제1부: 신장의 허혈 재관류 후 무기질산염의 신혈관 효과

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요약

배경: 신장 허혈-재관류(IR) 손상의 일반적인 원인입니다급성 신장 손상(AKI), 산화 스트레스 및 산화질소(NO) 생체 활성 감소 및 발병 위험 증가와 관련이 있습니다.만성 신장 질환(CKD) 및 심혈관 질환 (CVD). 산화 환원 균형을 복원하는 새로운 전략은 AKI 및 관련 합병증 동안 치료적 의미를 가질 수 있습니다.

겨냥하다: IR에 의해 유발된 신장 및 심혈관 기능 장애 발생 시 질산염-아질산염-NO 경로를 증가시키는 치료적 가치를 조사합니다.

행동 양식: 수컷 C57BL/6 J 마우스에 왼쪽 신장의 온난한 허혈 2시간 전에(45분) 질산나트륨(10mg/kg,ip) 또는 비히클을 제공한 다음 음용수(1mmol/kg/kg)에 질산나트륨 보충 일) 다음 2주 동안. 혈압과 사구체 여과율을 측정하고 혈액과 신장을 채취하여 생화학적 및 조직학적 분석과 신장 혈관 반응성 연구에 사용했습니다. 저산소증-재산소화에 노출된 사구체 내피 세포는 지오텐신 Ⅱ의 유무에 관계없이 기계론적 연구에 사용되었습니다.

결과: IR은 신장 손상, 염증, 내피 기능 장애, Ang II 수치 증가 및 Ang II 매개 혈관 반응과 함께 신장 기능 감소 및 약간의 혈압 상승과 관련이 있었으며 모두 질산염으로 개선되었습니다. 더욱이, 질산염(생체 내) 및 아질산염(시험관 내)으로 치료하면 NO 생물 활성이 회복되고 미토콘드리아 산화 스트레스와 부상이 감소했습니다.

결론: 신장 허혈 전에 무기 질산염으로 급성 치료하는 것은 AKI 및 CKD 및 관련 발병 위험을 예방하기 위한 새로운 치료 접근법으로 작용할 수 있습니다.심혈관 기능 장애.

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1. 소개

이식, 심장 우회 수술 및 쇼크와 관련된 신장의 허혈-재관류(IR) 손상은 급성 신장 손상(AKI) 및 후속적인 만성 신장 질환(CKD) 발생의 주요 위험입니다[1]. 기본 메커니즘은 복잡하고 재관류 관련 산화 스트레스, 산화 질소 결핍 및 면역 세포 활성화를 포함하며 함께 내피 기능 장애를 유발합니다[2, 3]. 지속적인 연구는 AKI와 CKD로의 진행을 예방하고 치료하기 위한 새롭고 효과적인 치료법을 찾는 데 중점을 두고 있습니다. 예를 들어 원격 허혈성 전처리, 일시적인 국소 저체온증 및 새로운 약리학적 개입이 있습니다[3,4].

기체 신호 분자인 산화질소(NO)는 심혈관 및 신장 항상성의 조절에 중요하게 기여하며 IR 손상 동안 보호 역할을 하는 것으로 나타났습니다[5,6]. 그러나, 허혈성 이벤트 동안, 산소의 부족은 재관류 단계 동안 허혈성 조직에서 "리플로우 없음 현상"에 기여할 수 있는 내피 NO 합성 효소(eNOS)의 기능을 손상시킵니다. 이것은 차례로 내피 및 세관 상피 세포 손상을 전파하여 신장 기능 감소의 발달에 기여합니다. 허혈성 기간 동안의 저산소증 외에도 재관류 단계에서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH) oxidase와 미토콘드리아에 의해 과도하게 생성된 활성 산소 종(ROS)의 과도한 생성은 NO를 소거합니다[8]. 산화 스트레스를 줄이고 NO 생물 활성을 유지하는 새로운 접근 방식은 IR 유발 신부전과의 전쟁에서 치료적 가치를 가질 수 있습니다.

무기질산염(NO3)과 아질산염(NOZ)은 이전에 NO 대사에서 파생된 상대적으로 불활성인 생성물로 간주되었습니다. 그러나 20년 이상 동안 수행된 연구에 따르면 이러한 음이온은 연속 환원을 통해 생물전환을 거쳐 다시 NO 및 기타 생리활성 질소 산화물 종을 형성할 수 있습니다[9]. 이 대체 질산염-아질산염-NO 경로의 활성은 고전적인 NOS 시스템이 기능 장애를 일으킬 수 있는 저산소증 및 낮은 pH 조건에서 향상됩니다[10].

NOS 시스템과 함께 식단은 예를 들어 녹색 잎 채소의 질산염 수치가 높기 때문에 순환하는 질산염과 아질산염의 중요한 공급원입니다. 무기 질산염과 아질산염의 보충은 실험 및 임상 연구 모두에서 혈압 감소를 포함한 유리한 심혈관 효과와 관련이 있습니다[11]. 장기 보호 효과는 간[12], 뇌[13], 폐[14] 및 심장[12,15]의 실험적 IR 손상 모델에서도 나타났습니다. 그러나 신장 IR 손상에서 무기 질산염과 아질산염의 잠재적 치료 가치는 여전히 논란의 여지가 있습니다. 최근 검토된 바와 같이[5], 아질산염 요법을 사용하는 IR 모델에서 다양한 결과는 사용된 용량, 투여 경로, 치료 기간 및 실험 모델 자체의 차이로 인한 것일 수 있습니다[16,17]. 여러 실험 연구에서 산화 스트레스의 완화 및 NO 생물 활성의 개선 및 의 조절을 포함하는 메커니즘을 통해 심장 질환 모델에서 식이 질산염 보충의 보호 효과가 입증되었습니다.염증 반응[5]. 현재까지, 신장 IR 손상에 대한 무기 질산염 요법의 효과에 대한 지식은 제한적입니다. 우리는 이전에 질산염을 사용한 만성 식이 전처리가 후속 IR 유발 신장 손상을 약화시킨다는 것을 입증했습니다[18]. 그러나 AKI 및 CKD 발병 위험을 줄이기 위해 IR이 시작될 때 질산염-아질산염-NO 경로를 강화하는 것의 잠재적 가치에 대한 지식은 거의 없습니다. 보호 기능이 있는 경우 AKI 발병 위험이 있는 환자(예: 대수술을 받는 환자)에게 광범위한 임상 적용이 가능합니다.

이 연구에서 우리는 허혈성 사건 직전에 급성 질산염 치료의 잠재적 이점을 조사하기 위해 신장 IR 손상의 마우스 모델을 사용했습니다. 이것은 기계적 생체 외 혈관 연구 및 아질산염 처리를 통한 시험관 내 세포 배양 실험과 결합되었습니다. 우리는 질산염-아질산염-NO 경로를 강화하면 미토콘드리아 기능뿐만 아니라 산화 스트레스 및 NO 생체 활성의 조절을 통해 IR 손상에 대한 신장 보호가 촉진될 것이라고 가정했습니다.

2. 방법

2.1.시약

달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 스웨덴 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다.

2.2. 동물 및 신장 허혈 재관류 모델

C57BL/6 J 마우스(남성, 10주)를 Janvier Lab-oratories(프랑스)에서 입수하여 12-시간의 명암 주기를 갖는 기후 제어 조건에서 Karolinska Institutet의 동물 시설에 수용하고 제공했습니다. 표준 설치류 음식과 수돗물. 모든 동물 절차는 동물 실험을 위한 지역 윤리 위원회(프로토콜 ID: N139/15)의 승인을 받았으며 NIH(National Institutes of Health) 지침과 다음의 수행에 대한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 동물 실험.

순응 1주일 후, 좌신의 편측성 허혈 2시간 전에 마우스에 위약(NaCl) 또는 질산나트륨(NaNO3)을 복강내(10 mg/kg) 투여했습니다. 오른쪽 신장은 검사를 받았지만 그 외에는 온전한 상태로 남아 있었습니다. 가짜 수술은 왼쪽 신장을 조이지 않고 같은 방식으로 수행되었습니다. 마우스를 isoflurane으로 마취하고 수술 내내 히팅 램프와 자체 모니터링 히팅 패드를 사용하여 체온을 37 ± 0.5도로 유지했습니다. 수술 후 마우스는 종료될 때까지 2주간 질산나트륨(1mmol/kg/day) 또는 위약을 투여하였다.

2.3. 혈압 측정

종료 전에 비침습적 꼬리 커프 방법을 사용하여 마우스의 혈압을 측정했습니다. 마우스를 35℃의 따뜻한 플레이트에서 10분 동안 조절한 다음 플라스틱 구속기에 두었다. 꼬리에는 공압 펄스 센서가 달린 커프를 부착하고 CODA 시스템(Kent Scientific, Torrington, CT, USA)으로 혈압을 기록하였다. 동물은 혈압을 기록하기 최소 3일 전에 온기 플레이트에 있는 구속 장치로 훈련을 받았습니다. 수축기, 확장기 및 평균 동맥압을 연속 3일에 걸쳐 수집하고 모든 허용 값의 개별 중앙값을 수집하여 평가했습니다.

2.4.조직 수확

종료 전에 마우스를 대사 우리에 넣어 사구체 여과율(GFR) 계산을 위해 소변을 수집했습니다. 그런 다음 동물을 이소플루란으로 마취하고 혈액 샘플을 하대정맥을 통해 수집했습니다. 모든 샘플은 EDTA(Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden)의 존재 하에 6000×g, 4℃에서 5분 동안 즉시 원심분리되었고, 최종 농도는 2mM이었다. 혈장 샘플을 새 튜브로 옮기고 즉시 드라이아이스에 급속 동결한 다음 최종적으로 -80도에서 보관했습니다. 생체외 혈관 기능 실험(엽간 동맥 및 구심성 세동맥), 조직학( HE 및 PAS 염색), 세포자멸사 및 염증의 정량화(Tissue-Tek 최적 절단 온도(OCT) 화합물 포매 및 TUNEL 및 F4/80 염색에 대해 동결).

2.5. 질산염, 아질산염, cGMP, 크레아티닌, 혈액요소질소(BUN), 안지오텐신 II 측정

아질산염과 질산염은 앞에서 설명한 바와 같이 HPLC(ENO{0}})로 분석하였다[19]. 혈장 샘플(10ul를 Hamilton 주사기로 HPLC 시스템에 주입했습니다. 그 후, 역상/이온 교환 크로마토그래피에 의해 아질산염과 질산염을 분리한 후 카드뮴과 환원된 구리에 의해 질산염을 아질산염으로 환원시켰다. 아질산염은 Griess 시약을 사용하여 유도체화되어 디아조 화합물을 형성하고 540 nm에서 검출되었습니다. cGMP의 분해를 방지하기 위해 혈장을 PDE 억제제, BMX(3-Isobutyl-1methylxanthine; Sigma-Aldrich #I5879)가 들어 있는 튜브로 옮겨 최종 농도(10μM)를 얻었습니다. 그 후 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트(GE Healthcare #RPN226)로 cGMP를 분석하기 전에{10}} 정도에서 냉동 보관합니다.

혈장 및 소변 크레아티닌 수치는 Creatinine Colorimetric Assay Kits(Cayman Chemical, #700460 및 #500701)를 사용하여 검출되었습니다. 크레아티닌 청소율 공식(CLcr =Urinecrx Urine flow/Plasmacr)을 사용하여 GFR을 추정했습니다. BUN Colorimetric Detection Kit(Invitrogen, #EIA-BUN)를 사용하여 혈장 BUN 수준을 검출했습니다. Ang II ELISA kit(Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 혈장 및 신장 조직의 Ang 수치를 측정하였다. 그러나 조직 추출물의 제조 방법은 권장 사항과 약간 다릅니다. 50% EtOH에 용해된 10vol 50mM HCl을 조직에 첨가하고 100도에서 10분 동안 가열하고 10 000 xg 10분 동안 원심분리했습니다. 그 후 샘플을 동결하고 분석하기 전에{13}}도 보관했습니다. 모든 흡광도 판독은 Molecular Devices의 SpextraMax iD3에서 수행되었습니다.

2.6. 엽간 동맥의 분리 및 관류

신장은 희생 후 수확되었고 엽간 동맥이 분리될 때까지 얼음처럼 차가운 생리학적 염 용액(PSS)에 보관되었습니다. 신장 사이 동맥을 절개하고(길이 2mm)

이전에 설명한 PS가 있는 myograph 챔버(모델 62{14}} M, 덴마크 Myo Technology, 덴마크). 등척성 장력은 Powerlab 시스템(Powerlab 4/30, AD Instruments, Australia)으로 기록되었습니다. 장착 후, 혈관은 37도, pH 7.4에서 카보겐(95% O2, 5% CO2)으로 버블링되는 PS에서 20분 동안 평형을 이루었습니다. 그런 다음 동맥의 안정 장력은 이전에 설명된 대로 설정되었습니다[21]. Mulvany의 정규화 절차[22]에 따라. 두 번째 평형 후, 0.1 mol/L KCl을 적용하여 동맥 링 생존력을 평가했습니다.

2.7. 구심성 세동맥의 분리 및 미세 관류

C57BL/6 J 마우스를 흡입된 이소플루란으로 마취하고 이전에 설명한 대로 신장을 제거하고 빠르게 슬라이스했습니다[23-25]. 신장 조각을 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에 넣었습니다. 사구체가 부착된 단일 구심성 세동맥을 실체현미경으로 미세 해부하고 동맥으로 옮겼다.

도립 현미경의 무대에 있는 온도 조절 챔버. 사구체를 고정 마이크로피펫으로 고정하고 구심성 세동맥에 캐뉼러를 삽입하고 마이크로피펫 세트로 관류했습니다. 관류된 구심성 세동맥의 관강내 압력은 실험 동안 60mmHg로 유지되었습니다. 해부 및 다음 미세 관류 시간은 이전에 설명한 대로 마우스가 희생된 후 120분으로 제한되었습니다[26]. 37도에서 30분 평형 기간 후, Ang II에 대한 누적 용량-반응 곡선(10-12에서 10-8 mol/L)이 얻어졌습니다. Ang II의 각 농도를 2분 동안 관류하고 수축 반응을 기록한 다음 구심성 세동맥의 직경을 측정했습니다.

2.8. 조직학적 검사

신장 샘플을 채취하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정했습니다. 고정된 신장 조직을 파라핀에 포매한 후 조직학적 평가를 위해 슬라이스하고 헤마톡실린-에오신(H&E) 또는 과요오드산 쉬프(PAS)로 염색했습니다. 각 실험군에서 무작위로 선택된 4마리의 동물을 분석에 사용하였다. 각 섹션에서 무작위로 선택된 10개의 필드를 400배 배율로 캡처했습니다. 모든 형태 측정 분석은 블라인드 방식으로 수행되었습니다.

2.9. TUNEL 염색

TUNEL 염색에는 OCT가 포함된 신장 샘플을 사용했습니다. 6-μm 두께의 절편을 상온에서 15분 동안 20ug/mL 프로테이나제 K와 함께 인큐베이션하고 제조업체의 지침에 따라 Click-iTTM Plus TUNEL Assay(Invitrogen C10618, USA)를 사용하여 TUNEL 반응을 수행했습니다. 프로토콜이 끝나면 DAPI 염색이 수행되었습니다. 정량화를 위해 3마리의 동물과 이미지의 3가지 필드 영역(200 ×)을 무작위로 선택하고 Zeiss LSM800-Airy 공초점 현미경을 사용하여 사진을 찍었고, 양성 신호는 ImageJ/Fiji 소프트웨어를 사용하여 정량화하고 다음과 같이 계산했습니다. DAPI에 대한 긍정적인 신호의 비율.

2.10. 조직면역형광염색 및 공초점현미경(F4/80)

신장은 OCT(Tissue-Tek, Torrence, CA, USA)에서 동결되었고 섹션(6 μm)이 준비되고 추가 처리되었습니다. 동결된 절편을 1x PBS로 세척하고 PBS 중 2% BSA로 30분 동안 차단한 다음 항-F4/80(1:50, BIO-RAD Cl: A{11}})과 함께 4도에서 밤새 인큐베이션했습니다. 실온에서 1시간 동안 2차 항체(1:200 Cell signaling Tech #4417)로 처리한 다음 300nmol/L DAPI(4'{19}}diamidino{20}}phenyl로 대조염색) -indole, dihydrochloride, Invitrogen) 3분 동안. 면역형광 신호는 Zeiss LSM{23}}Airy 공초점 현미경으로 시각화되었습니다. 3마리의 동물과 이미지의 3가지 필드 영역(200×)이 무작위로 선택되었습니다. F4/80 포지티브 신호는 ImageJ/Fiji 소프트웨어를 사용하여 정량화되었으며 DAPI에 대한 포지티브 신호의 비율로 계산되었습니다.

2.11. 세포 배양

쥐 사구체 내피 세포(GEC)(DSMZ ACC262, Germany)를 RPMI1640(Gibco 21870-076) 배지에서 10% 소태아혈청과 2m ML-글루타민(Gibco 25030-082), 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 배지에서 배양했습니다. (50 mg/L, Gibco 15140-122). 세포는 5% CO2의 가습된 대기에서 37도로 유지되었습니다. 저산소증 실험에서 세포는 37℃에서 2시간 동안 1% 산소가 있는 챔버에서 무혈청 배지 대신 HBSS(Gibco 14025-092)에서 배양되었습니다. 세포를 hyp-oxia 전에 30분 동안 아질산염(10μM, xanthine oxidoreductase(XOR) 억제제 febuxostat(100nM) 포함/없음)과 함께 사전 인큐베이션했습니다. 세포 생존율은 PrestoBlue⑧ assay(Invitrogen, A13261, A13262)로 평가하였고, 세포사멸은 Trypan Blue Exclusion assay(Sigma, T{24}} ML)로 평가하였다.

2.12. 미토콘드리아 ROS 검출

미토콘드리아 과산화물 수준은 형광 염료(MitoSOXTM, Invitrogen M36008)로 검출되었습니다. 처리 후, 내피 세포를 37도에서 10분 동안 배양 배지에서 2 μmol/L MitoSox와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 1x HBSS로 두 번 세척하고 형광 신호를 측정하고(SpectraMax iD3 판독기, Molecular Devices, USA) 세포 생존율로 정규화했습니다.

2.13. 면역블롯팅 분석

동결된 신장 샘플 또는 내피 세포는 10mmol/L Tris-HCl pH 8, 150mmol/L NaCl, 5mmol/L EDTA, 60mmol/L N-옥틸-글루코시드, 1% Triton X를 포함하는 완충액에서 용해되었습니다.{9 }}, 프로테아제 억제제 칵테일 및 단백질 포스파타제 억제제. 세포 또는 조직 용해물을 4도에서 10,{12}} xg에서 5분 동안 원심분리했습니다. 상층액/단백질을 새 튜브로 옮기고 Bio-Rad를 사용하여 정량화했습니다.

단백질 분석. 동등한 양의 단백질을 포함하는 단백질 추출물은 {0}% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석했습니다. 단백질을 300mA에서 1시간 동안 immobilon polyvinylidene difluoride 멤브레인으로 옮겼습니다. 멤브레인은 5% 무지방을 함유하는 20mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl 및 0.1% Tween 20(TBS-T)에서 차단되었습니다. 분유를 1시간 동안 처리하고 anti-TFAM(1:2000, ab131607), anti-OXPHOS(1:1000, ab110413), anti-vinculin(1:5000, ab129002)(Abcam Cambridge, UK) 및 항 -Cleaved caspase-3 (1:1000, #9664)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). 면역블롯 분석을 위한 모든 2차 항체는 Cell Signaling Technology의 제품이었습니다. 웨스턴 블롯의 경우 MW 마커가 있는 자르지 않고 주석이 달린 전체 길이 이미지가 보충 파일에 표시됩니다.

2.14. 통계 분석

그룹 간의 다중 비교는 one-way 또는 two-way ANOVA에 이어 권장된 사후 테스트로 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 모든 통계 계산은 Graphpad Prism 8.0을 사용하여 이루어졌습니다. 통계적 유의성은 p로 정의되었습니다.<>