1부: Geraniol은 항산화 상태, 염증 및 세포자멸사의 변화를 통해 독소루비신 매개 신장 손상을 개선합니다: NF-kB 및 Nrf2/Ho의 잠재적 역할-1

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추상적인: 독소루비신 매개신장 장애암 치료에서 심각한 문제입니다. 따라서, 이 연구는 geraniol이 doxorubicin에 의해 유도되는 조절 능력을 조사했습니다.신장 손상쥐 모델을 사용하여 쥐는 대조군, 독소루비신(20 mg/kg, 복강 내, 복강 내), 독소루비신 + 100 mg/kg 게라니올, 독소루비신 + 200 mg/kg 게라니올의 4개 그룹으로 무작위로 할당되었습니다. 단일 독소루비신 주사는 변경된 혈청 크레아티닌, 혈액 요소 질소 및 알부민 값에 의해 입증된 바와 같이 신장 손상을 유발했습니다. 그것은 또한 신장 구조에 조직학적 변화를 일으켰습니다. 또한, 독소루비신은 지질 과산화를 향상시키면서 감소된 글루타티온, 카탈라제 활성 및 글루타티온 퍼옥시다제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 발현을 낮추었습니다. 흥미롭게도, 제라니올로 전처리하면 독소루비신으로 유도된 신장 항산화 매개변수, 효소 활성, 염증 및 세포자멸사 매개 유전자 및 단백질 발현의 변화를 구제했습니다. 또한, geraniol을 사용한 예방적 치료는 용량 의존적 방식으로 대부분의 신장 조직학적 특성을 보존했습니다. 이러한 발견은 geraniol이 독소루비신 매개로부터 보호할 수 있음을 뒷받침합니다.신장 기능 장애. 그러나, 독소루비신 매개 신장 기능 장애에 대한 제라니올의 보호 효과의 메커니즘을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

키워드: 독소루비신; 염증; 산화 스트레스; 아폽토시스; 신장 손상; 제라니올

1. 소개

안트라사이클린 항암제인 독소루비신(Dox)은 발견 이후 고형 종양 및 혈액암에 광범위하게 사용되었습니다. 가장 흔한 부작용 중 하나는 신독성으로, 여과, 재흡수 및 배설이 감소된 신장 기능 장애로 설명되며, 이는 상당한 이환율 및 사망 위험과 관련이 있습니다. 화학 요법을 받는 암 환자의 약 60%는 신독성이 발생하여 Dox의 치료 효과를 제한합니다[5,6]. Dox가 매개하는 신독성을 유발하는 기본적인 과정은 아직 알려지지 않았지만 문헌에 따르면 다음과 같은 원인이 될 수 있습니다.산화 스트레스, 염증, 그리고세포자멸사. 특히 증거에 따르면 Dox 관련산화 스트레스, 염증, 그리고 apoptotic 이벤트는 약물의 신장 독성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

핵 인자(적혈구 유래 2)-유사 2(Nrf2)는 세포 방어 시스템을 유지하는 항산화, 항염 및 세포 보호 능력을 가진 산화환원에 민감한 전사 인자입니다. 산화 스트레스 시 Nrf2는 세포질 억제제 단백질을 방출하여 핵으로 들어가 헴 옥시게나제-1(Ho{9}}), 글루타티온 퍼옥시다제(GPx), 카탈라제( CAT), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) [{10}}]. Dox를 사용한 치료는 Nrf2의 mRNA와 단백질 발현을 모두 감소시키는 것으로 나타났으며, 따라서 다운스트림 항산화 유전자 및 단백질의 발현을 감소시켜 신장 독성을 유발합니다.

핵 인자-kB(NF-kB)는 많은 염증성 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자입니다. 활성 산소종(ROS)에 의해 활성화되는 NF-kB 경로의 중심 인물로서 염증 반응을 유발하고 조직 손상을 유발할 수 있습니다[8,22,23]. 많은 연구에서 Dox가 염증을 유발하고 인터루킨-6(IL{8}}), 인터루킨-1 베타(L{10}}), 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-)[11,13]. 또한 Dox 매개 신장 손상 후 증가된 ROS 생성은 미토콘드리아 불안정성을 통해 고유한 세포자멸사 경로를 활성화하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 이 경로의 주요 결정자는 미토콘드리아 관련 단백질 Bax 및 Bcl{17}}입니다. Bax에 대한 Bcl{18}}의 균형 잡힌 비율은 세포자멸사를 방지하는 반면, 불균형은 막 투과성을 증가시키고 사이토크롬 c가 세포질로 누출되어 caspase{19}}(Casp{20}})와 caspase{19}}(Casp{20}})를 활성화합니다. {21}} (Casp-3). 이러한 활성화는 일반적으로 DNA 단편화 및 세포 사멸을 초래합니다.

화학요법 약물의 부작용을 최소화하면서 임상적 사용을 극대화하는 것은 큰 관심입니다. 따라서 Dox의 부작용을 개선하기 위해 Dox와 함께 다양한 약제의 사용을 조사하기 위한 연구가 진행되었습니다[13,30,31]. 초본 추출물과 그 생리 활성 성분은 약물 매개 독성을 줄이는 능력으로 오랫동안 인식되어 왔습니다. Geraniol은 생강, 장미, 오렌지, 라벤더, 레몬과 같은 거의 모든 에센셜 오일에서 발견되는 비고리형 모노테르펜 알코올입니다[32,33]. 제라니올은 항궤양, 항암[35], 항우울제[36], 항염증[33]과 같은 다양한 유익한 특성을 갖고 있으며, 나아가 당뇨병성 신증[37]을 완화할 수 있다고 많은 연구에서 보고되었습니다. .

우리가 아는 한, 현재 Dox 매개 신독성에 대한 제라니올의 예방 효과에 대한 구체적인 정보는 없습니다. 따라서 우리는 Wistar 쥐의 신장에서 NF-kB 및 Nrf2/Ho{3}} 신호 전달 경로를 통해 Dox에 의한 손상에 대한 geraniol의 작용 효과와 가능한 메커니즘을 연구했습니다.

2. 재료 및 방법

2.1.동물

수컷 Wistar 쥐는 사우디 아라비아 리야드에 있는 King Saud University(KSU) 동물 보호 센터에서 조달했습니다. 동물은 12시간 명암 주기로 실온(25 ± 1도)에서 유지하고 KSU 지역 기관 연구 윤리 위원회에서 승인한 대로 물과 표준 식단에 제한 없이 접근하는 등 통제된 조건에서 유지되었습니다. (REC) 승인 번호 KSU-SE-19-122에 따라.

2.2. 실험적 설계

이 조사에서는 체중이 190-210g인 수컷 Wistar 쥐 총 32마리를 4개 그룹으로 나누어 조사했습니다. 쥐는 연구에 앞서 환경에 적응할 수 있도록 일주일이 주어졌습니다. 대조군으로도 알려진 비히클 그룹은 생리 식염수의 경구 제형을 받은 쥐로 구성되었습니다. 그룹 II는 17일째에 Dox(20 mg/kg ip 단일 용량)를 투여한 쥐로 구성되었습니다[11]. 그룹 IIII 및 IV 쥐에게 18일 동안 각각 100 및 200 mg/kg의 예방 용량의 게라니올(경구)을 투여하고 17일째에 Dox(20 mg/kg, ip)를 투여했습니다. 18일째에 통제된 환경에서 케타민/자일라진 조합을 사용하여 래트를 안락사시켰다. 혈액을 수집하고 혈청을 분리하고 두 신장을 모두 제거하고 즉시 액체 질소에서 급속 냉동했습니다. 냉동 조직에 대해 생화학적, 유전자 및 단백질 발현 분석을 수행했습니다. 조직학적 검사를 위해 신장 조직 샘플을 PBS로 세척한 다음 4% 포름알데히드 용액에 보존했습니다. 조사 기간 동안 실험 동물에서 고통이나 죽음의 징후는 없었습니다.

2.3. 신장 기능 마커의 결정

희생 시 수집된 혈액에서 혈청을 분리하기 위해 혈액 샘플을 미리 냉각된 원심분리기에서 2000xg에서 10분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 얻은 혈청을 분석하여 알부민, 혈액 요소 질소(BUN) 및 크레아티닌을 정량화했습니다. 값신장 기능마커는 Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, USA를 사용하여 계산되었습니다.

2.4. 지질 과산화 평가

이전에 Ohkawa et al.이 설명한 대로 약간의 수정을 가하여 신장 조직에서 지질 과산화를 평가했습니다.

2.5. 환원된 글루타치온의 정량화

신장 미토콘드리아 후 상청액(PMS)의 환원 글루타티온(GSH) 수준은 Sedlak과 Lindsay가 기술한 방법에 따라 약간의 수정을 가하여 측정했습니다.

2.6. 카탈라아제 활성의 정량화

신장 PMS에서 CAT의 활성은 약간 수정하여 Claiborne이 설명한 방법에 따라 결정되었습니다.

2.7. 유전자 발현 분석(RT-qPCR)

TRIzolTMreagent(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 신장 조직에서 총 RNA를 추출했습니다. 추출된 RNA 시료의 순도와 양은 NanoDropTM 8000 Spectrophotometer(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다. 그런 다음 분리된 RNA를 cDNA Synthesis SuperMix(Bimake, Houston, TX, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사하고 Applied Biosystems 7500 Fast Real- 에서 SYBR Green Master Mix(Bimake, Houston, TX, USA)를 사용하여 유전자 발현을 정량화했습니다. 시간 PCR 시스템. 그런 다음 AACt 접근법을 사용하여 GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하여 그룹 간의 다양한 유전자의 상대적인 발현을 결정했습니다. 표 1은 이 연구에 사용된 프라이머 서열을 나열합니다(IDT, Leuven, Belgium).

2.8. 면역블롯 분석

웨스턴 블롯 분석은 Alasmari et al. [41]. 간단히 말해서, 분리된 단백질(30-50 ug)을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 다음 PVDF 막으로 옮겼습니다. 5% 무지방 분유로 60분 동안 차단한 후, 선택적 1차 항체(Ho{6}}, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, cleaved-caspase{{ 14}}, Bcl{15}}, Bax 및 GAPDH, 희석 1:1000). 이후에 막을 세척한 다음, 적절한 HRP-접합 이차 항체(희석: 1:5000)와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션했습니다. ECL 시약 키트와 겔 영상 장비(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 막 상의 단백질 존재를 검출하였다.

2.9.조직병리학 연구

신장 조직을 4% 포름알데히드에 후고정한 다음 파라핀 절단 및 염색을 위해 처리했습니다. 마이크로톰을 사용하여 파라핀 절편을 3 μm 두께로 절단했습니다. 그런 다음 절단 부분을 처리하여 왁스를 제거하고 조직 병리학 검사를 위해 hematoxylin plus eosin(H&E) 염료를 사용하여 염색했습니다. 신장 조직학 이미지는 Olympus BX 현미경에 연결된 DP72 카메라를 사용하여 획득했습니다.

2.10.데이터 분석

데이터는 컴퓨터 기반 프로그램인 Graph Pad Prism 5(San Diego, CA, USA)로 분석하였으며, 그 결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 그룹 간 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Tukey의 비교 테스트를 사용하여 평가되었으며, p-값이 0.05 미만이면 통계적 유의성을 나타냅니다(p<>