2부: 호모아르기닌은 산화질소 합성효소와 무관하게 당뇨병성 신장병을 개선합니다-3

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3. 결과

3.1 마우스 특성

야생형 당뇨병 및 NOS{0}} 마우스는 24주 후 비당뇨병 마우스에 비해 체중이 유의하게 적었으며, 이는 당뇨병 NOS3-7 마우스에서 호모아르기닌에 의해 유의하게 증가되었습니다. 혈당은 모든 당뇨병 야생형과 NOS{4}}마우스에서 더 높았습니다. 신장/체중 비율은 당뇨병 NOS3-7 마우스에서 유의하게 더 높았지만 호모아르기닌 처리는 당뇨병 NOS3-마우스에서 심장/체중 비율을 유의하게 감소시켰습니다. 수축기 혈압은 NOS{7}}마우스에서 야생형에 비해 유의하게 증가했으며 감소하는 경향을 보였습니다. 당뇨병 NOS3-/마우스에서 호모아르기닌 치료에 의해 유의미하지는 않지만. (1 번 테이블).

3.2 호모아르기닌은 당뇨병 NOS3-/- rmice에서 알부민뇨를 감소시킵니다.

당뇨병은 정상과 비교하여 야생형 및 NOS{0}}/마우스 모두에서 알부민뇨를 유의하게 증가시켰으며, 그 효과는 호모아르기닌 처리에 의해 유의하게 감소되었습니다(그림 1). 야생형 마우스에서 관찰된 결과는 DN에서 호모아르기닌의 보호 효과에 대한 이전 연구(Wetzel et al., 2019)와 일치하므로 이 연구의 나머지 부분에서는 NOS3-/마우스만 분석했습니다.

3.3 Homoarginine은 당뇨병 NOS{2}} 마우스에서 혈장 BUN 수치를 감소시킵니다.

다음으로 NOS{0}} 마우스의 혈장 BUN 수치에 대한 호모아르기닌 투여 효과를 평가했습니다. 혈장 BUN 수준은 당뇨병 마우스에서 증가하고 호모아르기닌 처리에 의해 감소되었습니다(그림 2).

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3.4 NOS1 및 NOS2 발현은 당뇨병 NOS{4}}마우스에서 변경되지 않습니다.

다음으로, 당뇨병 및/또는 호모아르기닌이 NOS{0}}마우스의 신장에서 다른 NOS 동형의 발현을 변경하는지 확인했습니다. 우리의 결과는 당뇨병이나 호모아르기닌이 NOS3-7 마우스에서 NOS1 또는 NOS2 유전자 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다(그림 3).

3.5 Homoarginine은 당뇨병 NOS{2}}마우스에서 사구체 병리 및 섬유증을 감소시킵니다.

PAS로 염색된 사구체 단면을 분석한 결과 당뇨병이 있는 NOS{1}}마우스는 비당뇨병 NOS3-마우스에 비해 사구체 부피, 사구체 세포질, 사구체 기저막(GBM) 두께 및 사구체 손상 지수 증가와 관련이 있었습니다. 호모아르기닌 처리를 사용하면 효과가 크게 감소했습니다(표 2 및 그림 4a). 또한, 당뇨병 NOS3 마우스는 당뇨병 24주 후 Masson's trichrome(그림 4b,c) 염색 섹션에서 증가된 섬유증 비율(ImageJ 사용)을 표시했으며, 이는 호모아르기닌 처리에 의해 감소되었습니다.

3.6 Homoarginine은 당뇨병 NOS3-/- 마우스에서 신장 섬유증 마커를 감소시킵니다.

Real-time PCR 분석은 NOS{6}}/마우스에서 당뇨병 후 신장 피브로넥틴(그림 5a), TGF(그림 5b), 평활근 액틴(그림 5c) 및 E-카드헤린(그림 5d)의 현저한 증가를 보여줍니다. 호모아르기닌 보충은 이러한 섬유증 마커의 증가를 상당히 둔화시켰습니다.

3.7 호모아르기닌은 당뇨병 NOS3-/마우스에서 사구체 대식세포 침윤을 감소시킵니다.

당뇨병 NOS3-/마우스는 당뇨병이 없는 마우스와 비교하여 당뇨병(그림 6) 후 침투성 신장 대식세포의 현저한 증가를 나타냈습니다. Homoarginine 치료는 당뇨병 24주 후 대식세포 침윤을 유의하게 감소시켰습니다.

3.8 Homoarginine은 당뇨병이 있는 쥐의 심장 섬유증을 감소시키고 심장 기능을 향상시킵니다. NOS3-7-r

당뇨병 NOS{0}}/마우스는 당뇨병 24주 후 Masson's trichrome(그림 7a,b) 염색 섹션에서 증가된 섬유증 비율(ImageJ 사용)을 나타냈으며, 이는 호모아르기닌 처리에 의해 감소되었습니다. 또한, 당뇨병 NOS3-7마우스는 당뇨병 22주에 비당뇨 대조군과 비교하여 박출률(EF) 및 부분 수축(FS)(그림 7c-e)이 유의하게 감소했으며 호모아르기닌을 사용하면 효과가 크게 회복되었습니다. 치료.

3.9 Homoarginine은 당뇨병 Ins2Akita 마우스에서 MCU 복합체와 그 조절기를 회복시킵니다.

우리의 이전 간행물(Wetzel et al., 2019)에서 파생된 신장 샘플은 MCU 복합체 및 해당 조절기에 대해 분석되었습니다. 당뇨병 마우스는 Ins2Ak 마우스에서 18주령의 비당뇨 대조군과 비교하여 신장 MCU 및 그 양성 조절인자 MCUR1 발현이 유의하게 증가했으며 신장 MCU 음성 조절자 MICU1 발현(그림 8)은 감소했습니다. 호모아르기닌 보충제로 치료한 당뇨병 마우스는 MCU 복합체와 그 조절기를 정상 수준으로 회복시켰습니다.

3.10 호모아르기닌은 당뇨병 NOS에서 MCU 복합 마우스와 그 조절자를 회복시킵니다3-7-

당뇨병 NOS3-/마우스는 당뇨병 24주 후 비당뇨 대조군과 비교하여 음성 조절인자 MICU1 발현(그림 9b,c)의 유의미한 감소와 함께 신장 MCU(그림 9a)에서 상당한 증가를 보였습니다. , 반면에 호모아르기닌 보충제로 치료한 당뇨병 NOS{5}}마우스는 MCU 복합체와 그 음성 조절자를 정상 수준으로 회복시켰습니다.

4 토론

당뇨병성 신병증은 당뇨병의 중요하고 해결되지 않은 합병증으로 남아 있습니다. 우리의 이전 간행물은 호모아르기닌 보충제가신장당뇨병 마우스 모델에서 보호(Wetzel et al., 2019). 그러나 호모아르기닌이 이러한 효과를 매개하는 정확한 기전은 명확하지 않았습니다. 현재 연구에 따르면 호모아르기닌 보충은신장NOS3와 무관한 DN의 조직 보호는 궁극적으로 호모아르기닌이 DN에서 신장 및 심장 보호를 유도하는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 바꿀 것입니다. DN에서 호모아르기닌의 보호 효과는 미토콘드리아 기능 개선을 통해 매개될 수 있습니다.

NO의 생체 이용률 감소와 산화 스트레스 증가를 특징으로 하는 내피 기능 장애는 당뇨병(Creager et al., 2003) 및 DN(Goligorsky et al., 2001)의 특징적인 특징입니다. DN에서 NOS3 발현 및 작용의 역할은 논란의 여지가 있습니다. 따라서 NOS3가 낮거나 부족하면 DN을 악화시키는 것으로 나타났지만(Wang et al., 2011; Zhao et al., 2006), 최근 간행물(Natarajan et al., 2019)에서는 Ins2Aki 마우스에서 NOS3의 과발현이 DN을 악화시키는 것으로 나타났습니다. 신장 NO 생산/작용 증가보다는 NOS3 분리 및 산화 스트레스 증가를 통해. 호모아르기닌은 L-아르기닌을 증가시켜 NOS의 기질이 될 수 있기 때문에(Hecker et al., 1991; Moali et al., 1998), NO 작용/생성을 통해 그 효과를 매개할 수도 있습니다. 그러나 우리의 이전 간행물은 경구 아르기닌 보충이 놀랍게도 혈장 및 신장에서 아르기닌 수치를 성공적으로 증가시켰음에도 불구하고 당뇨병 마우스 모델에서 신장 손상의 마커를 예방하거나 감소시키지 않았다는 것을 보여주었습니다(You et al., 2014). 호모아르기닌 수치와 NO 생산 사이의 직접적인 상호작용은 논란의 여지가 있습니다. 호모아르기닌은 (a) 양이온성 아미노산 수송체(CAT)(Chafai et al, 2017; Hagos et al., 2006)에 의한 세포 흡수를 위한 아르기닌과 호모아르기닌의 경쟁에 의해 아르기닌으로부터 NO 합성을 감소시킬 수 있습니다. CAT, 차례로 아르기닌의 세포 유출을 증가시킬 수 있습니다. (c) NOS에 대한 호모아르기닌과 아르기닌의 경쟁에 의해(Pilz et al., 2015), 호모아르기닌은 이 효소에 대한 덜 효율적인 기질이지만(Moali et al., 1998; Zwan et al, 2013). 호모아르기닌이 아르기닌 가용성을 증가시켜 아르기나제의 억제에 의한 NO 합성을 증가시킬 수 있지만, 이는 호모아르기닌의 아르기나제에 대한 약한 친화성 때문에 가능성이 낮습니다(Marz et al, 2010). 그럼에도 불구하고, 호모아르기닌은 아르기닌에 비해 NOS에 대한 친화도가 약하더라도 NOS와 호모시트룰린으로 대사될 수 있기 때문에 NOS에 대한 기질 역할을 함으로써 NO 합성에 기여할 수 있습니다(Drechsler et al., 2011).

DN에서 호모아르기닌의 보호 효과 메커니즘을 조사하기 위해 NOS{0}}/와 야생형 한배 당뇨병 마우스 모델에서 호모아르기닌 보충이 신장 기능 장애, 사구체 조직병리학적 변화 및 대식세포 모집에 미치는 영향을 조사했습니다. 호모아르기닌 보충은 당뇨병 야생형 및 NOS{2}}마우스에서 당뇨병성 알부민뇨를 유의하게 개선하여 이전 발견을 확인시켜 주었으며(Wetzel et al,2019), 당뇨병성 NOS에서 사구체 병리 및 신장 섬유증 마커 발현 감소와 관련이 있었습니다{{ 5}}쥐.

종합하면, 우리의 결과는 DN에서 호모아르기닌의 보호 효과의 직접적인 역할을 나타내고 호모아르기닌이 NOS3와 무관하게 신장 조직 보호를 매개한다는 개념을 지지합니다. 심혈관 질환 이환율과 사망률은 모두 DN 환자에서 증가합니다. 심장에서 낮은 호모아르기닌 수치는 좌심실 비후 증가, EF 감소 및 NTproBNP 증가와 관련이 있습니다(Bahls et al., 2018). 반대로, 호모아르기닌 보충은 심근경색 후 심부전의 쥐 모델에서 심장 기능을 보존합니다(Atzler et al., 2017). 현재 연구에서 우리는 또한 심장 기능을 개선하고 심장 섬유증을 감소시키는 호모아르기닌의 보호 효과가 신장에 미치는 영향과 유사한 방식으로 NOS3 발현과 무관함을 보여줍니다. 그러나 혈압을 낮추는 경향을 고려할 때 DN에서 호모아르기닌의 혈역학적 효과를 배제할 수 없습니다. 중요하지는 않지만.

호모아르기닌 보호 효과의 메커니즘은 MCU 복합체와 그 조절기에 의해 조절되는 미토콘드리아 기능의 조절과 관련이 있는 것으로 보입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 신장 손상에서 중추적인 역할을 합니다(Brooks et al., 2009; Coughlan & Sharma, 2016; Hallan & Sharma, 2016; Long et al..2016; Sharma, 2015; Sun et al. 2008; Wang et al. .,2012;You et al.,2016;Yu et al., 2006; Zhan et al.,2013). 신장에서 내피 세포는 특히 미토콘드리아 기능 장애에 취약하고(Hong et al., 2012) 산화 스트레스에 기여합니다. 지속적인 에너지 고갈, 에너지 의존적 복구 메커니즘의 손상 및 신장 손상의 세포 사멸(Funk et al., 2010; Funk & Schnellmann, 2012).MCU는 미토콘드리아의 빠른 Ca' 흡수에 관여하는 다량체 복합체이며 심장 병리학에서 조절 장애(Liao et al., 2015; Luongo et al., 2015; Nemaniet al, 2018; Tomar et al, 2019; Woods et al, 2019). MCU 복합체에 의해 매개되는 미토콘드리아 Ca2와 흡수는 신호 전달, 생체 에너지 및 세포 사멸에 중요한 역할을 하며, 조절 장애는 여러 인간 질병과 관련이 있습니다. 족세포 사멸은 MCU 조절 장애와 관련이 있지만(Xu et al., 2018; Yuan et al., 2017), MCU 복합체의 역할과 DN에서 호모아르기닌 보충과의 상호 작용은 알려져 있지 않습니다. 당뇨병 마우스에 대한 우리의 현재 데이터는 호모아르기닌 투여가 DN에서 MCU의 발현을 유의하게 감소시키고, MCU-음성 조절자(MICU1)를 증가시키고, MCU-양성 조절자(MCUR1)를 감소시켰으며, 이 효과는 NOS3 발현과 무관함을 보여주었습니다. 따라서 우리는 미토콘드리아 Ca' 신호 전달과 DN에서 불리한 임상 결과 사이에 연관성이 있다고 추측합니다. 미토콘드리아 기능의 정상화는 DN 동안 산화 대사를 회복하는 데 필요합니다. 미토콘드리아 기능에 대한 호모아르기닌의 직접적인 영향을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

결론적으로, 우리 연구는 DN에서 호모아르기닌 보충제를 사용한 신장 및 심장 조직 보호의 메커니즘이 NOS3와 무관하며 미토콘드리아 기능 장애 개선에 의해 매개될 가능성이 있음을 처음으로 보여줍니다. 우리 연구의 결과는 궁극적으로 DN 치료에서 호모아르기닌을 증가시키도록 설계된 새로운 치료 개입을 초래할 수 있습니다.

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따라서 신장의 원기를 회복시켜야 하는 경우 시탕슈가 좋은 보충제이며, 다른 질환이 있는 경우 의사의 조언을 받아 사용하십시오.