석

후기 EPC의 생존 가능성과 증식 가능성은 {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-를 사용하여 결정되었습니다. 제조업체의 지침(Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia)에 따라 디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석. 간단히 말해서, 웰당 ~5×103개의 세포를 96-웰 플레이트(BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia)에 파종한 다음, 세포를 BM-MSC 유래 CM, RLX(10ng/ mL), 또는 24시간 동안 CM과 RLXat 1 또는 10ng/mL의 조합. 인큐베이션 기간이 끝나면 10μL의 MTT 표지 시약(0.5mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia)을 첨가하고 37도 Cand 5% CO2에서 추가로 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포는 100 μL의 가용화 용액(Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia)을 첨가하여 가용화되었고 후기 EPC의 증식 가능성은 Micro-plate를 사용하여 590 nm에서 각 샘플의 흡광도를 측정하여 결정되었습니다. 리더(Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australia) 및 Windows OS용 SoftMax Pro 소프트웨어(Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA)로 분석했습니다. 각 처리 그룹은 6회 반복하여 수행 및 분석되었습니다.

2.3.3. 관 형성 분석

튜브 형성 분석을 사용하여 후기 EPC의 혈관신생 잠재력을 촉진하기 위한 다양한 처리의 효과는 μ-혈관신생 분석(Abidi, Fitchburg, WI, USA)을 사용하여 결정되었습니다. 간단히 말해서, 10 μL의 성장 인자 감소(GFR) Matrigel(제품 #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA)이 혈관신생 분석 키트(Abidi, Fitchburg, WI, USA)의 μ-Slide 내부 웰에 추가되었습니다. ). 후기 EPC의 융합 배양물을 코팅된 세포에 파종하고 BM-MSC 유래 CM, RLX(10ng/mL) 또는 10ng/mL에서 CM과 RLX의 조합으로 처리했습니다. ~1 x 104개 세포를 포함하는 총 50μL의 세포 현탁액을 각 웰에 적용했습니다. 이미지가 즉시 캡처되고 0-시간 시점으로 레이블이 지정되었습니다. 다양한 치료를 받는 세포의 능력

형태 튜브를 관찰하고 광학 현미경을 사용하여 세포 접종 후 2-24시간에 이미지를 캡처했습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 튜브 수, 튜브 길이 및 분기점 수를 결정했습니다.

2.3.4.상처 치유 분석

후기 EPC의 재생 가능성에 대한 다양한 치료의 효과는 상처 치유 분석을 사용하여 결정되었습니다. 분석을 수행하기 위해 ~ 1 × 10 세포를 50 μL 성장 배지에 현탁시키고 상처 치유 분석을 위해 35 mm 접시의 2 웰 실리콘에 시딩했습니다 (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). 멸균 핀셋을 사용하여 실리콘 웰을 부드럽게 제거하여 접시 안의 인공 상처를 만들었습니다(gap distance=500±100μm). 접시에 2mL 50% EGM{11}}을 보충하고 다양한 BM-MSC 유래 CM, RLX(10ng/mL) 또는 1 또는 10ng/mL의 CM과 RLX 조합을 포함한 치료 상처를 닫기 위해 이동한 세포의 수는 광학 현미경을 사용하여 평가되었습니다. 마이그레이션된 세포는 처리 후 0-24시간에 캡처되었습니다. 간격 폐쇄 영역의 백분율은 Image] 소프트웨어를 사용하여 결정되었습니다.

2.3.5.이미지 분석

기능 분석에 대한 모든 이미지 분석은 MacOS용 ImageJ(Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 후기 EPC의 관 형성 가능성에 대해, 혈관신생 분석 플러그인을 사용하여 이미지를 분석하고 총 길이, 메쉬 수, 접합 수 및 분기 수를 포함하는 4가지 다른 매개변수를 기록했습니다. 상처 치유 분석을 위해 각 시점에서 무세포 영역을 수동으로 표시하여 상처 봉합 영역을 분석했습니다. 모든 측정은 변동을 제어하기 위해 3회 이상 수행되었습니다.

2.3.6. 면역형광

릴랙신 패밀리 펩티드 수용체 1(RXFP1; 동족 RLX 수용체) 단백질 위치는 배양된 후기 EPC에서 면역형광 염색을 사용하여 결정되었습니다. 먼저, 12-웰 플레이트의 13mm 유리 커버슬립(폴리-D-라이신 코팅)에서 성장한 ~1×1{{2{29}}}}도 세포를 4% PFA에 고정했습니다. 실온에서 15분. 고정된 세포는 실온에서 60분 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 비특이적 단백질 결합에 대해 차단되었습니다. 배양 기간이 끝나면 세포를 PBS에서 5분 동안 세척하고(3회) 토끼 다클론성 RXFP1 항체(aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Germany ) 4도에서 밤새 0.01% BSA에서. 세포를 PBS로 세척하고 염소-항-토끼 Alexa-fluor 594 2차 항체(1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia)와 함께 실온에서 2시간 동안 0.01% BSA에서 배양했습니다. 핵 대조염색은 Vectashield 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 40 μL의 DAPI를 추가하고 커버슬립하여 수행했습니다. 면역반응성 RXFP1 단백질은 형광 현미경을 사용하여 x40 배율(Olympus BX51)로 시각화하고 이미지를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 병합했습니다.

2.4. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 모든 통계 분석은 GraphPad Prism'M(Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 방법-ANOVA를 사용하여 후기 EPC의 증식(MTT 분석) 및 혈관신생(관 형성 분석) 잠재력에 대한 다양한 처리 효과를 비교한 다음, 처리 그룹 간의 다중 비교를 허용하기 위해 Tukey의 사후 테스트를 수행했습니다. 반복 측정-양방향 ANOVA를 사용하여 시간 경과에 따른 후기 EPC에 의한 상처 봉합에 대한 다양한 치료의 효과를 비교한 다음, Tukey의 사후 검정을 사용하여 각 치료 그룹을 비교했습니다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.