Pinocembrin은 Nrf2/HO-1 신호 경로 2부의 활성화를 통해 경색 후 심부전을 개선합니다

통계 분석

변수는 평균±표준오차로, 비례변수는 백분율로 나타내었다. 모든 그룹의 비교는 피셔 최소 유의차 테스트로 수정된 양방향 ANOVA로 분석된 심장초음파 데이터를 제외하고 Tukey 사후 테스트로 수정된 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었습니다. p 값<0.5 was="" defined="" as="" statistical="">

결과 Pino는 HF로 인한 심장 기능 저하를 개선했습니다. 우리는 먼저 LAD 결찰에 의해 유도된 HF 표현형 확립과 Pino가 심장 기능에 미치는 영향을 확인하기 위해 심장초음파검사를 시행했습니다. 모든 그룹의 대표적인 2차원 M-모드 심초음파가 그림 2A에 나와 있습니다.{4}}LAD 결찰 후 1주일 동안 무처리 섭식을 하면 LVEF 및 FS의 감소와 LVID의 증가로 입증되는 상당한 HF 발현이 나타났습니다. 6주차 및 8주차에 LVIDd, LVESV, LVEDV는 각각 sham 그룹에 비해 증가된 혈청 BNP 농도 및 심장 기능 장애 및 비대를 나타내는 8주차에 증가된 심장 중량/경골 길이(그림 2B, C)와 함께 특정 매개변수와 함께 , 표 1)에 설명되어 있습니다. 그러나 모든 증상은 8주차에 Pino 대 HF 그룹의 적용에 의해 부분적으로 역전되었으며, 이는 Pino가 심장 기능에 유익한 역할을 함을 시사합니다.

PIHF 이후. 또한, 피노가 6주차에 기본 심장 기능을 개선 방향으로 변경했지만 그 변경 사항이 유의미한 수준에 도달하지 않았음을 알 수 있었습니다. 따라서 피노의 장기간 적용이 현저한 개선으로 이어질 수 있는지 여부를 가정하여 추가 연구가 필요합니다.

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Pino는 PIHF의 리모델링을 약화시켰습니다. 심근 세포의 재생 능력이 희박하거나 부재한 것을 감안할 때, 심장 기능의 개선은 심근 세포 재생보다는 Pino에 의한 살아있는 심근 세포 및 조직의 개선에 더 기인합니다. 따라서 우리는 이전에 제안된 대로 PIHF 리모델링의 3가지 핵심 요소인 섬유증, 신생혈관화 및 세포자멸사를 추가로 평가했습니다(Wang et al 2010). Pino는 MI 경계 영역에서 콜라겐 섬유의 침착을 약 2배 감소시켰습니다(그림 3A). 또한 경색 경계 영역 판단에서 인공적인 편향을 피하기 위해 양성 대조군과 동일한 모델을 설정했습니다. Pino는 HF 리모델링의 역전으로 알려진 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACEI)인 enalapril로 대체되었습니다. 우리는 HF 및 ACEI 그룹에서 섬유증 정도를 관찰했습니다.

사전 설정된 모델에 비해 대략적인 비율에 도달했습니다. 우리는 또한 광대한 침착된 콜라겐이 심근을 대체한 경색 영역을 표시했습니다(추가 파일 1: 그림 S1). 또한, Pino는 VEGFR2 분포 및 발현의 만성 HF 유도 희박을 상쇄합니다(그림 3B). 이전 연구에서 pro-apoptotic 유전자의 다양성을 활성화할 수 있는 p53 단백질이 저산소증 유발 인자-1(HIF-1a)의 억제를 통해 항혈관신생에 핵심 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다(Gogirajuet al.2019; Guo et al. .2015). 그런 다음 우리는 HF 그룹에서 p53 단백질의 과발현을 관찰했으며, 이는 VEGFR2의 변경을 부분적으로 설명하는 Pino에 의해 상쇄되었습니다(그림 3C). 우리는 또한 Pino의 투여가 항세포자멸사 단백질 BCL의 발현을 상향조절한 반면, p53, Bax, 절단된 카스파제를 포함한 세포자멸사 촉진 단백질{20}}의 발현을 하향조절한 웨스턴 블롯 실험을 수행했습니다. HF 그룹에 비해 증가된 bcl{21}}/bax 비율은 세포자멸사 절차의 활성화를 나타내며, 이는 Pino가 세포자살률에 역효과를 나타내는 TUNEL 분석에서도 확인되었습니다(그림 3D). 결론적으로 Pino는 개선되었습니다. 항 섬유증, 혈관 신생 및 항 세포 사멸을 포함한 잘 알려진 효과에 의한 MI 후 리모델링.

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Cistanche는 면역력을 향상시킬 수 있습니다

Pino는 Nrf2/HO{1}} 경로의 변조를 통해 OS를 완화했지만 Pino가 이러한 변경을 초래한 메커니즘은 아직 정의되지 않았습니다. 축적된 연구에 따르면 다양한 분자를 수정하고 불리한 리모델링 신호 경로를 유발하는 OS가 HF 모델에서 세포자멸사와 섬유증을 유발할 수 있음이 입증되었습니다(Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Wang et al.2010 ; Chen et al.2020b), 따라서 우리는 Pino가 OS의 완화를 통해 PIHF를 개선했다고 가정했습니다. 우리는 먼저 형광 및 생화학 테스트를 통해 심장 조직의 ROS 생성과 혈청의 SOD 및 MDA를 조사하여 HF에서 Pino의 항산화 역할을 결정했습니다. 예상대로 Pino는 만성에 의해 생성된 ROS를 부분적으로 청소했습니다.

DHE의 형광 강도 감소로 나타나는 HF(그림 4A, B). 더욱이, 항산화 효소인 SOD는 Pino의 적용에 의해 상향 조절된 반면 지질 과산화를 시사하는 MDA는 감소하였다(Fig.4B). 위의 데이터는 PIHF의 설치류 모델에서 Pino의 항산화 역할을 입증했습니다.

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Pino의 ROS 소거 효과는 확실했지만 항산화 방어 강화의 기본 메커니즘은 여전히 해명이 필요했습니다. Nrf2는 스트레스/자극에 대한 억제제 Kelch-lick ECH-associated protein 1(Keapl)과 해리되고 핵으로 전위되어 항산화 반응 요소(ARE)의 프로모터 영역에 결합하여 촉진하는 내인성 항산화 방어의 지배적인 구성요소입니다. 과다한 항산화 유전자와 효소의 발현, 그 중 HO{4}}가 대표적인 효소이며 중요한 역할을 합니다(Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019; Velusamy et al. 2020 ; Tian et al.2019). HMOX1에 의해 인코딩된 HO{10}}는 헴을 촉매하여 빌리베르딘, 빌리루빈, 일산화탄소(CO)를 포함한 3가지 항산화 분자로 분해합니다(Wang et al.2010; Kishimoto et al.2019). 이전 연구에서는 Nrf2 또는 H2O{16}}의 특정 활성화 또는 과발현이 PIHF를 개선하는 것으로 나타났으며(Ma et al.2019; Bubb et al.2017; Wang et al.2010), Pino는 Nrf2/ARE 경로는 PIHF 모델에서 정의되지 않은 상호 작용과 함께 우울증(Wang et al.2020), 신경 독성(Jin et al. 2015) 등에 보호 효과를 발휘합니다. 우리는 웨스턴 블롯으로 이 상호작용을 더 조사했습니다. PIHF는 가짜 그룹에 비해 전체 Nrf2 및 HO{24}}의 발현 감소에 기여했습니다. 그리고 Pino는 차이가 유의미한 수준에 도달하지는 않았지만 강한 소인으로 HO-1 발현을 증가시키는 능력에 추가하여 Nrf2의 상향 조절을 통해 이러한 유해한 영향을 유의하게 역전시켰습니다(p{27}}.0845, 그림 4C ). 결과는 Pino가 PIHF에서 심장 기능 개선 및 리모델링을 담당하는 Nrf2/HO{31}} 경로를 활성화하는 역할을 나타냅니다.

Nrf2의 시험관내 차단은 H9c2 심근세포에서 Pino의 효과를 제거했습니다

Pino의 효과가 HF 병리학적 상태의 완전한 개선이 아니라 Nrf2/HO{1}} 경로 의존적임을 추가로 입증하기 위해 우리는 이전에 보고된 방법으로 H9c2 심근세포를 배양하고 특정 Nrf2 억제제인 ML385를 시험관 내에서 활용했습니다. Pino는 생체 내에서와 유사한 반응 패턴으로 배지에서 SOD의 증가 및 MDA의 감소와 함께 ISO 유도 ROS 축적을 약화시켰습니다(그림 5). 그러나 모든 효과는 ML385 투여에 의해 거의 폐지되었으며, 이는 Pino의 항산화 효과가 주로 Nrf2의 활성화에 의해 제시되었음을 시사합니다. 또한 이 Nrf2/HO{12}} 경로 종속

ISO + Pino + ML385 그룹에서 Nrf2 및 HO{1}}의 발현 감소로 인해 효과가 추가로 확인되었습니다(그림 6). 또한 Nrf2의 효능이 주로 산화제 방어에 의해 제시되기 때문에 Pino의 ROS 소거 능력이 감소한 것도 주목할 만하다. 이 현상에 대한 가능한 설명은 산화 환원 항상성의 불균형이 25 uM Pino의 최대 소거 능력을 초과하는 과도한 ROS를 생성했다는 것입니다.

우리는 이후에 산화 환원의 불균형을 조사하기 위해 H9c2 심근세포 웨스턴 블롯을 수행했습니다.

ML385로 인한 항상성은 리모델링에 대한 증가된 감수성에 대한 책임이 있습니다. Pino의 투여는 콜라겐 I,p53, Bax, cleaved caspase-3의 감소와 BCL-2의 증가에 의해 입증된 항섬유증, 항세포자멸사에서 유사한 효과를 나타냈습니다(그림 6A , 나). 더욱이, CCK-8는 CMF의 western blot에 의해 조사된 콜라겐 분비의 감소와 함께 Pino에 의한 CMF의 활성 억제를 시사했습니다. 또한 시험관 내 ML385에 의한 이러한 모든 프레젠테이션의 역전은 Nrf2/HO{10}}가 PIHE 개선에서 Pino의 주요 표적임을 추가로 보여주었습니다.

논의

본 연구에서는 항산화 효과를 통해 피노 치료가 PIHF에 유익하다는 것을 확인했습니다. Pino는 ROS 소거 및 Nrf2/HO{1}} 경로 활성화에 의해 PIHF로 인한 심장 기능 및 리모델링을 개선했으며, 이는 콜라겐 섬유 침착 및 세포자멸사를 비롯한 심실 리모델링의 핵심 요소를 더욱 약화시키고 p53 단백질 하향 조절에서 신생혈관 생성을 촉진합니다. 의존적인 방식.

항산화제 및 HF

OS가 HF(Galli and Lombardi 2016; Dubois-Deruy et al. 2020; Velusamy et al., 2020; Tian et al. 2019; Kishimoto et al. 2019)에서 OS 악화된 기능 장애 및 리모델링에 대한 합의가 제시되며, 또한 여러 가지가 있습니다. 점점 더 많은 분자 표적과 새로운 약물이 발견되고 연구된 항산화제의 효과에 대해 시행된 실험 및 시도의 수. 그러나 임상 시험에서 테스트된 여러 항산화제 외에도 HF에 대한 무효화 또는 위험 증가를 나타내는 경향이 있습니다(Lee et al. 2005; Made et al. 2015; Olesen et al.2014; Lonn et al. 2005). kinases, microRNAs(Tian et al.2020; Vagnozziet al.2013; Pfister et al. 2014) 등과 같은 수많은 분자 표적은 기본 실험에서 실험으로, 심지어는 임상 적용까지 많은 어려움이 있습니다. 제조 및 안전에.

2 (1)

대조적으로, Pino는 HF 치료에서 보조 항산화제로 유망한 다음과 같은 장점이 있습니다. (i) 이전 연구와 현재 연구에서 입증된 상당한 항산화 효능, (ii) Pino는 여러 천연 식물, 꿀, 프로폴리스 또는 인공적으로 합성되어 충분한 생산과 상대적으로 저렴한 가격; (ii) 꿀과 프로폴리스에 함유된 피노의 풍부함은 편의를 위한 식이 섭취를 나타냅니다. 실제로 최근 피노가 우수한 내성과 안전성을 보인 건강한 피험자에게 피노를 제공하기 위한 1상 임상시험이 진행됐다(Cao et al. 2015). 또한, Pino는 2상 임상 시험이 시행되고 있는 중국 식품의약청(Chinese Food and Drug Administration)의 허혈성 뇌졸중 치료제로 승인되었습니다(Shen et al. 2019). 이러한 성취를 통해 우리는 PIHF와 함께 점점 더 많은 질병에 Pinon을 더 많이 적용할 수 있기를 기대합니다.

HF에서 Pino의 역할

우리가 아는 한, 이 현재 연구는 PIHF의 설치류 모델에서 Pino의 역할을 조사한 첫 번째 연구였습니다. Pino의 효과가 수많은 모델에서 광범위하게 조사되었지만 Pino와 심근 경색, 허혈/재관류 손상, 부정맥을 포함한 심혈관 질환 간의 연관성을 강조한 연구는 소수에 불과합니다(Ye et al. 2019; Zheng et al. 2020), Pino가 부여한 심장 보호에 대한 우리의 이해를 제한했습니다. 또한 이전에 입증된 바와 같이 Pino는 PIHF 치료의 핵심 표적이기도 한 항섬유증, 세포자멸사, 염증 및 항산화 효능을 나타냈습니다. 염증 경로 중 하나 이후로 우리 그룹에서 핵 인자-카파 B/종양 괴사 인자-(NF-KB/TNF- ) 경로가 조사되었으므로(Ye et al.2019), 이 연구에서는 apoptosis, oxidative stress, fibrosis, neovascularization의 희박으로 구성된 심장 기능과 리모델링을 악화시키는 몇 가지 요인. 예상대로, 매우 중요한 Pino 후처리는 항산화제 의존적 방식으로 세포자멸사와 섬유증을 완화했습니다. 우리는 또한 알츠하이머병 모델에서 Pino가 유도한 것과 유사하게 생존을 촉진하기 위해 심근세포에 산소와 영양소를 제공하는 VEGFR{11}의존성 혈관신생을 관찰했습니다(Liu et al. 2014). 그러나 Pino가 VEGFR2 결합, 모세혈관 이동 및 발아를 억제하는 것으로 인증되어(Cuevas et al.2015; Tian et al.2014) Pino가 잠재적인 신약으로 암의 증식을 억제하는 데 사용될 수 있다는 논란이 남아 있습니다. 따라서 경색경계부의 신생혈관은 피노에 의한 직접적인 영향이라기 보다는 다른 요인들의 회복에 의한 것으로 보인다. PIHF에서 상향조절된 P53 단백질은 이러한 변화를 부분적으로 설명할 수 있습니다. Pino가 protein kinase B(AKT)와 같이 혈관신생을 조절할 수 있는 다른 요인에 영향을 미치는지 여부도 알려지지 않았습니다. 따라서 PIHF에서 Pino에 의해 수여된 신생혈관형성의 기본 메커니즘은 해명을 위해 더 많은 연구가 필요했습니다.

Pino는 PIHF에서 주로 변조된 Nrf2/HO{1}} 경로

Nrf2/HO-1 경로는 OS로 인한 손상을 견디는 지배적인 메커니즘이었습니다. Pino가 전반적인 Nrf2 및 HO{4}} 발현과 세포질에서 핵으로의 Nrf2 전위를 촉진하여 OS를 개선할 수 있다는 것이 잘 확립되어 있으며, 이것이 우리가 이 경로를 후보로 선택한 이유이기도 합니다. 그러나 Nrf2/HO{7}} 경로에 대한 Pino의 영향은 전반적인 상태의 개선 후 직접 활성화 또는 간접 변조에 기인한 것으로 정의되지 않았습니다. 따라서 이 연구에서는 섬유증, 세포 사멸 및 혈관 신생에 대한 Pino의 유익한 효과를 거의 역전시킨 ML385에 의한 Nrf2 억제를 통해 Nrf를 Pino의 주요 표적으로 결정했습니다. 그럼에도 불구하고, 시험관 내에서 수행된 이 연관성은 Nrf2 억제제 또는 siRNA 또는 유전자 침묵을 위해 형질감염된 바이러스가 생체 내에서 적용되는 데 필요한 추가 조사가 필요했습니다. 또한, 우리는 불균형 산화환원 항상성이 25μM 농도에서 Pino의 용량을 초과하는 과도한 ROS 생성을 유도한다는 가정을 제시한 ML385에 의해 ROS 소거가 억제되었음을 관찰했습니다. 이 가정을 증명하기 위해 Nrf2/HO{15}} 경로의 차단으로 인한 ROS 생성에 충분한 Pino가 대응할 수 있는지 여부를 감지하기 위해 농도 구배가 제안되었습니다. ROS 생성은 일반적으로 미토콘드리아의 전자 누출, 활성화된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 옥시게나제, 산화질소 합성효소의 분리 및 고급 글리코실화 산물의 축적에 기인하므로 Pino가 ROS를 방해한 자세한 메커니즘을 탐구하기 위해 보다 심층적인 연구가 수행될 수 있습니다. 생성 및 제거 ROS 축적.

연구의 한계

본 연구는 몇 가지 제한점이 있다. 결과의 정확도에 큰 영향을 미칠 수 있는 경색 경계 영역의 정의에 주관적인 편견이 있음을 인식해야 합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 병리학적 섹션을 3명이 선택했지만 편견을 완전히 배제할 수 없었습니다. 더욱이, 몇몇 웨스턴 블롯 이미지는 수치의 품질에 부정적인 영향을 미치는 다클론 1차 항체에 기인한 다중 밴드를 보여주었다. 또한 Nrf2 siRNA 또는 아데노바이러스 형질감염 대신 Nrf2 억제제, ML385를 사용하여 설득당이 덜한 것도 눈에 띕니다. 마지막으로 중요한 것은 Pino의 항산화 메커니즘이 복잡하여 더 많은 연구가 필요하다는 것입니다.