돼지 태반 추출물은 인간 표피 케라티노사이트에서 세포 NAD 수치를 증가시킵니다

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니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)는 많은 산화환원 반응을 위한 고전적인 보조인자이며 모든 살아있는 세포에 산화(NAD + ) 및 환원(NADH) 형태로 존재합니다. NAD 플러스는 SIRT(sirtuin) 및 PARP(poly ADP-ribose polymerase)와 같은 NAD 플러스 소비 효소의 필수 공동 기질로도 알려져 있습니다. 이러한 효소는 DNA 복구, 미토콘드리아 대사 및 스트레스 저항성을 포함한 다양한 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하기 때문에 불균형한 NAD 항상성은 중추 과정에 영향을 미칩니다1. 조직/장기 NAD 수치는 나이가 들면서 감소하여 불균형한 NAD 항상성을 초래합니다2–6. 따라서 현재 NAD 수치를 유지하는 것이 노화 및 노화 관련 질병의 예방 및 치료로 이어진다는 데 합의가 이루어졌습니다7. NAD는 트립토판의 de novo 생합성, 니코틴산의 Preiss-Handler 경로, 니코틴아미드(NAM)8의 회수 경로를 포함한 다양한 경로를 통해 생합성됩니다. 포유류에서 회수 경로는 세포 NAD 수준을 유지하기 위한 주요 경로입니다9. 이 경로에서 NAM은 NAM 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)에 의해 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)로 전환된 다음 NMN 아데닐릴트랜스퍼라제에 의해 NAD로 전환됩니다. 니코틴아미드 리보사이드(NR)는 NR 키나아제에 의해 NMN으로 전환된 후 회수 경로에 통합됩니다. NMN 및 NR과 같은 NAD 중간 대사산물은 다양한 세포 및 조직에서 NAD 수준을 높이고 노화 관련 질병을 개선하는 것으로 나타났습니다10,11.

태반 추출물(PE)은 상처 치유를 위해 전통 의학에서 널리 사용되어 왔습니다. PE는 아미노산, 핵산, 지방산, 미네랄, 비타민, 호르몬, 생리활성 펩타이드, 사이토카인 및 성장 인자를 포함한 수많은 생리활성 성분의 풍부한 공급원입니다. 항염, 항산화, 재생, 면역조절 등 다양한 약리작용이 있는 것으로 알려져 있다12. 따라서 인간 PE(HPE)의 피하 및 근육내 주사는 갱년기 증상 및 만성 간 질환을 비롯한 여러 질병의 치료에 임상적으로 사용되었습니다13. 또한 HPE는 세포 성장 및 콜라겐 합성에 미치는 영향 때문에 주로 아시아 국가에서 주름 방지제로 임상적으로 사용됩니다14. 일본 등 일부 국가에서는 HPE의 사용이 의료용으로 제한되어 있기 때문에 최근에는 HPE의 대안으로 돼지 PE(PPE)가 개발되어 건강식품 및 화장품의 원료로 사용되고 있다. 마우스 접촉성 피부염 모델을 사용한 생체 내 연구에서 국소 PPE가 피부에 항염증 및 항산화 효과가 있는 것으로 나타났습니다15. 임상 연구에 따르면 국소 PPE는 치유되지 않는 만성 상처 치료와 주름 형성 예방에 도움이 된다고 합니다16,17. 또한, 건강한 성인 여성을 대상으로 무작위, 이중 맹검, 위약 대조 임상 시험을 실시하여 PPE 경구 섭취의 피부 이점을 검증했으며 PPE 섭취 그룹의 피부 상태가 크게 개선되었음을 보여주었습니다18. 이 보고서는 PPE 치료가 피부 노화를 완화하거나 예방할 수 있다는 개념을 뒷받침합니다.

PE는 전통적으로노화방지제, 수많은 임상 연구를 통해노화 방지 속성. 그러나 PE의 노화 방지 효과의 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 이 보고서는 PPE가 NMN 및 NR과 같은 여러 NAD 전구체를 포함하고 정상적인 인간 표피 각질 세포(NHEK)에서 세포 내 NAD 수준을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. 우리의 연구 결과는 PE가 세포 내 NAD 항상성을 유지함으로써 노화 방지 효과를 발휘하는 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

결과

PPE는 세포 내 NAD 수치를 증가시킵니다. PPE가 세포 NAD 상태를 변경하는지 여부를 조사하기 위해 PPE가 보충된 배지에서 NHEK를 배양하고 세포 내 NAD 플러스 및 NADH 수준을 정량화했습니다. 결과는 PPE가 용량 의존적 방식으로 NHEK에서 NAD 플러스와 NADH의 양을 유의하게 증가시켰음을 보여주었습니다(그림 1A). 1 mg/mL PPE로 처리된 세포의 총 NAD(NAD + + NADH) 수준은 처리되지 않은 세포보다 약 1.5배 더 높았습니다(그림 1A). 또한 시간 경과에 따른 실험에서 1 mg/mL PPE로 4시간 처리한 후 NAD + , NADH 및 총 NAD 수치의 상당한 상승이 관찰되었습니다(그림 1B). Te {{10}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석은 {{20} }.5–2 mg/mL PPE는 세포 대사 활동에 영향을 미치지 않은 반면, 5 mg/mL PPE 또는 양성 대조군(0.2% Triton X-100 [TX-100])은 상당한 세포 독성을 나타냈습니다. (그림 1C). NAD는 PPE 자체에서 거의 검출되지 않았기 때문에(데이터는 표시되지 않음), PPE의 NAD 생성 효과는 PPE 유래 NAD가 NHEK로 유입되기 때문이 아닌 것으로 보입니다. 따라서 이러한 결과는 PPE가 세포 내 NAD 수준을 증가시킬 수 있음을 시사합니다. PPE의 활성 성분은 단백질이 아닌 작은 분자입니다. PPE가 NAD 구제 경로에서 NAMPT 반응을 통해 세포 NAD 생합성을 촉진하는지 여부를 확인하기 위해 NAMPT 억제제 FK866를 사용하여 NAD 회복 분석을 수행했습니다(그림 2A). FK866는 추가 24시간 후 총 NAD 수준을 상당히 감소시켰습니다(그림 2B).

흥미롭게도, NHEK 내에서 NAMPT 활동이 없음에도 불구하고 PPE는 FK{{0}} 유도된 NAD 고갈을 용량 의존적 방식으로 억제했습니다(그림 2B). 많은 보고에 따르면 PE에는 사이토카인 및 성장 인자와 같은 단백질이 포함되어 있습니다13,19,20. 따라서 우리는 PPE에 포함된 일부 생체 활성 단백질 또는 돼지 NAMPT가 NHEK에서 세포 내 NAD 생합성을 향상시킬 수 있다고 추정했습니다. 가설을 확인하기 위해 원심 필터 장치(컷오프: 3kDa)를 사용하여 PPE를 고분자량 및 저분자량(HMW, LMW) 분획으로 분리했습니다. FK866를 사용한 NAD 회복 분석은 FK866가 없는 경우보다 PPE가 NAD 생합성에 미치는 영향을 더 명확하게 보여주었기 때문에(그림 1A 및 2B) PPE의 활성 성분을 확인하기 위해 진행했습니다. 이 분석을 사용하여. 예기치 않게 HMW-PPE는 NAD 수준의 상당한 회복을 위해 1mg/mL의 고농도가 필요한 반면, LMW-PPE는 0.25mg/mL의 낮은 농도에서도 FK866-로 인한 NAD 고갈을 분명히 개선했습니다(그림 2C 및 D). 따라서 이러한 결과는 PPE의 주요 활성 성분이 성장 인자 및 사이토카인과 같은 단백질이 아니라 3kDa 미만의 작은 분자임을 시사합니다.

PPE에는 NMN 및 NR과 같은 NAD 전구체가 포함되어 있습니다. 우리는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 LMW-PPE를 12개의 분획으로 더 분류하고 FK866- 유도된 NAD 고갈의 회복에 기여한 분획을 조사했습니다. LMW-PPE의 일반적인 HPLC 크로마토그램은 그림 3A에 나와 있습니다. NAD 회수 분석은 FK866- 처리된 NHEK에서 분획 3만이 NAD 수준을 뚜렷하게 증가시켰음을 보여주었습니다(그림 3B). NMN 및 NR과 같은 NAD 전구체는 NHEKs10,21을 비롯한 다양한 세포주에서 NAMPT 개입 없이 세포 내 NAD 수준을 높입니다. LMW-PPE는 NAMPT가 FK866에 의해 억제된 경우에도 NHEK에서 여전히 NAD 함량을 증가시켰기 때문에 PPE에 포함된 NAD 전구체가 세포 내 NAD 생산을 향상시킨다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 분획 3을 분석하여 NAD 전구체를 검출했습니다. 결과는 NMN(m/z 335→123), NR(m/z 255→123) 및 NAM(m/z 123→80)과 일치하는 3개의 이온 피크가 분수 3에서 검출되었음을 보여줍니다( 그림 3C). 정량 분석 ​​결과 전체 PPE에 포함된 NMN, NR 및 NAM의 농도는 각각 0.22, 17.62 및 0.14 ng/mg인 것으로 나타났습니다(표 1). 이러한 결과는 적어도 3개의 NAD 전구체, NMN, NR 및 NAM이 PPE에 존재하고 세포내 NAD-부스팅에 참여함을 시사한다.

그림 2. PPE는 NHEK에서 FK866에 의한 NAD 고갈을 개선합니다. (A) NAD 생합성의 회수 경로. Te NHEK를 FK{3}}로 30분 동안 전처리하고 표시된 농도에서 전체 PPE(B), HMW-PPE(C) 또는 LMW-PPE(D)와 함께 24시간 동안 배양했습니다. NAD + /NADH 분석 키트를 사용하여 총 NAD 수준을 결정했습니다. †피<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

재구성된 인간 표피에 대한 PPE의 국소 투여는 조직의 NAD 수준을 증가시킵니다. PPE의 NAD-부스팅 효과의 주요 활성 성분은 성장 인자와 같은 더 큰 단백질보다 더 높은 경피 흡수성을 가질 것으로 예상되는 작은 분자입니다. 따라서 피부에 대한 PPE의 국소 적용은 피부 조직에서 NAD 수준을 증가시키는 데 적합한 옵션인 것으로 보입니다. PPE의 국소 투여가 각질층 아래 표피의 NAD 수준에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 3-차원 재구성 인간 표피(RHE)를 각질층 쪽에 PPE로 처리하고 유무가 있는 배지에서 배양하였다. FK866의 (그림 4A). PPE의 국소 적용은 FK866의 존재 또는 부재에서 각각 NAD 수준을 9.1%(유의하지 않음) 또는 7.3%(유의함) 증가시켰습니다(그림 4B). PPE는 최대 10mg/mL까지 테스트했을 때 세포 대사 활동에 영향을 미치지 않은 반면, 1% TX-100는 현저하게 감소했습니다(그림 4C). 이 결과는 PPE의 활성 성분이 각막하 피부에 침투하여 유해한 영향을 미치지 않으면서 피부 NAD 수치를 증가시킬 수 있음을 시사합니다.

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