식물화학적 분석, 체외 항증식, 항산화 제 1부

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배경:Rumex rothschildianus는 Polygonaceae 계통의 Rumex 속의 독특한 부분의 유일한 구성원입니다. 이 종은 전통적으로 음식과 다양한 질병의 치료에 사용되는 팔레스타인 고유의 매우 희귀한 작은 1년생입니다. 따라서, 현재 조사는 R. rothschildianus 잎의 4가지 용매 분획의 화학적 성분, 항산화제, 항-α-아밀라아제, 항-α-글루코시다아제, 예측 및 세포독성 효과를 스크리닝하는 것을 목표로 하고 있습니다.

행동 양식:R. rothschildianus 잎의 건조 분말은 극성이 다른 4가지 용매에서 추출되었습니다. 추출물의 성분을 결정하기 위해 여러 가지 정성적 및 정량적 식물화학적 테스트를 수행했습니다. 비색 분석은 페놀, 플라보노이드 및 탄닌의 정량적 측정에 사용되었습니다. 자궁경부암 세포주(HeLa) 및 유방암 세포주에 대한 MTS 분석을 통해 항산화제, 항-아밀라제, 항-α-글루코시다제 및 예상 억제 활성에 대한 추출물을 평가하기 위해 시험관 내 분석을 수행했습니다. (MCF7).

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결과:R. rothschildianus 잎의 아세톤 분획은항산화제활성, 플라보노이드 및 페놀류 함량이 가장 높기 때문에 ICso 값이 6.3±{2}}.4 ug/ml인 반면 Trolox의 경우 3.1±{6}}.9 ug/ml이며, 리파제 억제 활성 아세톤 분획은 26.3±{{1{18}}}}.6 ug/ml의 IC 값으로 가장 강력한 활성을 나타냈으며, 이는 orlistat 양성 대조군 IC 12.3 ug/ml와 비교되었습니다. 동일한 추출물은 각각 19.1±{22}}.7 ug/ml 및 54.9±0.3 ug/ml의 IC 값으로 α-아밀라아제 및 α-글루코시다아제의 가장 강력한 억제제였습니다. 각각 28.8, 37.1±0.3 ug/및 acarbose. 헥산 분획은 HeLa 세포의 99.9% 억제와 MCF7 세포의 97.4% 억제를 나타냈습니다.

결론:R. rothschildianus 잎의 아세톤 분획은 산화 스트레스 치료를 위한 생리활성 화합물의 공급원을 제공할 수 있습니다. 유사하게, 헥산 분획은 R. rothschildianus의 유망한 항종양 잠재력을 나타냅니다. 분명히, 이러한 초기 적응증은 잠재적 활성 화합물의 추가 정제가 필요하고 궁극적으로 그 효과를 결정하기 위한 생체 내 연구가 필요합니다.

키워드:Rumex rothschildianus, 항산화, 리파아제, 아밀라아제, Trolox, 식물화학, 항증식 활성

배경

식물은 고대부터 치료법으로 사용되어 왔습니다. 뿌리, 씨앗, 나무 껍질, 잎 및 꽃은 모두 치료 목적으로 사용되었습니다. 오늘날 합성 의약품을 사용할 수 있으며 광범위한 질병 치료에 효과적입니다. 그러나 일부 사람들은 여전히 인체에 덜 해롭다고 여겨지는 한약재를 선호합니다[1,2]. 약용 식물은 정의상 치료 활성을 갖는 식물화학적 화합물의 공급원입니다. 이러한 특성은 페놀, 테르페노이드 및 알칼로이드와 같은 다양한 2차 대사산물의 존재에 의존합니다[3]. Rumex rothschildianus Aarons. Polygonaceae 계통의 Rumex 속의 독특한 부분의 유일한 구성원입니다. 이 종은 매우 희귀한 작은 자웅동체 1년생이며 팔레스타인 고유종입니다. 평균 높이는 45cm이고 뿌리가 짧은 잎자루가 있는 직립 줄기가 특징이며, 기부는 짧고 끝은 뾰족합니다. 꽃의 지름은 3-4mm이고 암꽃은 지름이 약 2mm이고 돌기둥 모양의 막층이 있습니다[4]. 루멕스 종 터키의 여러 지역에 널리 퍼져 있으며 22종으로 대표됩니다. 가장 흔한 종 중 일부는 R. Patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus 및 R. caucasicus이며 고도 {{10 }} 해발 m. Rumex 속은 터키의 전통 의학에서 변비, 설사 및 습진과 같은 장애를 치료하는 데 널리 사용되었습니다[5, 6]. 속은 또한 완하제, 이뇨제, 해열제, 상처 치유 및 항염증 효과가 있습니다. 터키 동부의 많은 사람들은 Rumex spp.의 어린 잎을 사용합니다. 치즈의 방부제로서 뿐만 아니라 음식 향을 제공합니다[7].

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일부 종에 대해 보고된 항균 활성과 같이 Rumex 종에 대해 다양한 연구가 수행되었습니다. 카로티노이드, 토코페롤, 폴리페놀, 플라보노이드 및 아스코르브산과 같은 일부 생리활성 식물화학물질은 이전에 Rumex 대리 L에서 발견되었으며, 이는 항산화제 및 천연 해독제 역할을 합니다. 카로티노이드와 같은 항산화 파이토케미컬의 식이 섭취,페놀류, 그리고플라보노이드암, 심혈관 질환 및 산화 스트레스와 관련된 기타 건강 문제와 같은 인간의 비전염성 질병으로부터 보호할 수 있습니다[5, 8]. 유해한 자유 라디칼은 암, 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 백내장,알츠하이머병, 및 노화와 관련된 기타 퇴행성 질환. 항산화제는 세포를 공격하기 전에 이러한 자유 라디칼을 중화하여 세포 단백질, 지질 및 세포의 손상을 방지하는 유익한 성분입니다.탄수화물. 인간 질병의 치료를 위해 다양한 천연 및 합성 항산화제가 제안되었습니다. 인간 건강에서 항산화제의 역할에 대한 이러한 관심은 식품 과학 및 약초 분야에서 항산화제로서의 허브의 기능을 평가하는 연구를 촉발했습니다. 항산화 작용에는 자유 라디칼 소거 능력, 지질 과산화 억제, 금속 이온 킬레이트 능력 및 환원 능력이 포함됩니다[9,10].

암은 가장 세계적인 건강 관리 문제 중 하나입니다. 다양한 요인으로 인해 새로운 항암제의 개발과 발견은 여전히 매우 중요합니다. 이러한 요인에는 주요 부작용을 일으킬 수 있거나 다소 비쌀 수 있는 치료가 포함됩니다. 생물학적으로 더 안전하고 더 저렴한 대안이 여전히 매우 바람직합니다[{0}}].

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여러 식물 종은 Belladonna 잎의 아트로핀, 코카 잎의 코카인, Vinca 식물의 vincristine 및 현대 의학에서 여전히 중요한 역할을 하는 많은 다른 것과 같은 생리 활성 분자의 잠재적 공급원으로 간주됩니다[15,16].

유용한 치료 효과는 약용 식물에 존재하는 2차 생성물을 혼합하여 얻을 수 있습니다. 이들 화합물은 대부분 알칼로이드, 스테로이드, 탄닌, 플라보노이드 및 페놀과 같은 2차 대사산물이며 합성되어 이러한 식물의 특정 부분에 침착됩니다[17,18]. 본 연구는 R. rothschildianus 잎에서 추출한 다양한 분획의 체외 항아밀라아제, 항{5}}글루코시다아제, 항리파아제, 항증식 및 항산화 활성을 조사합니다.

행동 양식

식물 재료, 화학 물질 및 기구

R. rothschildianus 잎은 2018년 2월과 3월 사이에 팔레스타인 서부 지역에서 수확되었습니다. 이 잎은 An-Najah 국립 대학교 약리학 연구소의 Nidal Jaradat 박사가 바우처 표본 코드 Pharm-PCT로 식별했습니다.{3} }. 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 분광광도계-UV/가시광선(Jenway degree 7135, Stafford-shire, UK), 여과지(Whitman No. 1, Washington, USA), 진탕기(Memmert 531-25-1, 스톡홀름, 스웨덴), 회전증발기(Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, Germany), 그라인더(Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, China), 전자 저울(Radwag, AS 220/c/2, Torunska, 폴란드), 동결 건조기-BT85 (Millrock Technology, China) 및 cryo-desiccator(Mill-rock technology, BT85, Kingston, USA)를 사용하였다.

추출물의 제조 및 분류

R. rothschildianus 잎의 건조 분말은 비극성 용매인 헥산부터 시작하여 아세톤(극성 비양성자성 유기 용매), 메탄올(극성 알코올), 마지막으로 증류수(a) 순으로 극성에 따라 용매를 첨가하여 추출하였다. 극성 양성자성 용매). 각 추출에 대해 약 25g의 분쇄된 건조 잎을 25도에서 분당 1{{7}0회전으로 진탕 장치에서 72시간 동안 0.51 헥산에 넣었습니다. 먼저, 헥산을 0.5L 아세톤으로 교체한 후 동일한 부피의 메탄올과 물을 교체했습니다. 용매에서의 인큐베이션은 헥산에 대해 위에서 설명한 바와 같다. 각 유기 분획을 여과하고 회전 증발기에서 진공 하에 농축하고, 수성 분획을 동결 건조기를 사용하여 건조시켰다. 마지막으로 모든 미정제 분획은 4도에서 보관되었습니다[19,20].

각 분획의 수율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

예비 식물화학적 평가

활성 2차 대사 산물을 확인하기 위해 R. rothschildianus 잎의 4개 분획에 대한 식물화학적 스크리닝 테스트를 수행했습니다. 정성적 결과는 생리활성 식물화학물질이 있을 경우 (+), 없을 경우 (-)로 표시하였다[10,21].

총 페놀 함량(TPC) 측정

TPC를 결정하는 절차는 Cheung et al. TPC는 잎의 건조 중량 그램당 갈산 당량의 밀리그램으로 표시되었습니다(mg GA/g 건조 중량). 새로 준비한 7.5% 탄산나트륨 용액은 7.5g의 Na2CO3를 메스플라스크에 넣고 증류수로 부피를 1{16}0ml로 조정하여 만들었습니다. 갈산 100mg을 증류수에 용해시켜 최종 부피가 100ml가 되도록 표준표준액(갈산용액)을 제조하였다. 이로부터 갈산 용액을 100, 70, 50, 40 및 10ug/ml로 연속 희석하여 얻었다. 식물 추출물 100mg을 증류수에 녹여 잎 분획의 원액을 제조하여 총 부피가 100ml가 되도록 조정하였다. 반응 혼합물은 0.5 ml의 각 분획 용액을 2.5 ml의 10% Folin-Ciocalteu 시약과 혼합하여 제조하였으며, 이를 2.5 ml의 7.5% 중탄산나트륨과 함께 물에 용해시켰다. 샘플 튜브를 45도에서 45분 동안 인큐베이션했습니다. 그 다음, 각각의 흡광도는 765 nm의 파장에서 분광광도계로 측정하였다. 작업 샘플은 각 분석 시도에 대해 3중으로 준비되었으며, 이로부터 평균 및 표준 편차 값이 계산되었습니다[21].

총 플라보노이드 함량(TFC) 측정

4개의 R. rothschildianus 잎 분획의 TFC는 루틴(표준 참조 화합물)의 보정 곡선을 사용하여 평가되었습니다. 결과는 잎 추출물의 그램 건조 중량당 루틴 당량의 밀리그램으로 표현되었습니다(mg RU/g 건조 중량). 루틴에 대한 검량선은 1{{1{13}}}}0 ug/ml의 스톡 용액에서 생성된 연속 희석액을 사용하여 설정되었습니다. 원액을 만들기 위해 루틴 10mg을 증류수 10ml에 녹인 후 100ml로 희석하였다. 이어서, 스톡 용액을 희석하여 루틴을 10, 30, 40, 50, 70 및 100ug/ml의 농도로 제공하였다. 작업용액 제조를 위해 각 분획용액 0.5ml에 메탄올 3ml, 10% AlCl3 0.2ml, 1M 아세트산칼륨 0.2ml, 증류수 5ml를 혼합한 후 상온에서 30분간 배양하였다. 각 분획에 대해 이전 단계를 반복한 후 415 nm의 파장에서 흡광도를 측정했습니다. 블랭크 컨트롤의 경우 샘플 추출물 대신 증류수로 작업 용액을 설정했습니다. 샘플은 각 분석 시도에 대해 3중으로 준비되었으며, 이로부터 평균 및 표준 편차 값이 계산되었습니다[22].

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총 탄닌 함량(TTC) 측정 Sun et al. 가장 일반적으로 사용되는 절차인 4개의 R. rothschildianus 잎 분획에서 TTC를 결정하는 데 사용되었습니다. 카테킨을 기준 화합물로 사용하여 검량선을 구성했습니다. 메탄올 중 1{8}}0ug/ml 스톡이 준비되었으며, 이로부터 10, 30, 50,70 및 100ug/ml의 카테킨 농도를 제공하기 위해 희석 시리즈가 생성되었습니다. 메탄올 중 바닐린의 4% 용액을 새로 준비했습니다. 메탄올을 용매로 사용하여 100ug/ml에서 분획의 스톡 용액을 제조했습니다. 작업용액은 각 분획용액 0.5ml에 바닐린용액 3ml 및 진한염산 1.5ml를 혼합하였다. 혼합물을 15분 동안 방치한 후, 샘플 추출물 대신 메탄올로 설정한 working solution을 blank로 사용하여 500 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 모든 작업 샘플은 평균 및 표준 편차 값이 계산된 삼중으로 분석되었습니다. 각 분획의 총 탄닌은 카테킨 당량(CAE mg/잎 건조 중량 g)으로 표시되었습니다[23].

항산화 활성 방법

유리 2,{1}}디페닐-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼 소거 분석을 사용하여 R. rothschildianus 잎의 여러 분획에서 항산화 활성을 측정했습니다. 각 식물 분획의 1{12}00ug/ml 스톡 용액을 메탄올에 준비했습니다. 또한 Trolox의 1000 ug/ml 용액도 준비했습니다(참조 표준). 2, 5, 10, 20, 50 및 100ug/ml에서 6가지 연속 희석을 제공하여 각 분획에 대한 스톡 솔루션에서 희석 시리즈를 준비했습니다. 각 추출물 희석액 1ml를 메탄올 중 0.002g/ml DPPH 1ml와 혼합했습니다. 1ml의 메탄올을 첨가하여 3ml의 최종 작업 부피를 얻었다. DPPH 용액은 빛에 매우 민감하여 새로 준비했습니다. 시리즈 농도의 블랭크 대조군은 추출물을 첨가하지 않은 1:2 비율의 메탄올 중 DPPH였습니다. 모든 작업 용액은 약 30분 동안 암실에서 실온(25도)에서 인큐베이션되었습니다. 그런 다음 517 nm의 파장에서 분광 광도계로 광학 밀도를 측정했습니다. 다음 방정식을 사용하여 Trolox를 표준 화합물로 사용하여 각 식물 분획에 대한 DPPH 억제율을 계산했습니다.

여기서 Ag는 공액의 기록된 흡광도이고 Ats는 시험된 시료 용액의 기록된 흡광도입니다[21].

돼지 췌장 리파제 억제 분석

5{13}}0ug/ml의 스톡 솔루션은 1{21}}% DMSO의 각 식물 분획에서 만들었습니다. 이들로부터 50,100,200, 300 및 400ug/ml의 5가지 농도의 희석 시리즈가 만들어졌습니다. Tris-HCl 완충액 중 돼지 췌장 리파제의 1 mg/ml 스톡 용액을 사용 직전에 새로 준비했습니다. 기질인 p-니트로페닐 부티레이트(PNPB)는 20.9mg을 2ml의 아세토니트릴에 용해시켜 제조하였다. 각 작업 용액에 대해 0.1ml 돼지 췌장 리파아제를 희석 시리즈의 각 구성원에서 0.2ml 식물 분획과 혼합했습니다. Tris-HCl을 첨가하여 working solution의 최종 부피가 1ml가 되도록 하고 37℃에서 15분간 배양하였다. 인큐베이션 후, 0.1 ml의 p-니트로페닐 부티레이트 용액을 각 시험관에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 37도에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 췌장 리파제 활성은 UV 분광광도계를 사용하여 410 nm에서 PNPB의 p-니트로페놀레이트로의 가수분해를 측정함으로써 결정하였다. 표준 참조 화합물로 orlistat를 사용하여 동일한 절차를 반복했습니다. 식물 분획에 의한 리파제 억제율은 다음 방정식으로 계산되었습니다.

여기서, Ap는 공액의 기록된 흡광도이고, Ats는 시험된 시료 용액의 기록된 흡광도입니다[24]. α-아밀라아제 억제 분석

각 분획의 A100 mg을 몇 밀리미터의 1{18}}% DMSO에 용해한 다음 0.02 M Na HPOq/에 최대 1{22}}0ml까지 추가로 용해했습니다. NaH-PO4, 0.006M NaCl, pH 6.9로 최종적으로 1000ug/ml 농도의 스톡 용액을 제공합니다. 이들로부터 10% DMSO를 희석제로 사용하여 10,50,70,100 및 500ug/ml의 다음 희석액을 제조했습니다. 0.2ml 부피의 2units/ml 돼지 췌장-아밀라아제를 0.2ml와 혼합했습니다.

식물 분획을 30도에서 10분 동안 배양했습니다. 인큐베이션 후, 0.2ml의 새로 준비된 물에 용해된 1% 전분 용액을 첨가한 다음, 튜브를 최소 3분 동안 더 인큐베이션했습니다. 이때 3,{8}}dinitro salicylic acid(DNSA) 색시약 0.2ml를 가하여 반응을 멈추고 증류수 5ml로 희석한 후 물에서 90도에서 10분간 가열하였다. 욕조. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. 블랭크 대조군은 위에서 설명한 것과 동일한 양을 사용하되 식물 분획을 0.2ml 완충제로 대체하여 준비했습니다. Acarbose는 위에서 설명한 절차에 따라 표준 참조로 사용되었습니다. α-아밀라아제 억제 활성은 다음 식을 사용하여 계산되었습니다: