1부: Euphorbiae Ebracteolatae Radix의 총 디테르페노이드의 항악성 복수 효과는 신장에서 PKC 활동을 억제함으로써 아쿠아포린의 변형에 기인합니다
May 18, 2022
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추상적인: 본 연구에서는 Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE)에서 추출한 총 diterpenoids가 악성 복수 마우스에 미치는 항복수 효과를 평가하고 그 기저 기전을 규명하였다. TDEE를 디클로로메탄으로 추출하고 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다. TDEE에서 분리된 6개의 디테르페노이드의 순도는 HPLC에 의해 77.18%로 측정되었습니다. TDEE(3 및 0.6g 생약초/kg, po)는 복수를 감소시키고 소변량을 증가시켰습니다. 한편, 종양 세포 생존율, 주기 및 세포 사멸의 분석은 TDEE가 없는 것으로 나타났습니다.항종양활동. 또한, 아쿠아포린(AQP)의 발현 수준과 단백질 키나제 C(PKC) 및 PKC의 막 전위 수준은신장및 세포를 측정하였다. TDEE는 AQP{0}} 수준을 감소시키고 막 분획에서 PKC 발현을 억제했습니다. 화합물 2를 제외한 4가지 주요 디테르페노이드는 인간의 신장{3}} 세포에서 AQP1 수준을 감소시켰습니다. 화합물 4 및 5는 뮤린 내부 수질 집합관 세포에서 AQP2-4 발현을 억제했습니다. AQP{8}} 발현의 디테르페노이드 유도 억제는 포르볼-12-미리스테이트{10}}아세테이트(PMA, PKC의 작용제)에 의해 차단되었습니다. TDEE의 디테르페노이드는 주요 항복수 성분입니다. 디테르페노이드의 항복수 효과는 이뇨 촉진을 위한 신장의 AOP 변화와 관련될 수 있습니다. TDEE에 의한 AOP{13}} 발현 억제는 PKC 활성화 억제와 관련이 있습니다.
키워드: 유포비아 에브락테올레이트 Hayata; 이뇨; 생리활성 성분; 테르페노이드; 신장 세포; PKC 억제제
1. 소개
Euphorbia ebracteolate Hayata(EEH)는 Euphorbiaceae과의 Euphorbia 속에 속하는 한약재로 복부 팽만과 부종, 기생충 감염, 결핵 및 기타 질병의 치료에 널리 사용됩니다[1]. EEH(EER)의 뿌리에는 다양한 테르페노이드가 함유되어 있어 유효 성분으로 간주됩니다. 테르페노이드에 대한 최근 연구에서는 이들의항염증, 항바이러스제,항결핵 및 시험관 내 기타 효과 [2-5]. 그러나 복부 팽만 및 부종의 치료에서 EER의 전통적인 효과에 대한 기초 연구 조사는 제한적입니다. TCM 이론에 따르면 EER은 배뇨와 설사를 촉진하여 복부 팽만과 부종을 신속하게 제거할 수 있습니다[6]. 우리의 이전 연구에서는 EER(TDEE)의 총 디테르페노이드가 아쿠아포린(AQP)-1 및 AQP3의 발현을 조절하여 설사를 유발할 수 있음을 보여주었습니다[7]. 그러나 현재까지 EER에서 항복수의 효과적인 물질은 불분명하다.
현대 의학에서는 복부 팽만과 부종을 복수로 설명합니다. 복수는 복막액의 병리학적 축적입니다[8]. 복수 형성의 원인은 간경변, 종양, 심부전, 신증후군 등 다양하다[9]. 복수의 발생은 문맥압항진증과 관련되어 내장 동맥의 혈관 확장, 유효 순환량의 감소, 내인성 혈관 수축 시스템의 활성화 및 신장의 열렬한 수분 저류를 유발합니다[10]. AQP는 상피 및 내피 장벽을 가로지르는 물의 빠른 막 수송체이므로 물 균형을 유지하는 데 기본적인 역할을 합니다[11]. AQP가 복수[12-15]의 형성과 장애에 중요한 역할을 한다는 것이 수많은 연구에서 밝혀졌습니다. AQP1, AQP2, AQP3, AQP4 등 여러 종류의 AQP가 신장에 존재합니다. TDEE는 장에서 AQP의 발현을 조절할 수 있기 때문에[7], 우리는 TDEE가 신장에서 AQP를 조절함으로써 복수 치료에 활용될 수 있다고 제안합니다.
AQP는 소변 형성에 중요한 역할을 하지만, 신장에서 AQP 발현을 조절하는 메커니즘은 명확하지 않습니다. 현재 제한된 수의 보고서만이 AQP가 단백질 키나제 C(PKC) 및 단백질 키나제 A(PKA) 경로[17-20]를 통해 조절된다는 것을 나타냅니다. Euphorbia에서 분리된 일부 테르페노이드(예: uphold 및 ingenol 3-angelate)는 PKC에 대한 조절 효과가 있습니다. TDEE는 PKC 경로에 의해 신장에서 AQP 발현을 조절할 수 있습니다.
본 연구에서는 TDEE를 추출하여 복수 생쥐의 신장에서 AQPs 발현, PKC, PKA 활성 분석 및 항복수 효과를 평가하였다. 그런 다음, 우리는 TDEE에서 주요 디테르페노이드를 분리 및 정제하여 두 종류의 AQP 단백질 및 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 조사했습니다.신장 세포(인간 신장{0}} 세포(HK{1}}) 및 쥐의 내부 골수 집합관 세포(mIMCD3)). 마지막으로, 우리는 PKC 경로를 활성화하기 위해 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA; PKC의 작용제)를 사용하여 신장에서 AQP의 발현이 조절되는지 여부를 확인하기 위해 디테르페노이드 화합물(유페브락테올라틴 A)을 선택합니다. PKC 경로에 의해. 이 연구는 EER에서 TDEE의 항복수 효과를 확인하고 EER의 임상적 적용과 이뇨 및 항복수 효과에 대한 후보 약물의 식별을 위한 기초를 제공하는 것을 목적으로 하였다.
2. 결과
2.1.복수액 중량, 소변 중량 및 분변 수분 함량에 대한 TDEE의 영향
EER(TEER) 및 TDEE(3 및 0.6g raw Herbs/kg, po) 및 푸로세미드(양성 약물)의 총 추출물로 복수 마우스를 처리한 결과 모델에 비해 복수의 중량 증가가 유의하게 감소했습니다. 그룹(그림 1A). 그림 1C는 소변 무게가 유의하게(p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. 복수 마우스의 혈청 알부민 수준에 대한 TDEE의 효과
혈청 알부민은 척추동물의 혈장에서 가장 풍부한 단백질이며 혈액의 삼투압을 유지하고 물 수송을 조절할 수 있습니다. 그림 1B는 모델 마우스에서 복수의 생성이 정상 그룹과 비교하여 혈청 알부민의 유의한 감소를 유발함을 보여주었습니다. furosemide, TEER 및 TDEE(3 및 0.6 g raw Herbs/kg, po) 처리 후 혈청 알부민 수준은 모델 그룹에 비해 효과적으로 회복되었습니다. 이 지수의 개선은 NTDEE 그룹에서 관찰되지 않았습니다.
2.3. 복수 마우스에서 종양 세포 생존, 주기 및 세포자멸사에 대한 TDEE의 효과
악성 복수에서 종양 세포는 복수액에 떠 있습니다. 복수의 감소가 TEER과 TDEE의 항암 활성과 관련이 있는지를 평가하였다. 결과는 이러한 약물이 종양 세포 생존력(그림 2A)을 억제하지 않았고 세포 주기 정지(그림 2B) 및 세포자멸사(그림 2C, D)로 이어지지 않았다는 것을 보여주었습니다.
2.4. 복수 마우스의 신장에서 AQP 발현에 대한 TDEE의 효과
신장은 수분 재흡수와 소변 농도에 중요한 기관입니다. AQP 수로는 신장에서 물의 빠른 이동을 중재합니다. 따라서 우리는 신장에서 AQP의 발현을 조사했습니다. 그림 3은 복수의 증가가 정상 그룹과 비교하여 신장의 AQP 발현에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. TEER 및 TDEE 처리 시 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4 단백질의 발현은 대부분의 용량에서 모델 그룹보다 현저히 낮았습니다. TEER은 3.0 및 {{1{13}}}.6g 생약초/kg의 투여량에서 AQP2, AQP3 및 AQP4 발현의 상당한 감소를 초래한 반면, AQP1 발현은 3.{9}} 및 {{1{13}}}}. 저용량(0.6g 생약초/kg). 특히, TDEE는 2회 용량에서 TEER과 동일한 AQP3 및 AQP4 발현 억제 효과를 나타냈다. TDEE와 TEER의 차이점은 TDEE는 고용량(3g 생약초/kg)에서만 AQP1 및 AQP2의 발현을 억제한다는 것입니다. NTDEE는 신장의 AQP 수준에 약한 영향을 미쳤으며, 3g 생 허브/kg.
2.5. 복수 마우스의 신장에서 PKC 및 PKA 활성화에 대한 TDEE의 효과
이전 연구에 따르면 AQP 발현은 PKC 및 PKA 활성화에 의해 조절될 수 있습니다. 우리는 PKC-a, PKC- 및 PKA 활성화에 대한 TDEE의 효과를 조사했습니다. PKC 활성화는 세포질에서 세포막으로의 전위에 의해 측정되었다. 도 4A 및 B에 나타난 바와 같이, 막 분획에서 PKC-의 단백질 발현 수준은 TDEE 그룹에서 유의하게 감소한 반면, PKC- 막 단백질의 발현 수준에는 유의한 영향이 없었다. 포스포리파제 C(PLC)는 PKC.TDEE 처리의 활성화를 매개하는 중요한 상류 신호전달 분자로 인산화 및 전체 PLC 수준에 어떤 영향도 미치지 않았습니다(그림 4D). PKA는 두 개의 조절 소단위에 결합된 두 개의 촉매 소단위로 구성된 이종사량체입니다. 촉매 소단위의 방출은 PKA 활성화의 특징입니다. 도 4C에서, TDEE는 PKA 촉매 서브유닛의 발현에 영향을 미치지 않았다.
2.6.고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 TDEE의 6가지 디테르페노이드 함량 측정
동물 실험의 결과는 TDEE가 EER의 주요 유효 부분임을 보여주었습니다. 우리는 TDEE에서 6개의 디테르페노이드(화합물 1에서 6의 구조가 그림 5에 표시됨, 스펙트럼 데이터는 보충 자료에 추가됨)를 분리하고 이러한 화합물을 TDEE의 디테르페노이드 함량을 결정하기 위한 표준으로 사용했습니다. TDEE 및 6가지 디테르페노이드 표준물질에 대한 HPLC 크로마토그램은 그림 6에 나와 있습니다. 화합물 1~6의 함량은 각각 1.07%, 12.{9}}%, 12.69%, 9.15%, 39.26% 및 3.02%였습니다. TDEE의 77.18%.
2.7. TDEE의 디테르페노이드가 신장 세포에서 AQP 발현에 미치는 영향
TDEE는 신장에서 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4 발현을 감소시켜 복수를 억제하는 EER의 활성 분획이었습니다. 동시에 TDEE는 또한 인간 신장-2 세포(HK{9}}) 및 쥐의 내부 수질 집합관 세포(mIMCD3)에서 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 단백질 및 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰습니다. (그림 7). TDEE의 주요 성분은 디테르페노이드입니다. 우리는 TDEE와 디테르페노이드 혼합물 사이의 효과를 비교했습니다(6개의 분리된 디테르페노이드가 TDEE의 함량에 따라 혼합되었습니다). 결과는 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4 발현에 대한 디테르페노이드 혼합물과 TDEE의 억제 효과가 유사함을 보여주었습니다(그림 7). TDEE의 4가지 주요 디테르페노이드의 활성을 시험관 내에서 평가했습니다. 도 8 및 9는 HK{20}} 세포에서 AQP1의 단백질 및 mRNA 발현 수준이 화합물 3,4 및 5에 의해 유의하게 감소되었음을 보여줍니다. 화합물 2를 사용한 처리는 단백질 및 mRNA에서 AOP1의 현저한 감소를 유도하지 않았습니다 수준. 이들 화합물의 경우, 화합물 3(ent-abietane 유형 디테르페노이드)이 다른 화합물보다 더 활성이었다. mlMCD3 세포에서 4개의 디테르페노이드 화합물은 AQP2, AQP3 및 AQP4 발현의 다양한 억제 정도를 유도했습니다. 단백질 및 유전자 발현의 결과를 도 8 및 9에 나타내었다. 화합물 4 및 5는 유전자 및 단백질 수준에서 대조군과 비교하여 강력한 AQP2, AQP3 및 AQP4 억제 효과를 나타냈다. 화합물 2 및 3은 Aqp2, Aqp3 및 Aqp4 mRNA 발현에 대해서만 상이한 효과를 나타냈다.
2.8. AQP의 디테르페노이드 유도 억제에 대한 PKC 활성제의 효과
동물 실험의 결과는 TDEE가 H22 종양 세포 보유 마우스의 신장에서 PKC 활성과 AQP 발현을 동시에 억제한다는 것을 나타내었다. PKC가 신장 세포에서 AQP의 발현을 조절하는지 여부를 더 명확히 하기 위해 PKC 작용제(PMA)를 디테르페노이드(유페브락테올라틴 A) 자극 1.5시간 전에 HK{2}} 및 mIMCD3 세포에서 전처리했습니다. 막 PKC , AOP1, AOP2, AOP3 및 AOP4 발현의 변화가 검출되었다. Western Bolt 결과는 유페브락테올라틴 A가 막 PKC, AOP1, AOP2, AOP3 및 AOP4의 단백질 발현을 감소시킬 수 있고 그 효과는 PMA 전처리에 의해 약화될 수 있음을 보여주었다(그림 10).
