Pinocembrin은 Nrf2/HO-1 신호 경로 1부의 활성화를 통해 경색 후 심부전을 개선합니다

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추상적인

배경:산화 스트레스는 심부전의 진행과 관련된 중요한 요소입니다. 현재 연구는 피노셈브린이 경색 후 심부전(PIHF) 및 기본 메커니즘을 개선할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 수행되었습니다.

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행동 양식:쥐는 심근경색증을 유발하기 위해 좌전하행동맥 결찰술을 시행하였고, 그 후 만성 심부전을 일으키기 위해 6주 동안 사육하였다. 그 후 2주간 격일로 피노셈브린을 투여하였다. 효과는 심장초음파, western blot, Masson 염색, 생화학적 검사, 면역조직화학, 형광으로 평가하였다. 시험관 내에서 우리는 또한 H9c2 심근세포와 심장 근섬유아세포를 배양하여 메커니즘을 추가로 증언했습니다.

결과:우리는 PIHF에 의해 유발된 심장 기능의 악화가 피노셈브린을 투여함으로써 유의하게 개선되었음을 발견했습니다. 또한, 피노셈브린 치료는 또한 경색 경계 영역에서 콜라겐 침착을 약화시키고 혈관 내피 성장 인자 수용체 2를 증가시켰으며, 이는 심장 조직의 활성 산소 종(ROS) 감소에 의해 입증된 산화 스트레스의 개선과 관련된 감쇠된 세포자멸사를 나타냅니다. 및 혈청의 말론디알데히드(MDA), 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 증가. 이는 핵 인자 적혈구계 2-관련 인자 2(Nrf2)/헴 옥시게나제-1(HO-1) 경로의 상향 조절을 동반했습니다. 시험관 내 실험에서 우리는 특정 Nrf2 억제제가 항산화제, 항세포자멸사, 항섬유증 및 혈관신생을 포함하여 피노셈브린으로 인한 효과를 유의하게 역전시키는 것을 발견했으며, 이는 피노셈브린에 의한 PIHF의 개선이 Nrf2/HO에 있음을 추가로 나타냅니다.{11}} 경로 의존적 방식.

Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다

결론:Pinocembrin은 ROS 소거 및 Nrf2/HO{1}} 경로 활성화에 의해 PIHF로 인한 심장 기능 및 리모델링을 개선하여 콜라겐 섬유 침착 및 세포자멸사를 더욱 약화시키고 혈관신생을 촉진했습니다.

키워드:피노셈브린, 심부전, 산화 스트레스, Nrf2/HO-1

소개

심장의 구조적 및/또는 기능적 손상으로 인한 다양한 말기 임상 증후군을 특징으로 하는 심부전(HF)은 심근경색(MI)이 주요 원인으로 전 세계적인 건강 부담으로 남아 있습니다(Ziaeian and Fonarow 2016; Galli 및 Lombardi 2016, Rengo et al.2013). 심부전의 치료법과 치료의 질에서 큰 발전이 이루어졌음에도 불구하고 매년 전 세계적으로 3,770만 명의 유병률이 추정되고 있으며 심부전 진단 후 5년에 50%의 사망률이 있습니다(Go et al. .2014). 현재의 딜레마는 부분적으로 경색 후 HF(PIHF)가 현재의 치료 방법이 완전히 참조할 수 없는 다양한 병태생리학적 기전으로 구성된다는 점에 기인할 수 있습니다.

축적된 연구에 따르면 산화 스트레스(OS)는 주로 PIHF의 병리학적 진행에 관여하는 것으로 나타났습니다(Dubois-Deruy et al.2020; Ma et al. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019).OS, 주로 하이드록실 라디칼, 과산화물, 산화질소 등을 포함하는 자유 라디칼/활성 산소 종(ROS)의 과도한 축적(Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019)은 지질의 산화적 변형 또는 손상을 유발할 수 있는 것으로 입증되었습니다. , 단백질 및 DNA, 세포 소기관 장애, 염증, 근세포의 세포자멸사 및 간질 섬유증 감독(Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida et al. 2018). ROS의 여러 해로운 영향으로 인해 PIHF 요법에서 항산화제가 고려되어 왔습니다. 그 메커니즘은 직접적인 ROS 소거 및/또는 글루타티온, SOD(과산화물 디스뮤타제), 카탈라제 등을 포함하는 항산화 방어의 자극으로 구성됩니다. Habtemar-iam 2019). 그러나 비타민 E(Lee et al.2005)나 레스베라트롤(Made et al. 2015; Olesen et al. 2014)이 아닌 일부 항산화제를 적용하여 심혈관 질환 치료에 대한 만족도를 만족시키지 못한 점은 아쉬웠다. 심장 기능 개선의 실패로 입증됩니다. 따라서 PIHF 치료에는 보다 효율적인 항산화제가 필요합니다.

피노셈브린(Pino)(화학 구조는 그림 1A에 나와 있음)은 천연 플라보노이드 화합물로 꿀, 프로폴리스 및 기타 여러 식물(Lan et al.2015; Rasul et al.2013)에서 추출할 수 있습니다. 인공 합성(Costa and Leitao 2011), 강조된 항산화 효과(Kim et al.2020; Sangweni et al. .2020). 이전에 입증된 바와 같이 직접적인 ROS 제거를 담당하는 Pino의 페놀 구조와 항산화 방어를 강화하는 페놀 및 비페놀 구조(Habtemariam 2019)는 Pino의 항산화 효과를 설명합니다. 신경퇴행성 질환, 죽상동맥경화증, 독소루비신 유도 심근세포 독성과 같은 다양한 질병(Sangweni et al. 2020; Sang et al.2012; Liu et al.2014). 그러나 심근경색증과 심부전에 대한 여러 가지 항산화제가 임상적 용도로 전환하기에는 부적절하거나 불충분하다는 점을 감안할 때, 피노의 항산화 효과가 PIHF 치료에서 충족될 수 있는지 여부는 아직 잘 알려져 있지 않다. 따라서 이 연구는 Pino의 투여가 PIHE에 유익한 효과를 발휘할 수 있는지, 새로운 가능성이 있는지, 또는 지배적이지는 않지만 적어도 보조 치료인지 조사하기 위해 수행되었습니다.

방법 및 재료

동물 모델 및 실험 프로토콜

중국 삼협대학 동물실험센터에서 구입한 수컷 Sprague-Dawley 쥐 56마리,

우한 No.3 병원 동물 관리에서 자랐습니다. 모든 실험은 미국 국립 보건원(NIH Publication No.{1}}, 1996년 개정)에서 발행한 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침을 준수하여 Hubei Key Laboratory of Cardiology에서 공식적으로 허용 및 수행되었습니다.

쥐는 처음에 왼쪽 전방 하강 관상 동맥(LAD) 결찰 또는 가짜 수술을 받았습니다. 간단히 말해서, 쥐를 3% 펜토바르비탈(2mL/kg; Sigma-Aldridge, St.Louis, USA, 복강 내)로 마취한 다음 기관 삽관 및 호흡 지원(일회 호흡량: 5-10mL, 속도: 70회/분). 후속 심장 노출을 수행하고 LAD를 7-0 모노필라멘트 나일론 봉합사로 결찰했습니다. 심전도의 I 리드에서 근첨의 창백함 또는 ST 분절 상승의 발생은 MI의 유도를 나타냅니다. 가짜 수술은 LAD 결찰을 제외하고 동일한 절차를 거쳤습니다. 수술 후 1주일 동안 1일 1회 페니실린(200,{9}} IU)을 근육주사했습니다.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98퍼센트 ; Sigma-Aldridge) 또는 동량의 식염수를 2주 동안 격일로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 이전 연구를 참조한 용량입니다(Lan et al.2017). 프로토콜은 그림 1B에 나와 있습니다.

대조군 양성 대조군 쥐는 3개의 그룹을 포함하였다: sham + saline(sham group); LAD 결찰 + 식염수(HF 그룹); LAD 결찰 + 에날라프릴(HF + ACEI 그룹). 쥐는 HF + ACEI 그룹의 쥐에게 20 mg/kg enalapril을 경구 공급한 것을 제외하고 상응하는 수술을 받았습니다.

심장초음파 측정

심장 기능은 이전에 우리 그룹(Fo et al.2020)에서 보고된 바와 같이 초음파 영상 시스템(Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Canada)을 사용하는 경흉부 심초음파에 의해 평가되었습니다. 이완기말기(LVIDd) 및 수축기말기(LVID)에서 좌심실 내부 치수, 좌심실 수축기말 및 이완기말 부피(LVESV 및 LVEDV)는 최소 3시간 동안 2차원 M-모드 심초음파로 기록되었습니다. 각 쥐에 대한 연속 주기. 수축기 기능을 반영하는 좌심실 박출률(LVEF) 및 분수 단축(FS)이 이후에 계산되었습니다.

샘플 준비

피노 투여 및 심장초음파 검사 후 쥐를 다시 마취시켰다. 꼬리 정맥에서 2mL 이상의 정맥혈을 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된 진공 채혈관에 3000r/min의 속도로 15분 동안 4℃의 온도에서 연속적으로 원심분리한 후 분리했습니다. 혈청 상청액 및 보존:-80 "C. 그런 다음 심장을 신속하게 수확했습니다. 각 심장의 경색 경계 영역의 일부를 절단하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 액체 질소에서 동결시켰으며, 다른 심장 조직은 4에 고정했습니다. 24시간 이상 동안 퍼센트 파라포름알데히드.

마손의 염색

우리는 경색 경계 영역에서 콜라겐 침착을 감지하기 위해 Masson 염색을 수행했습니다. 파라포름알데히드로 고정된 심실을 파라핀으로 포매한 다음 5-μm 섹션으로 절단했습니다. 이어서 콜라겐은 파란색으로, 심근은 분홍색으로, 핵은 검은색으로 염색된 Masson trichrome으로 절편을 염색했습니다. 콜라겐 침착 비율은 Image J 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD)에 의해 x 200 배율에서 계산되었습니다.

면역조직화학 분석

면역조직화학 분석을 수행하여 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2)의 상향 조절이 리모델링의 약화에 유익하고 중요한 혈관신생을 촉진하는 밀도를 평가했습니다(Rengo et al. 2{24}}13). Masson 염색과 같이 심실 절편을 제작한 후 탈파라핀화하고 재수화하였다. 그런 다음 섹션은 열 매개 항원 검색을 받았고 4도에서 12시간 동안 1ug/mL VEGFR2 항체(Abcam, ab9530)의 배양과 함께 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 3% H, O로 처리되었습니다. 그 후, 절편을 HRP(horse-radish peroxidase) 표지 이차 항체(1:200, Service, G1213)로 37도에서 50분간 배양했습니다. 황갈색으로 표시됩니다. 마지막으로 VEGFR2의 평균 광학 밀도를 Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, USA)로 분석하고 계산했습니다.

말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 매개 닉엔드 라벨링(TUNEL) 분석

Apoptosis는 TUNEL 분석에 의해 연속적으로 감지되었습니다. 심실 조직을 포함하는 이전에 제조된 파라핀 덩어리를 TUNEL 분석을 위해 다른 조각으로 절단한 다음 상업용 분석 키트(Roche, Switzerland, 11684817910)의 제조업체 지침에 따라 TUNEL 염색을 수행했습니다. 간단히 말해서, 심실 섹션은 TdT 및 dUTP가 1:9의 비율로 혼합된 TUNEL 시약에 노출되었으며, 여기서 프로테이나제 K의 인큐베이션 및 세포막 파열 후 실온에서 1시간 동안입니다. 마지막으로, 450 nm(x 400 배율)의 방출 파장에 의해 촉발된 530 nm의 파장에서 형광 이미지가 관찰되었다. 각 그룹의 심실 조직의 세포 사멸 속도는 Image Software로 분석 및 계산되었습니다.

웨스턴 블롯

우리는 Pino가 PIHF를 개선한 기본 메커니즘을 설명하기 위해 Western blot을 구현합니다. 단백질 샘플 추출 및 준비 절차는 이전에 우리 연구에서 보고된 절차와 유사했습니다(Chen et al.2020a). 세포막은 핵 인자 적혈구계 2-관련 인자 2(Nrf2), 헴 옥시게나제{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,세포 신호 기술,2524S), BCL{13}}(1:1000, 세포 신호 기술,2870P) ,bax(1:1000, Abcam, ab32503), 절단된 카스파제{20}}(1:1000, 세포 신호 전달 기술, 9664 T), 콜라겐 I(1:1000, Affinity, AF7001), 글리세르알데히드{27}} 인산염 탈수소효소(GAPDH, Service, GB12002), HRP 표지 이차 항체(Service, G1213 및 G1214) 및 화학발광 검출 시약에 의한 후속 시각화. 블롯 이미지는 최종적으로 Image J 소프트웨어에 의해 분석되고 정량화되었습니다.

H9c2 심근세포 배양 및 in vitro 처리 American Type Culture Collection(CRL{5}})에서 구입한 쥐의 심장 심실 유래 H9c2 심근세포를 배양하여 Pino의 in vitro 효과를 더욱 검증하였다. H9c2 심근세포는 37도의 온도와 95% 공기 및 5% CO의 분위기에서 10% 소태아혈청을 함유한 e Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)/F12 배지(중국 항저우시 지칭)에서 배양하였다. 90%까지 성장한 후 6-웰 플레이트에 접종하고, 25 uM 이소프레날린(ISO)을 포함하는 혈청 배지를 후속적으로 3개 웰에서 정상 배지로 대체하여 HF 상태를 모방하기 위해 48시간 동안 세포를 배양했습니다. HF는 또한 교감신경의 과활성화와 α-아드레날린 수용체의 자극이 ROS를 생성하는 것이 특징입니다(Velusamy et al.2020). 그런 다음 세포를 6개의 그룹으로 나누었습니다: (i) 대조군, (ii) 4시간 동안 25μM Pino가 첨가된 대조군 배지(대조군 + Pino 그룹) (i) 4시간 동안 25μM Pino 및 5μM ML385와 함께 배양된 대조군 배지(Nrf2 억제제; MCE, New Jersey, USA)(대조군 + Pino + ML385 그룹), (iv)ISO ​​그룹; v. 25μM Pino(ISO + Pino 그룹)에 의한 4-h 인큐베이션이 있는 ISO 배지; vi. ISO 플러스 25μM Pino 플러스 5μM ML385 그룹. 이전 연구 또는 지침(Jin et al.2015; Oliveira et al.2017)을 참조한 약물의 농도 및 배양 시간.

신생아 쥐 심장 근섬유아세포 배양 및 증식 분석

신생아 쥐의 심장 근섬유아세포(CMF)를 배양하여 콜라겐 분비에 대한 Pino의 효과를 조사했습니다. CMF는 이전에 입증된 방법을 참조하여 생후 3일의 신생아 쥐를 사용하여 분리되었습니다(Cui et al. 2021). 분리되고 다진 심장은 0.125% 트립신에 이어 0.25% 트립신 및 0.08% 콜라게나제를 함유한 칵테일에 의해 여러 번 소화되었으며, 원심분리 및 페트리 접시로의 이식이 후속적으로 수행되어 수집되었습니다. 상층액의 세포. 그런 다음 배지는 90분의 접착 후 H9c2 심근세포 배양에 사용된 것과 유사한 혈청 배지로 교체되었습니다. CMF는 H9c2 심근세포와 동일한 처리를 받았습니다. 또한 세포 계수 키트{13}}(CCK{14}}) 분석(Dojindo, 일본)을 구현하여 각 웰에서 1.5×10도 밀도에 도달할 때 CMF의 증식을 감지합니다. 450 nm의 파장에서 더 높은 값은 증가된 증식 활성을 나타냅니다.

ROS 감지

ROS를 제거하는 Pino의 능력은 형광 프로브 dihydroethidium(DHE; Beyotime, Shanghai, China)에 의해 측정되었습니다. DMSO에 녹인 DHL을 동결 절편의 경우 5μM로 희석하거나 사용 설명서에 따라 동일한 농도로 희석되도록 혈청 배지에 첨가하였다. 파라포름알데히드로 고정된 심장을 동결한 다음 최대 4-μm 섹션으로 슬라이스했습니다. 절편 또는 H9c2 심근세포를 37도의 온도에서 30분 동안 DHE 용액과 함께 공동 인큐베이션한 후 도립 형광 현미경(IX70; Olympus, Tokyo, Japan)으로 이미지화하였다. 간단히 말해서, DNA와 RNA로 채워진 핵은 핵산과 DHE의 친화력으로 인해 뚜렷한 붉은색으로 염색되었습니다. 또한 형광 강도가 강할수록 ROS가 더 많이 축적되었음을 나타냅니다.

생화학 검사

생화학적 검사는 각각 HF 표현형과 산화제 방어를 나타내는 혈청 및 세포 상청액에서 혈청 BNP, SOD 및 malondialdehyde(MDA)의 변화를 조사하기 위해 수행되었습니다. 농도는 제조업체의 지침(Jiancheng, Nanjing, China)에 따라 해당하는 생화학적 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다.

이 기사는 Chen et al. 몰 메드(2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7