Part1: Cistanche Herba의 Cistanoside는 산화 스트레스 억제를 통해 저산소증으로 인한 남성 생식 손상을 개선합니다

추가 정보 연락처: 티나tina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1중국 산시성 시안 710038 제4군사대학 탕두병원 비뇨기과;

2비뇨기과 및 신장 병원, Xi'an People's Hospital, Xian 710100, Shaanxi, China;

3중국 산시성 시안 710032 제4군사대학 기초의학연구소;

4중국 산시성 시안 710038 제4군사대학 탕두병원 방사선치료과. *동등한 기여자. 2020년 9월 1일에 접수됨;

2021년 1월 18일 수락됨; 에펍 2021년 5월 15일; 2021년 5월 30일 게시됨

추상적인: 저산소증이남성 불임, 저산소증은 다음과 관련이 있을 수 있습니다.산화 스트레스(OS). Cistanoside(Cis)는 페닐에타노이드 배당체 화합물입니다.시스탄체스 허바다양한 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 본 연구는 시스가 생식기 손상으로 인한 보호 효과를 조사하는 것을 목적으로 하였다. 저산소증에 의해 특정 기본 메커니즘을 탐색합니다. 세포 및 동물 저산소증 실험 모델을 구성하고 남성 생식 기관에 대한 Cis의 다른 아형의 보호 효과를 시험관 내 및 생체 내 모두에서 평가했습니다. 결과는 저산소증이 OS 증가와 관련된 세포 주기 정지 및 세포자멸사 활성화를 통해 GC{0}} 세포의 생존력을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났습니다. 더욱이, Cis는 시험관내 및 생체내 모두에서 강력한 항산화 효과를 나타내어 항산화 효소 활성을 유의하게 회복시키고 활성 산소종(ROS) 수준을 하향 조절하는 동시에 세포 생존력을 증가시키고 세포자멸사를 감소시켰다. 중요하게도, 여기에서 연구된 Cis 하위 유형(Cis-A. Cis-B, Cis-C 및 Cis-H)은 모두 특정 항산화 효과를 나타내었고, 그 중 Cis-B의 효과가 가장 중요했습니다. 이 연구는 Cis가 고환과 GC{7}} 세포에서 항산화 효소 활성에 영향을 미침으로써 저산소증으로 인한 OS의 유해한 영향을 현저하게 약화시킨다는 것을 보여줍니다.

키워드: 시스타노사이드, 저압성 저산소증, 남성불임, 산화스트레스, 생식보호

소개

현재 전 세계적으로 약 4,850만(15%)의 가임 연령 부부가 불임의 영향을 받고 있으며[1], 그 중 40-50%가 불임으로 인한 것입니다.남성 불임[2], 환경 및 생활 방식 요인과 강하게 관련된 상태입니다. 증거에 따르면 포유류의 고환이 낮은 산소압에 취약하다는 것이 일부 형태의 원인 인자입니다.남성 불임[삼]. 이전 연구에서 입증된 바와 같이, 정자 형성은 손상되고 노출 시 감소합니다.저압성 저산소증 [4-7].

근본적인 메커니즘을 탐구하기 위해 연구에 따르면저압성 저산소증활성산소종(ROS) 증가

유도 [8, 9].ROS는 남성 생식 기관에서 중요한 역할을 합니다. 낮은 수준에서는 정자 용량화, 극체 반응 및 정자 세포 융합에 필요합니다[10]. 그러나 과도한 ROS는 정자 핵/미토콘드리아 DNA 손상 및 원형질막을 유발할 수 있습니다.과산화 손상, 차례로 남성 불임의 위험 증가에 대한 주요 병인학적 요인[11,12]입니다. 따라서 저산소증으로 인한 ROS의 축적은 남성 불임의 원인 중 하나일 수 있습니다.

시스탄체스 허바다년생 약용식물로 건조한 지역에 널리 분포하고[13] 약리작용[14-17]으로 인해 널리 사용된다. 의 모든 효과적인 콘텐츠 중에서시스탄체스 허바, PhGs가 주요 활성 성분으로 간주되었습니다. 현재까지 34개의 PhG가 Cistanches 식물에서 분리되었습니다[13]. Cistanches Herba에서 분리된 활성 PhG인 Cistanoside(Cis)는 항산화 효과로 주목을 받았습니다.

Cis의 항산화 효과와 저산소증 유발에서 ROS의 역할 고려남성 불임, 시스는 저산소증으로 인한 치료를 위한 잠재적인 약물 후보로 간주됩니다.남성 불임. 그러나 저산소증으로 인한 치료에서 Cistanches Herba에서 추출한 Cis의 항산화 효과를 다룬 보고서는 거의 없습니다.남성 불임또는 관련된 신호 경로. 이 연구에서는 in vitro 및 in vivo 저산소증 실험 모델을 구축하고 서로 다른 Cis의 효과 성분을 평가했습니다.

재료 및 방법

세포 배양 및 시약

마우스 정자 세포주 GC{0}}spg(GC{1}})는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% 소태아 혈청, 1%가 보충된 DMEM(Invitrogen, USA)에서 배양했습니다. L-글루타민(100mM), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100ug/mL), 5% CO, Cis(Cis-A, B, C, H)가 포함된 가습 인큐베이터에서 37도 Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd.(중국).

세포 생존력 분석

세포 생존력은 세포 계수 키트{{0}} 분석(CCK-8)으로 테스트했습니다. 간단히 말해서, GC-1 세포를 웰당 1.5×103으로 96-웰 플레이트에 파종하고 37도에서 24시간 동안 배양했습니다. 그런 다음, 세포를 다른 농도(20%, 15%, 10%, 5%)의 산소 또는 다른 농도(2μM, 0.2μM, 0.02μM)의 Cis(Cis-A, Cis-B, Cis-)로 처리했습니다. C, Cis-H) 필요한 시간 동안. 그런 다음 상층액을 버리고 CCK{22}} 키트(Dojindo Japan)를 사용하여 세포 생존율을 감지했습니다. 각 웰의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(BioRad USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 마지막으로 세포 생존율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다. 세포 생존율=(OD실험군 - ODblank 그룹)/(OD대조군 - ODblank 그룹) × 100% . 웨스턴 블롯 분석 수확된 세포 또는 조직을 RIPA 완충액에서 균질화하여 단백질을 추출하였다(RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). 상등액을 채취하고 단백질 농도를 BCA법(Beyotime)으로 시험하였다. 각 샘플에서 약 40ug의 추출된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스(NC) 필터 멤브레인(Beyotime China)으로 전기이동했습니다. NC 필터 막을 5% 무지방 우유로 1.5시간 동안 차단하고 특정 항체(항-PARP 1:1000, 항-Caspase-3 1:1000, 항-Bcl-2 1:1000, 항- Bax 1:1000, 항-GAPDH 1:1000, 모든 항체는 Cell Signaling Technology, USA)에서 밤새 4도에서 구입했습니다. 그런 다음, 모든 NC 멤브레인을 상온에서 1.5시간 동안 해당 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 이차 항체와 배양하고 이미징 시스템(Tannon, China)으로 이미지화했습니다.

세포주기 검출

세포 주기를 분석하기 위해 유세포 분석(FCM)을 수행했습니다. 세포를 72시간 동안 다른 조건에서 처리하고 수확했습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 75% 에탄올에 고정한 다음 프로피디움 요오드화물(PI)로 염색했습니다. 각 샘플에 대해 1x104 세포를 수집하고 유세포 분석법(FACS Calibur, BD Biosciences)으로 분석했습니다. 그 다음, G1/S/G2기 세포의 비율과 증식 지수[Phase(S plus G2)/Phase(G1 plus S plus G2) × 100%]를 계산하였다.

기 염색

세포를 공초점 접시에서 배양하고 72시간 동안 저산소증 또는 Cis의 다른 아형으로 처리했습니다. 모든 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 항Ki{3}} 항체(1:2{12}}0, Cell Signaling Technology)와 함께 배양했습니다. 그런 다음, 모든 세포를 해당하는 CY{7}}접합된 항-토끼 IgG 항체(1:200, Boster, China) 및 DAPI 용액(1.0ug/mL, Beyotime)과 함께 배양했습니다. Fluoview FV1000 공초점 현미경(Olympus, Japan)으로 형광을 관찰하였다.

ROS 감지

FCM은 DCFH-DA를 사용하여 세포 내 ROS 수준을 측정하기 위해 도입되었습니다. 정지된 세포를 6-웰 ​​플레이트에 파종하고 다른 처리를 했습니다. 72시간의 처리 후, 세포를 10μM DCFH-DA(Beyotime)가 포함된 무혈청 DMEM에 현탁시켰다. ROS 함량은 여기 파장이 488 nm이고 방출 파장이 525 nm인 Beckman Coulter 유세포분석 시스템에서 형광 활성화된 세포 분류에 의해 결정되었습니다[18].

지질 과산화(LPO) 측정

LPO를 검출하기 위해 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석을 수행하였다. 모든 작동 단계는 지침(Sigma USA)에 따라 수행되었습니다. 농도는 1.56 x 105/(M-cm)의 몰 흡광 계수를 사용하여 계산되었으며, 이는 표준으로서 말론디알데히드를 사용하여 획득되었습니다. 결과는 MDA 등가물의 nmol/단백질 mg으로 표시됩니다.

효소 활성 측정

효소 활성은 글루타티온 환원효소(GR), 글루타티온 퍼옥시다제(GPx) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 포함한 분석 키트를 사용하여 테스트되었습니다. 모든 작동 단계는 제공된 지침(Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China)에 따라 수행되었습니다.

동물 및 실험 프로토콜

성숙한 수컷 Wistar 쥐({0}} g, 8 w old)는 중국 시안에 있는 제4군사 의과대학 동물센터에서 입수했습니다. 동물의 사용에 대한 허가는 대학윤리위원회(참조번호: 20190506)에서 얻었습니다. 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 대학 지침에 따라 수행되었습니다.

모든 쥐는 실험 시작 전 약 1주일 동안 적응하도록 하였다. 순응 후, 쥐는 각 그룹에 5마리의 동물이 있는 6개 그룹으로 무작위로 분배되었습니다. 대조군의 쥐는 상압(PO.:20%, 기압:101.3kPa)에서 키웠고, 모델과 Cis 처리군의 쥐는 저압 산소실(내부 압력 61.6kPa)에서 키웠습니다. , 해발 4000미터 높이에 해당, PO:14.55% ) 고지대 저산소 환경을 시뮬레이션합니다. 모든 쥐는 자동 12-시간 명암 주기로 22 ±2도 및 습도 조건의 플라스틱 케이지에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모델 및 Cis 처리 그룹의 쥐는 저압 조건하에 유지되었지만 96시간마다 정상 압력 조건으로 옮겨졌고, 이때 음식과 물이 제공되었고 우리는 청소되었습니다. 저압에서 저압으로의 전환 기간은 약 2시간이었습니다. 모든 처리 그룹은 8주 동안 경구 위관 영양법을 통해 상응하는 Cis(8 mg/kg/d)로 처리된 반면, 대조군 및 모델 쥐는 동일한 부피의 물로 처리되었습니다.

8주 후, 쥐를 마취 하에 희생시켰다. 고환, 부고환 및 정낭을 분리하여 무게를 측정하고 다음 공식에 따라 장기 지수를 계산했습니다. (장기 무게/동물 무게)

t) ×100% . 이어서 부고환의 정자를 채취하여 정자의 운동성과 첨체효소 활성을 검사하였다. 유사하게, 고환 조직은 조직병리학적 연구 및 ROS, LPO 및 항산화 효소 활성 검출을 위해 수집되었습니다.

살아있는 정자율 평가

수술용 가위로 부고환을 절개하고 생리식염수에서 정자 현탁액을 제조하였다. 살아있는 정자 비율을 평가하기 위해 5 uL의 정자 현탁액을 동일한 부피의 eosin-Y 염색과 조심스럽게 혼합했습니다. 그런 다음 광학 현미경으로 정자의 수를 세었습니다. 살아있는 정자 비율은 염색된 정자(죽은 정자)와 염색되지 않은 정자(살아 있는 정자)를 모두 계산하여 평가했습니다.

정자 첨체 효소 활성 측정

정자 첨체 효소 활성 분석은 정자 첨체 효소를 평가하는 데 사용되었습니다[19]. 각 그룹의 결과는 Acrosome enzyme activity(μIU) =(ODExperiment 그룹 - ODBlank 그룹)/(247.5x10) × 106 공식을 사용하여 계산되었습니다.

통계 분석

모든 정량적 데이터는 평균 ± SD로 표시되며 SPSS 22.{1}} 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. Independent Student's t-test는 두 그룹 간의 데이터를 비교하는 데 사용되었습니다. "피<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

결과

GC{0}} 세포에 대한 저산소증의 영향

생식 세포에 대한 저산소증의 영향을 확인하기 위해 먼저 1, 3, 5 및 7일 동안 서로 다른 산소 농도(20%, 15%, 10%, 5%)로 저산소증 처리 후 세포 생존 능력의 변화를 조사했습니다. , 각각. CCK{9}} 분석 결과는 대조군(20% 산소 농도)과 비교하여 저산소증에 노출된 세포가 생존력에서 유의한 감소를 나타냈다(P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

그 후, FCM 및 면역형광 염색을 수행하여 저산소증 처리하에서 GC{0}} 세포의 증식 변화를 추가로 평가했습니다. 결과는 저산소증이 G1기에서 GC{1}} 세포 정지를 유도하여 S기로의 세포 진입을 감소시키고 DNA 복제를 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 저산소증은 GC{3}} 세포의 증식 지수를 유의하게 감소시켰습니다(P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

다음으로 우리는 저산소증에 의해 유도된 GC{0}} 세포 생존 억제 방식을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 문헌에 보고된 바와 같이, ROS 수준은 쥐가 저압성 저산소 환경에 노출됨에 따라 증가했습니다[8,20]. 따라서 FCM 분석을 사용하여 GC-1 세포의 내인성 ROS 수준을 측정했습니다. 결과는 정상 산소 그룹과 비교하여 저산소 상태에서 더 높은 ROS 수준을 보여주었습니다(P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

ROS에 의한 세포 손상은 일반적으로 OS에 의해 발생하므로 GC{1}} 세포의 OS를 추가로 테스트했습니다. 그림 1F에 나타난 바와 같이 모델 그룹에서 GC-1 세포의 LPO 수준은 현저하게

대조군의 GC{0}} 세포의 LPO 수준에 비해 증가했습니다. 이러한 결과는 저산소증으로 인한 GC{2}} 세포 손상이 ROS 축적에 의해 유도되는 OS와 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

시험관 내 저산소증 유발 GC{1}} 세포 생존에 대한 Cis의 효과.

Cis가 GC{0}} 세포 생존에 대한 저산소증의 억제 효과를 방지할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 CCK{1}} 분석을 수행했습니다. GC{2}} 세포는 72시간 동안 Cis의 다른 아형(Cis-A, B, C, H) 및 농도 범위(0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM)로 처리되었습니다. DMSO 그룹이 있는 모델 그룹은 DMSO가 GC{10}} 세포 생존력을 직접적으로 촉진하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 그러나 세포 생존력은 현저하게 회복되었습니다(P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Cis의 메커니즘은 시험관 내 저산소증으로부터 생식 세포를 보호합니다.

GC{0}} 세포에 대한 Cis의 보호 효과가 과도한 ROS 제거와 관련이 있는지 여부를 조사하기 위해 형광 염료 DCFH-DA를 사용하여 각 그룹의 ROS 수준을 감지했습니다. 그림 3A, 3B에서 볼 수 있듯이 DMSO 처리는 모델 그룹과 비교하여 세포 내 ROS 함량이나 LPO 수준을 변화시키지 않았습니다. 그러나 GC{4}} 세포의 ROS 수준은 Cis 처리군에서 현저히 감소했습니다(그림 3A). 또한, LPO의 감소는 Cis를 받은 GC{7}} 세포에서도 관찰되었습니다(그림 3B).

Cis가 저산소 손상으로부터 생식 세포를 보호하는 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 TUNEL 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 아폽토시스를 평가했습니다. TUNEL 염색(그림 3C)은 모델과 DMSO그룹에서 상당한 세포자멸사를 보여주었습니다. 그러나 Cis 처리에서 더 적은 수의 세포 사멸 세포가 관찰되었으며, 이는 Cis 처리가 GC{1}} 세포 사멸을 감소시켰음을 나타냅니다. 또한 PARP, Caspase-3, Bax 및 Bcl-2의 발현을 측정하여 분자 메커니즘을 확인했습니다. 그림 3D에 나타난 바와 같이 Caspase-3와 PARP는 저산소 상태에서 GC{6}} 세포에서 활성화되었으며 이 활성화는 Cis 처리에 의해 억제되었습니다. 또한 Bax/Bcl-2의 비율은 대조군보다 모델군에서 더 높았고, Cis 처리는 Bax/Bcl-2의 비율을 감소시켰다(그림 3D). 이러한 데이터는 Cis가 저산소증으로 인한 산화제 손상을 약화시킬 수 있는 잠재적인 능력이 있음을 나타내며, 이러한 보호 효과는 ROS 축적을 감소시키고 Caspase 관련 세포자멸 경로 활성화를 억제함으로써 달성될 수 있습니다.

OS를 억제하는 효소적 기전은 글루타티온 환원효소(GR), 글루타티온 과산화효소(GPx) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 같은 자유 라디칼 제거제를 포함합니다[23]. OS를 억제하는 효소적 기전은 예방에 필수적인 역할을 합니다.산화 손상세포와 조직에서 [23]. GC{2}} 세포에서 저산소증으로 인한 OS의 Cis 억제의 잠재적 메커니즘을 추가로 검증하기 위해 GR, GPx 및 SOD의 활성을 측정했습니다. 그 결과 GR, GPx 및 SOD 활성이 모두 대조군과 비교하여 저산소 상태에서 유의하게 감소했으며(P < 0.01,="" 그림="" 3e),="" cis="" 처리는="" gc에서="" 활성을="" 현저하게="" 회복시키는="" 것으로="" 나타났습니다{{6}="" }="" 저산소증에="" 노출된="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

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