제2부: Euphorbiae Ebracteolatae Radix의 총 디테르페노이드의 항악성 복수 효과는 신장에서 PKC 활성을 억제함으로써 아쿠아포린의 변형에 기인합니다

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우리는 신장이 인체에서 가장 중요한 기관이라는 것을 알고 있습니다. 신장이 좋지 않으면 신장에 영양을 공급해야 합니다. 신장에 영양을 공급하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 어떤 사람들은 먹을 것이다.시스탄체신장에 영양을 공급합니다. Cistanche는 알칼로이드가 풍부하고,에키나코사이드, 버바스컴 배당체결정성 중성 물질, 아미노산, 미량 원소, 비타민 및 기타 성분. Cistanche는 또한 다음과 같은 효과로 순환계를 조절할 수 있습니다. 허혈성 심근을 보호합니다. 혈중 지질을 낮추고 죽상 동맥 경화증에 저항하며 혈전증에 저항합니다. 말초 혈관 저항을 줄이고 말초 혈관을 확장하며 혈압을 낮춥니다. 간을 보호하고 지방간을 저항하십시오.

3. 토론

EER은 역사적으로 한의학에서 복부 팽만과 부종의 치료에 사용되었습니다[1]. 이 연구에서, EER의 항복수 효과는 H22 종양 세포-보유 복수 마우스를 사용하여 조사되었다. 악성 복수 마우스는 종양 및 복수 치료 연구에 널리 사용됩니다[21,22]. 우리의 결과는 EER과 TDEE가 모두 복수의 양을 크게 줄일 수 있는 반면 NTDEE는 효과가 없음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 TDEE가 EER의 항복수 활성 분획임을 나타내었다. 이전 연구에 따르면 EER의 디테르페노이드는종양 세포시험관 내 [5,23]. 그러나 이 연구에서는 종양 세포의 생존 능력, 세포 주기 또는 종양 세포의 세포 사멸에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 불일치에 대한 가능한 이유에는 용량의 차이와 생체 내 및 시험관 내 활동 사이의 빈약한 상관 관계가 포함될 수 있습니다. TCM은 EER이 주로 소변과 대변의 배설을 빠르게 조절함으로써 부종의 치료에 효과적이라는 견해를 가지고 있습니다[6]. 따라서 우리는 TDEE가 복수 쥐의 소변 무게와 대변 수분 함량에 미치는 영향을 분석했습니다. 소변 무게와 복수액 무게는 모두 3g 및 0.6g 생약초/kg의 용량에서 TDEE의 영향을 받은 반면 대변 수분 함량은 3g 생약초/kg에서만 증가하므로 TDEE는 주로 신장에서 물의 재흡수를 감소시켜 복수의 양을 감소시킵니다. 신장의 수분 재흡수는 체수분 항상성의 유지에 중심적인 역할을 한다[16]. AQP는 신장이 물을 재흡수하고 소변을 농축하는 주요 채널을 제공합니다[24]. 결과적으로 AQP 발현에 대한 연구는 복수를 감소시키는 메커니즘을 제공할 수 있습니다.

다양한 AQP는 다양한 영역에서 표현됩니다.신장.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>사구체 여과액에서 수분 흡수의 70%[16]. AQP2, AOP3 및 AOP4는 수분 균형과 소변 농도를 조절하는 중요한 부분인 집합관에서만 독점적으로 발현됩니다[16]. 현재 연구에서 TDEE는 마우스 신장에서 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 단백질 발현을 감소시켰습니다. 이러한 발견은 시험관 내 세포 실험 결과에 의해 확인되었다. TDEE에서 주요 디테르페노이드의 AQP 억제 활성은 근위 세뇨관과 집합관의 세포주에서 평가되었습니다. 결과는 TDEE의 디테르페노이드가 HK{10}} 및 mIMCD3 세포에서 AQP 단백질과 mRNA 발현 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

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각 디테르페노이드의 AQP 단백질 및 mRNA의 상대적인 발현 수준을 대조군과 비교하였다.신장세뇨관은 물 재흡수의 중요한 구성 요소입니다. 4가지 디테르페노이드 중 ent-abietane diterpenoids jolkinolide B(TDEE의 1269%)는 HK-2 세포에서 AQP1 조절에 가장 강력한 영향을 미쳤습니다. 이를 화합물 2의 구조와 비교하면, 졸키놀리드 B(화합물 3)는 C-11 및 14 위치에 2개의 에폭시 고리를 갖는다. C-11 및 14 위치에 에폭시 고리가 각각 전환되었을 때 화합물 2의 수산기와 이중 결합으로 AQP1의 억제 활성이 사라졌다. 소변 농도는 주로 신장 집합 세뇨관에서 발생합니다. mIMCD3 세포의 결과는 로산 디테르페노이드 화합물 4 및 노르디테르페노이드 락톤 화합물 5(각각 TDEE의 9.16% 및 39.26%를 차지함)가 AQP2, AQP3 및 AQP4 발현에 대한 가장 강력한 억제 효과를 갖는 것으로 나타났습니다. ent-abietane diterpenoid의 억제 효과는 이 두 종류의 diterpenoid에 비해 약했다. 신장의 다양한 AOP에 대한 다른 유형의 디테르페노이드의 억제 효과는 동일하지 않았으며, 이는 디테르페노이드의 화학 구조 및 각 화합물에 대한 AQP의 반응 시간의 변화로 인한 것일 수 있습니다. 전반적으로, 이러한 디테르페노이드는 AQP의 상승적 억제 효과를 부여할 수 있습니다. 이러한 디테르페노이드의 활성은 시험관 내에서 추정되었기 때문에 생체 내 대사 후 이들 화합물의 활성은 여전히 ​​불분명하므로 추가 조사가 필요합니다.

여러 연구에서 PKC와 PKA가 AQP[{0}}]의 조절에 작용한다고 제안했습니다. PKC는 다양한 세포 신호 전달에 관여하는 세린/트레오닌 키나아제 계열입니다[26]. PKC 계열에는 여러 isoform이 포함되어 있습니다[26]. 활성화 후, PKC는 세포질에서 원형질막으로 전위되고, 디아실글리세롤(DAG)에 결합하고, 후속적으로 일련의 생리학적 변화를 유도한다[27]. 세포질에서 원형질막으로의 PKC 전위는 PKC 활성화의 지표이다[28]. DAG는 막 포스파티딜이노시톨-4,{6}}비스포스페이트(PIP2)[27]의 PLC 촉매 가수분해에 의해 생성됩니다. 동물 실험에서 우리는 막 분획에서 PKCo와 PKC의 발현 수준을 측정했습니다. 동시에 우리는 PKC의 상류 단백질의 변화도 감지했습니다. 결과는 TDEE가 세포막에서 PKC의 발현을 감소시키고 PKC의 활성을 억제함을 시사하였다. 그러나 PLC의 인산화 수준에 대한 TDEE의 영향은 관찰되지 않았습니다. TDEE는 PKC에 직접 결합하여 PKC의 활성화를 억제할 수 있습니다. PKA 효소 활성은 주로 촉매 서브유닛과 홀로효소 복합체를 형성하는 조절 서브유닛에 의해 제어됩니다[29] 촉매 서브유닛의 방출은 PKA 활성화의 특징입니다[29]. 우리는 TDEE 치료가 PKA 활성화에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다. 신장에서 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 억제가 PKC 신호의 활성화 차단을 통해 매개되는지 여부를 조사하기 위해 PKC 작용제로 PMA를 사용하여 HK에서 AOP1, AOP2, AQP3 및 AQP4의 발현을 방해했습니다{ {19}} 및 mIMCD3 세포. 우리의 결과는 유페브락테올라틴 A(TDEE의 디테르페노이드)가 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 발현 수준을 감소시키는 것으로 나타났습니다.신장 세포. AOP1, AOP2, AOP3 및 AQP4 발현의 유페브락테오라틴 A 유도 억제는 PMA에 의해 차단되었습니다. 따라서, 우리는 TDEE가 PKC의 활성화를 억제함으로써 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 발현을 조절했다고 추론한다. PKC isoforms는 많다; TDEE는 또한 추가 연구를 기다리는 다른 동형을 억제함으로써 AQP 발현을 조절할 수 있습니다. 현재까지 AQP 발현을 조절하는 PKC의 하류 분자는 잘 이해되지 않고 있습니다. 다음 단계에서는 PKC의 다운스트림 규제 메커니즘에 초점을 맞출 것입니다.

요약하면, TDEE는 복수에 대한 EER의 활성 부분입니다. TDEE는 ent-abietane, Rosane 및 norditerpene lactones 유형과 같은 디테르페노이드로 구성됩니다. TDEE 및 디테르페노이드는 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4의 발현 수준을 감소시켜 복수를 해결함으로써 신장에서 물의 재흡수 및 농도를 억제할 수 있습니다. TDEE에 의한 신장에서의 AQP1, AQP2, AQP3 및 AQP4 발현의 억제는 PKC 활성화의 억제와 관련이 있습니다. 이 연구는 EER의 임상 적용과 이뇨 및 항복수 효과를 부여하는 후보 약물의 식별에 대한 기초를 제공할 수 있습니다.

4. 재료 및 방법

4.1. 화학물질 및 시약

알부민 분석 키트는 Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute(Nanjing, China)에서 구입했습니다. HPLC 등급 아세토니트릴은 Media Co.(Anqing, China)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)는 HyClone(Logan, UT, USA)에서 입수했습니다. 비필수 아미노산이 포함된 최소 필수 배지(MEM NEAA) 및 태아 소 혈청(FBS)은 Procell Life Science & Technology Co., Ltd.(중국 우한)에서 입수했습니다. 토끼 항-AQP1 및 AQP3 항체는 EnoGene Co., Ltd.(중국 난징). 토끼 항 AQP2, AQP4 및 마우스 항 액틴 항체는 Zen BioScience Co., Ltd.(중국 청두)에서 구입했습니다. Rabbit-anti-PKC , PKC , PLC 및 phospho-PLC(Tyr783) 항체는 Affinity Biosciences Co., Ltd.(Changzhou, China)에서 구입했습니다. 라디오 면역 침전 분석 완충액(RIPA 완충액), 세포 주기 및 세포 사멸 검출 키트는 Yifeixue Biotechnology(중국 난징)에서 제공했습니다. BCA 키트는 Beyotime Biotechnology(중국 상하이)에서 구입했습니다. TRIzol 시약 완충액은 Thermo Fisher Scientific(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. PVDF 멤브레인은 Millipore(Bedford, MA, USA)에서 구입했습니다. cDNA 합성 키트는 YEASEN Biotech Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다.

4.2.식물 재료

Euphorbia ebracteolate Hayata의 뿌리인 EER은 2017년 9월 15일 Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd.(중국 보저우)에서 구입하여 Jiangsu Institute for Food and Drug Control의 Harbin Hu 교수로부터 인증을 받았습니다. 상품권 표본(WH20170915)은 난징 중의약대학 약학대학 한의학 식물 표본실에 기탁되었습니다.

4.3. TDEE의 추출 및 분리 및 디테르페노이드의 정제

EER은 기계식 그라인더를 사용하여 분쇄되었습니다. 분말(100g)을 디클로로메탄으로 6시간 동안 속슬렛 추출기에서 연속적으로 추출하였다. 그 후, 추출물을 감압 농축하여 디클로로메탄 추출물을 얻었다. 디클로로메탄 추출물을 40% 및 90% 메탄올로 순차적으로 용리시키면서 ODS 상에서 컬럼 크로마토그래피(CC)에 적용하였다. 90% 메탄올의 용리액을 수집하고 농축하고 건조하여 TDEE(2.4g)를 제조했습니다. 추출된 잔류물을 병합하고 95% 에탄올로 3회 추출하였다. 그런 다음 추출물을 합하고 증발 건조시켜 NTDEE(15.6g)를 얻었다. EER 분말(100g)에서 TEER(19.8g)을 95% 에탄올로 추출하였다. 이 추출물은 동물 실험에 사용되었습니다.

TDEE의 주요 화합물은 다음 과정을 사용하여 분리되었습니다. EER(2{24}} kg)의 뿌리를 분말화하고 상온에서 72시간 동안 디클로로메탄으로 3회 침용하여 추출하였다. 디클로로메탄 추출물을 얻고 회전 증발기를 사용하여 농축하였다. 잔류물을 CH, Cl 및 MeOH(100:{3}}:100)로 극성을 증가시키는 구배 시스템을 사용하여 실리카 겔 상에서 CC에 적용하여 8개의 분획(Fr. 1-Fr.8)을 얻었다. . Fr.4는 석유 에테르-EtOAc(50:1에서 1:1)로 용리되는 실리카 겔 컬럼에 적용되고, 이어서 MeOH-H, O로 60%에서 80%로 용리되는 역상 ODS C에 적용되어 화합물 5를 생성했습니다. 및 6. Fr.5를 석유 에테르-EtOAc(35:1 내지 0:1)로 용리시키면서 실리카 겔 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 7개의 하위 분획(Fr.5.{28}}Fr.5.7)을 수득하였다. Fr.5.3을 MeOH-H2O(75%에서 100%로)로 용리하는 ODS CC로 분리한 다음,

반 정제용 HPLC(MeOH-H2O, 75%에서 1{29}}0%)에 의해 화합물 4를 제공합니다. Fr.5.4를 석유 에테르-EtOAc(30:1에서 30:1에서 5:1), 이어서 Sephadex LH{13}}(MeOH:CH2Cl, 1:1) 및 반-분취 HPLC(MeOH-H, O, 60%에서 95%)를 수행하여 화합물 3.Fr을 얻었다. 5.6을 40:60에서 100:0까지의 MeOH-H2O 구배로 용리한 ODS CC로 정제한 다음 Sephadex LH{30}} CC(CH2Cl-MeOH, 1:1)로 정제하여 화합물 1 및 2를 생성했습니다.

4.4. 생체 내 실험

4.4.1.동물 및 실험 설계

ICR 수컷 마우스(체중: 18-22 g)는 Qing Long Shan Animal Breeding Farm(Nanjing, China)에서 입수했습니다. 마우스는 12시간 명암 주기실의 일정한 온도(22±1도)에서 적당한 습도(50% ±5%)의 표준 실험실 우리에 유지되었습니다. 모든 동물은 실험 기간 동안 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 실험 프로토콜은 난징 중의과 대학 동물 윤리 위원회(중국 난징)의 승인을 받았습니다.

총 90 수컷 마우스를 무작위로 9개 그룹(n= 10)으로 나누었습니다. 대조군에는 0.2mL 식염수를 복강 내 주사했습니다. 다른 그룹의 마우스에는 0.2 mL 부피의 1 × 1{{1{12}}}} 정도 H22 세포를 복강내 접종했습니다. 모든 약물은 0.5% (wo/o)나트륨 카르복실 메틸셀룰로오스(0.5% Na-CMC)가 포함된 물에 현탁되었습니다. 24시간 후, 마우스는 8일 동안 다음 계획에 따라 매일 위관 영양법을 통해 처리되었습니다. 정상 및 모델 그룹에는 0.5% Na-CMC가 투여되었습니다. Furosemide(6mg/kg)는 이뇨작용에 의해 복수와 같은 부종성 질환 치료에 광범위하게 사용되기 때문에 양성대조군으로 선택되었다. TEER, TDEE 및 NTDEE 그룹에는 해당 EER 추출물(3.0 및 0.6g 생약초/kg)이 투여되었습니다.

4.4.2.복수액 중량, 소변 중량 및 대변 수분 함량 분석

모델 및 처리된 그룹의 마우스를 희생시키고 복강에서 복수액을 수집하였다. 그런 다음 유체를 전자 저울에서 칭량했습니다.

마우스를 개별 케이지에 수용했습니다. 대변을 칭량하고 밀봉된 바이알에 수집하였다. 5시간 후, 축축한 대변이 담긴 바이알의 무게를 쟀다. 그 다음, 바이알을 105도에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 분변 수분 함량( 퍼센트 )=((습한 대변을 포함하는 바이알의 중량-건조 대변을 포함하는 바이알의 중량)/(습한 대변을 포함하는 바이알의 중량 - 바이알의 중량))×100.

요배설량은 기존의 방법을 변형하여 측정하였다[30]. 마우스를 개별 비커에 보관했습니다. 비이커는 입에 금속망으로 덮인 다음 초흡수성 폴리머(SAP)가 포함된 플라스틱 접시에 뒤집혔습니다. 이 테스트에서는 대변을 청소했습니다. 5시간 후, SAP와 소변이 들어 있는 플라스틱 접시의 무게를 쟀습니다. 소변 무게를 결정하기 위해 다음 방정식이 사용되었습니다. SAP를 포함하는 플라스틱 접시의 소변 무게(g)=및 SAP를 포함하는 플라스틱 접시의 소변 무게.

4.4.3. 혈청 알부민 분석

모든 그룹의 혈액은 궤도 천자에 의해 수집되고 4도에서 10분 동안 5000xg에서 원심분리되었습니다. 혈청 알부민은 알부민 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다.

4.4.4. 종양 세포 생존력, 주기 및 세포자멸사 분석

마우스를 희생시킨 후 종양 세포를 포함하는 복수액을 복강에서 채취하고 즉시 식염수로 20배 희석했습니다. 종양 세포의 생존력은 0.4% 트립판 블루 염색으로 평가하고 자동 세포 계수기(ALIT Life Science Co., Ltd., Shanghai, China)에서 계수했습니다.

희석된 세포 현탁액(0.5mL)을 4℃에서 5분 동안 1000g에서 원심분리했습니다. 세포를 수집하고 4℃에서 밤새 차가운 70% 에탄올에 고정했습니다. 고정 후 종양 세포를 PBS로 2회 세척하고 원심분리한 후 RNase A 용액(100μL)과 함께 37도에서 30분간 배양하였다. 마지막으로, 세포를 400μL propidium iodide와 함께 배양했습니다.

(PI) 어둠 속에서 4도에서 30분 동안 300-메쉬 나일론 막을 통해 여과합니다. Accuri C6 Flow Cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 여러 단계의 세포 비율을 분석했습니다.

Annexin V-FITC/PI Apoptosis 키트를 사용하여 종양 세포의 세포 사멸을 검출했습니다. 희석된 세포 현탁액(0.5 mL)을 PBS에서 두 번 세척하고 4도에서 5분 동안 1000g에서 원심분리했습니다. 세포를 수집하고 100 uL 결합 완충액에 재현탁시킨 다음 5 ㎕ Annexin V-FITC 및 10 ㎕ PI염색 용액과 함께 실온에서 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 400μL 결합 완충액을 각 튜브에 첨가했습니다. Accuri C6 Flow Cytometer를 이용하여 세포사멸을 검출하였다.

4.4.5. 신장에서 AQP, PKC, PKA 및 PLC의 웨스턴 블롯 분석

마우스를 희생시킨 후, 신장을 분리하고 급속 동결한 다음 단백질 발현 분석을 위해 -80도에서 보관했습니다. 조직 샘플을 RIPA 용해 완충액에서 균질화하였다. -20도에서 밤새 보관한 후, 조직 용해물을 12,{5}} xg에서 10분 동안 원심분리한 후 수집했습니다. 원심분리 후, 총 단백질 및 인산화된 단백질의 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Membrane Protein Extraction Kit를 사용하여 신장에서 막 단백질을 추출했습니다. 단백질 농도는 BCA 키트를 사용하여 결정되었습니다. 단백질 용액을 끓는 물에서 5분 동안 변성시키고 5x 로딩 완충제와 혼합하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고, 이어서 소 혈청(BSA)에서 5% 알부민으로 2시간 동안 차단했습니다. 차단 후 막을 AOP1(1:2000), AOP2(1:1000), AQP3(1:2000), AQP4(1:1000), PKC(1:2000), PKC(1:2000)에 대한 1차 항체와 함께 배양했습니다. 2000), PKA(1:2000), PLC(1:2000), p-PLC(1:800) 및 -actin(1:5000)을 4도에서 하룻밤 동안. 그런 다음 멤브레인을 0.1% Tween{42}}(TBST)이 포함된 Tris-buffered saline으로 세척하고, 1차 항체는 양고추냉이 peroxidase-conjugated 2차 항체(1:5000)로 검출했습니다. 단백질은 화학발광 시약과 Tanon 5200 화학발광 이미징 시스템(Tanon, Shanghai, China)으로 시각화되었습니다. 얼룩 밴드는 ImageJ를 사용하여 농도계에 의해 정량화되었습니다.

4.5. TDEE에서 6가지 주요 디테르페노이드의 결정

Euphoria G, ent{0}}l -hydroxyabicta-8(14),13(15)-dien-16,12-olide,jolkinolide B, EU-phebracteolatin A, Fischer A 및 jolkinolide E를 적절한 농도로 아세토니트릴에 용해시켰다. 또한 TDEE를 아세토니트릴에 용해시켜 HPLC를 사용하여 성분 함량을 검출하였다. HPLC 분석은 포토다이오드 어레이 검출기(Waters, Milford, CT, USA)와 Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼(4.6mm x 250mm, 5μm)이 장착된 Waters 2695 분리 시스템에서 수행되었습니다. 이동상은 0.1% 포름산수(A)와 아세토니트릴(B)로 구성되었습니다. 용매는 다음 기울기 프로그램을 사용하여 1mL/분의 유속으로 전개되었습니다.0-25 min, 65% B;25-40 min,65% -85% B;{{25 }} 분, 85% -100% B. 주입 부피는 10μL였습니다. 컬럼 온도는 30도, 265mm 파장을 사용하였다.

4.6. 체외 실험

4.6.1. 세포 배양

HK{0}} 및 mIMCD3 세포는 Procell Life Science & Technology Co., Ltd.(중국 우한)에서 구입했습니다. 모든 세포는 5% CO2 분위기의 인큐베이터에서 37도, 90% confluency가 될 때까지 배양한 다음 다른 화합물로 처리하고 실험을 위해 관리했습니다. HK-2 세포는 10% FBS와 1% 항생제가 보충된 MEM NEAA에서 성장한 반면, mIMCD3 세포는 10% FBS와 1% 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 성장했습니다.

4.6.2. AQP의 웨스턴 블롯 및 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR) 분석

HK{0}} 및 mIMCD3 세포를 처리 전 24시간 및 12시간 동안 6-웰 플레이트에 접종했습니다(5×105/웰). 세포는 37도의 인큐베이터인 5% CO에서 8시간 동안 다른 화합물로 처리되었습니다. 0.1% 디메틸 설폭사이드로 처리된 세포를 비히클 대조군으로 사용하였다. 처리 후, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, RIPA 용해 완충액에서 스크래핑하여 수확한 다음 용해시켰다. -20도에서 밤새 보관한 후, 용해물을 12,{15}} xg에서 10분 동안 원심분리하여 정화하고, 상등액을 수집하여 웨스턴 블롯 분석에 사용했습니다. 이 문서의 동물 실험에서 이전에 설명한 대로 웨스턴 블롯을 수행했습니다.

총 RNA의 분리를 위해. 8시간 동안 다른 화합물과 함께 배양한 후, 세포를 PBS로 세척하고 TRIzol 시약 완충액에 용해시키고 RNA를 제조사의 지침에 따라 분리했습니다. cDNA 합성 키트를 사용하여 동일한 양의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. gRT-PCR을 위한 반응 혼합물은 cDNA, 표 1에 언급된 정방향 및 역방향 프라이머, DEPC 물 및 SYBR 그린 마스터 믹스를 첨가하여 제조했습니다. Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 기기는 유전자 발현 분석을 위해 사용되었습니다. PCR 조건은 95도에서 5분 동안 초기 변성 후 95도에서 10초, 60도에서 34초의 40주기입니다. 마지막으로, PCR 데이터는 Microsoft Excel 스프레드시트에서 이중 델타 CT 방법으로 분석되었습니다.

4.6.3. 신장 세포에서 AQP 단백질 발현에 대한 PKC 작용제 PMA의 효과

HK{0}} 및 mIMCD3 세포를 5×10도 세포/웰의 밀도로{2}웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 세포 부착 후, 세포를 1.5시간 동안 200nM PKC 작용제(PMA)의 유무에 관계없이 사전 인큐베이션한 다음, 8시간 동안 유페브락테올라틴 A(2.5μM)로 처리했습니다. 전체 및 막 단백질 추출 및 웨스턴 블로팅 분석은 이전에 자세히 설명한 대로 수행되었습니다.

4.7.통계분석

통계 분석에는 SPSS 19.{1}} 분석 소프트웨어를 사용했습니다. 데이터는 일원 ANOVA 또는 순위 합 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 수치 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되었습니다. p와의 차이점<0.05 were="" considered="" statistically="">