Preconditioning-activated AKT는 MDM2–p53 Pathway Ⅰ을 통해 허혈에 대한 신경 내성을 제어합니다.

추상적인

전처리 매개 신경 보호의 가장 중요한 메커니즘 중 하나는 세포 사멸의 감쇠로, 이후의 손상성 허혈 후 뇌 내성을 유도합니다. 이러한 맥락에서 항아폽토시스 PI3K/AKT 신호 전달 경로는 세포 분화 및 생존을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.

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활성 AKT는 p53을 불안정화하여 암세포의 생존을 촉진하는 E3- 유비퀴틴 리가아제인 murine double minute-2(MDM2)의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있습니다. 뉴런에서 우리는 최근 MDM2-p53 상호 작용이 허혈 유발 신경 세포 사멸을 예방하는 NMDA 글루타메이트 수용체의 아 독성 자극을 기반으로 약리학 적 전처리에 의해 강화됨을 보여주었습니다.

그러나 이 메커니즘이 IPC(ischemic preconditioning) 동안 신경 관용에 기여하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 IPC가 Ser473에서 AKT의 PI3K 매개 인산화를 유도하여 Ser166에서 MDM2를 인산화한다는 것을 보여줍니다. 이 인산화는 MDM2의 핵 안정화를 유발하여 p53 불안정화를 유도하여 허혈 손상 시 신경 세포 사멸을 방지합니다. wortmannin 또는 AKT 침묵에 의한 PI3K/AKT 경로의 억제는 세포질 MDM2의 축적을 유도하여 IPC 유도 신경 보호를 제거했습니다.

따라서 IPC는 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 활성화를 강화하고 MDM2-p53 상호 작용을 제어하여 신경 내성을 촉진합니다. 우리 연구 결과는 AKT 신호 전달의 조절을 통해 IPC 유도 신경 보호와 관련된 새로운 기계 경로를 제공하여 AKT가 허혈성 손상에 대한 잠재적인 치료 표적임을 시사합니다. 키워드: AKT; MDM2; p53; PI3K; 허혈성 내성; 전제조건

1. 소개

인간의 경우 일과성 허혈 발작(TIA)의 존재가 뇌졸중 환자의 기능적 결과의 이점과 함께 내인성 전제 조건으로 밝혀졌습니다[1-3]. IPC(ischemic preconditioning)로 알려진 짧은 아독성 허혈 자극에 의해 유도된 내인성 신경보호는 허혈 손상에 대한 신경보호의 새로운 분야에서 전략으로 간주됩니다[4-6].

증거는 IPC 촉진 신경 보호가 허혈 후 주요 단백질의 기능을 변경하는 전사, 번역 및 번역 후 메커니즘에 의존한다는 것을 보여줍니다[6-11]. 그러나 IPC로 유도된 허혈성 내성(IT)과 관련된 메커니즘은 인간의 뇌에서 완전히 밝혀지지 않았습니다[12,13].

IPC 매개 신경 보호를 이해하기 위한 새로운 실험적 접근 방식의 개발은 뇌졸중 환자의 뇌 손상을 최소화하기 위한 새로운 치료 목표를 공개할 가능성이 있는 뇌 IT[6]의 내인성 메커니즘을 해독하는 강력한 도구를 나타냅니다. 지난 20년 동안, 세포사멸 신경 세포 사멸은 대뇌 허혈 손상과 관련된 필수적인 메커니즘으로 자리 잡았습니다[14-16]. 이러한 의미에서 기능적 phosphoinositide kinase (PI3K) 활성화를 필요로 하는 serine/threonine kinase인 protein kinase B 또는 AKT는 허혈 후 신경 보호 요법의 필수 표적으로 간주되었습니다 [17,18].

최근에 우리는 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 억제가 흥분 독성에 대한 신경 세포의 감수성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다[19]. AKT는 조직 유형에 따라 다른 세포 이하 위치에 구성 요소가 존재할 수 있는 복잡한 항-아폽토시스 신호 네트워크[20]에 관여합니다[21,22]. 심장에서 AKT는 사전 조절 촉진 심장 보호에 관여했습니다[23].

증거는 또한 인산화된 AKT가 대뇌 허혈이 시작될 때 신경 생존을 촉진한다는 것을 보여줍니다[24]. AKT 활성화가 뇌의 IT 유도에 기여할 수 있지만 [25] IPC 매개 활성화와 관련된 정확한 메커니즘은 파악하기 어렵습니다. 종양 세포에서 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 활성화는 Ser166/186에서 MDM2 인산화를 유도하여 MDM2의 핵 전위를 촉진하고[26,27] 유비퀴틴화 활성을 향상시킵니다[28].

핵에서 MDM2는 p53에 결합하고 p53 기능을 억제하는 유비퀴틴화 및 후속 프로테아좀 분해를 촉진합니다[29]. 스트레스 조건에서 p53은 또한 MDM2 과발현을 유발할 수 있으며, 이는 역으로 네거티브 피드백 루프에서 p53 활성화를 억제합니다[30]. PI3K의 억제는 사전 조절된 심장에서 AKT 활성화[31] 및 MDM2 인산화를 방지합니다[32].

이러한 맥락에서, 우리는 이전에 생체 내 뇌 전처리가 MDM2 단백질 수준 발현을 증가시켜 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색(tMCAO) 후 경색 부피를 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 결과적으로, MDM2-p53 복합체는 일차 피질 뉴런에서 p53/PUMA/caspase-3 신호 전달 경로의 허혈 유발 활성화를 약화시켰습니다[33].

여기에서 우리는 후속 허혈성 손상에 대한 IPC 매개 신경 관용에서 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 역할과 기본 메커니즘을 파헤치고 주로 AKT 활성화와 MDM2-p53 복합체 사이의 잠재적 연결에 초점을 맞춥니다. .

2. 결과

2.1. IPC 촉진 신경보호

Ser473에서 AKT의 인산화, Ser166에서 MDM2의 인산화 및 p53 불안정화에 의해 매개됨 우리는 이전에 MDM2-p53 상호작용이 허혈[34] 및 IT[33]에 대한 신경 세포 감수성에 미치는 영향을 설명했습니다. 여기에서 우리는 MDM2-p53 경로에 관여하는 후보로서 IPC 매개 신경 보호에 대한 AKT의 잠재적 역할을 탐구했습니다.

첫째, 우리는 Ser473에서 AKT 인산화에 의해 입증된 바와 같이 허혈이 뉴런에서 AKT 활성화를 촉진한다는 것을 확인했습니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 짧은(20분) OGD는 p(Ser473)AKT 및 MDM2 발현을 유의하게 유도한 반면 AKT 단백질 수준은 변경되지 않은 상태로 유지되었습니다(그림 S1A). 그러나 뉴런이 장기간 OGD(90분)에 노출되었을 때 AKT 인산화는 관찰되지 않았다. 또한, MDM2 단백질 수준은 더 낮았으며, 이는 그림 1A에 표시된 것처럼 p53 단백질의 높은 발현과 일치합니다.

OGD 후 Mdm2 발현의 시간 의존적 상향 조절(그림 1B)은 아급성 허혈이 이전에 설명한 바와 같이 OGD 후 p53 안정화를 방지하는 메커니즘을 유도하는 데 중요할 수 있음을 확인합니다[33]. 짧은 OGD(20분)와 2시간의 재산소화를 IPC 모델로 사용했습니다(그림 S1B)[33]. 따라서 우리는 OGD(OGD/R) 후 또는 IPC 프로토콜(IPC + OGD/R)이 선행된 OGD 후 재산소화 4시간 후에 수집된 신경 추출물을 분석했습니다. 동시에, 뉴런은 정상 산소(Nx) 또는 사전 조건화(IPC) 설정에서 배양되었습니다(그림 S1B).

그림 1C와 그림 S1C에서 볼 수 있듯이 IPC는 Ser473에서의 인산화에 의해 밝혀진 바와 같이 AKT의 초기 활성화를 유도했으며[35], MDM2 단백질 안정화 및 Ser166에서의 인산화가 뒤따랐습니다. IPC는 또한 OGD/R에 의해 유도된 p53 안정화를 방지했습니다(그림 1C). 흥미롭게도, 그림 1D에 표시된 면역 형광 이미지는 IPC가 주로 핵에 축적되는 뉴런의 Ser473에서 AKT 인산화를 촉진하고 OGD/R(IPC + OGD/R) 후 p53 안정화를 감소시키는 것으로 나타났습니다. /아르 자형).

결과적으로, IPC는 유세포 분석법(그림 S1D) 및 형광 분석법(그림 S1E)으로 각각 측정한 바와 같이 OGD/R에 의해 유발된 신경세포 사멸 및 카스파제-3 활성화를 방지했습니다. IPC 매개 신경 보호에서 p53의 역할을 확인하기 위해 p53 단백질을 발현하는 뉴런(야생형; wt) 또는 그렇지 않은(knockout; ko) 뉴런을 사용했습니다. 우리의 결과는 p53이없는 뉴런 (그림 S1F)이 p53 wt 뉴런보다 OGD 유도 세포 사멸에 더 저항력이 있음을 보여줍니다.

또한, p53KO 뉴런의 세포사멸 수준은 전처리된(IPC + OGD/R) wt 뉴런에서 관찰된 수준과 유사했으며(그림 S1G), 따라서 IPC 매개 신경보호에서 p53 불안정화의 핵심 역할을 확인했습니다[33]. 우리의 결과는 IPC가 Ser473에서 AKT의 인산화, MDM2 안정화 및 Ser166에서의 인산화 및 p53 불안정화와 관련된 메커니즘을 통해 허혈성 모욕에 대한 신경 보호를 유도했음을 보여줍니다.

2.2. IPC는 PI3K/AKT 경로를 통해 Ser166에서 MDM2 인산화를 유발합니다.

PI3K/AKT 신호 전달 경로는 in vitro[36]와 in vivo[37] 모두에서 뉴런 IT에 관여합니다. 그러나 MDM2-p53 복합체의 조절에서 PI3K/AKT 경로의 IPC 매개 활성화 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이를 명확히 하기 위해 뉴런은 비가역적이고 PI3K/AKT 경로의 특정 억제제인 ​​wortmannin과 함께 배양되었습니다[19].

도 2A에 나타낸 바와 같이, 워트만닌은 도 1D에 나타낸 바와 같이 IPC 강화(Ser473)AKT 인산화 및 p53 불안정화를 제거하였다. 이러한 결과는 AKT 활성화와 OGD/R 후에 유도된 p53- 매개 신경 세포 사멸(그림 S1D) 및 카스파제-3 활성화(그림 S1E)의 억제 사이의 직접적인 연관성을 시사합니다. p53 안정화의 주요 조절자인 MDM2는 Ser166과 Ser186에서 MDM2를 인산화시키는 AKT[26]의 표적이다[26]. wortmannin에 의한 PI3K 억제는 IPC에 의해 유도된 (Ser473)AKT 및 (Ser166)MDM2 모두의 인산화를 방지했습니다(그림 2B).

IPC에 의해 유도된 Ser166에서 MDM2의 특정 Akt-매개 인산화는 AKT1 단백질(siAkt)에 대해 특별히 설계된 siRNA(small interfering RNA)를 사용하여 확인되었으며, 피질 뉴런에서 고도로 발현되고 이의 활성은 허혈 후 뉴런 생존에 필수적입니다. 38]. 그림 3에서 볼 수 있듯이 siAkt는 HEK-293T 세포(그림 3A)와 피질 뉴런(그림 3B) 모두에서 형질감염 후 3일째에 총 AKT 및 p(Ser473)AKT 단백질 수준을 감소시켰습니다.

또한, AKT 녹다운(siAkt)은 (Ser166)MDM2 인산화를 방지했습니다(그림 3B). 이러한 결과는 IPC 활성화 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 Ser166에서 MDM2 인산화를 촉진하며, 이는 허혈성 손상 후 MDM2 안정화 및 그에 따른 p53 불안정화를 담당할 수 있음을 보여줍니다.

2.3. IPC 활성화 AKT는 허혈 후 핵 MDM2 단백질 안정화를 유발합니다

AKT의 활성화는 종양 세포에서 MDM2의 핵 전좌와 관련되어 있습니다[26]. 허혈 후 신경 생존을 위한 핵 MDM2 안정화의 관련성과 [34], 더 구체적으로 IPC에서의 신경 보호 역할을 고려하여 [33], 우리는 MDM2의 세포하 국소화 조절에서 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 관련성을 추가로 조사하기로 결정했습니다. 단백질.

따라서 뉴런 또는 HEK-293T 세포를 인간 MDM2- 태그 단백질(MDM2-GFP)로 형질감염시켰습니다. 형질감염된 HEK-293T 세포의 대표적인 블롯과 4가지 다른 실험 조건(Nx, IPC, OGD/R 및 IPC + OGD/R) 후 인간 MDM2 단백질을 이소적으로 발현하는 뉴런의 이미지가 그림 4A 및 그림 S1H에 나와 있습니다. , 각각.

MDM2- GFP의 이소성 발현은 핵/세포질 형광 비율의 정량화에 의해 밝혀진 바와 같이 IPC가 조건화되지 않은 허혈성(OGD/R) 또는 정상 산소성(Nx) 뉴런과 비교하여 MDM2 핵 축적을 촉진함을 확인했습니다(그림 4A, B). (그림 S2B) 및 MDM2-GFP의 핵 형광 강도(그림 S2C).

2.4. IPC는 p(Ser473)AKT 및 MDM2 상호 작용을 촉진하여 핵에서 MDM2 안정화를 향상시키고 허혈 시 유도된 신경 세포 사멸을 감소시킵니다.

MDM2의 핵 안정화에서 PI3K/AKT 경로의 IPC 강화 활성화 역할을 입증한 후, p(Ser473)AKT와 MDM2가 핵 내에서 상호 작용하는지 여부를 추가로 조사했습니다(그림 6A). MDM2 및 p(Ser473)AKT에 대한 면역블롯팅에 따른 핵 단백질 추출물로부터의 MDM2 면역침전은 IPC가 OGD/R 후에 p(Ser473)AKT와 MDM2 사이의 상호작용을 촉진하여 OGD/R 유도된 핵 p53 안정화를 방지한다는 것을 밝혔습니다. 핵 입력에 표시된 대로(그림 6A).

마지막으로, 우리는 신경세포 사멸에 대한 PI3K/AKT 경로 파괴의 해로운 영향을 연구했습니다(그림 6B). AKT 억제는 IT의 맥락에서 AKT-MDM2의 신경 보호 역할을 확인하는 OGD 전에 IPC의 보호 효과를 중화했습니다. 따라서 우리의 결과는 IPC가 Ser166에서 MDM2 인산화를 촉진하는 AKT의 인산화 및 활성화와 p(Ser473)AKT와 상호작용하는 핵 전위를 유도한다는 것을 입증합니다. 이 메커니즘은 IPC로 유도된 허혈 내성에 필수적인 역할을 하는 MDM2의 향상된 핵 안정화에 기여할 수 있습니다.

Cistanche는 어떻게 뉴런을 보호합니까?

Cistanche가 세포 사멸(프로그램된 세포 사멸)을 줄이고 신경 생존을 촉진하여 신경 세포를 보호할 수 있다는 증거가 있습니다. Apoptosis는 손상되거나 원치 않는 세포를 제거하기 위해 신체에서 발생하는 자연스러운 과정이지만 과도하거나 부적절하게 발생하면 해로울 수 있습니다. Cistanche는 실험실 연구에서 세포 사멸을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이 효과는 손상으로부터 뉴런을 보호하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 Cistanche에는 신경 보호 효과가 있는 것으로 밝혀진 여러 생체 활성 화합물이 포함되어 있습니다. 예를 들어 산화 스트레스와 염증으로부터 뉴런을 보호하는 것으로 밝혀진 에키나코사이드가 포함되어 있습니다. 또한 항염증 및 항산화 특성이 있는 것으로 밝혀진 액티오사이드를 함유하고 있습니다.

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Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 및 마리아 델가도-에스테반 1,2,3,*

1 기능 생물학 및 유전체학 연구소, 살라망카 대학, CSIC, 37007 살라망카, 스페인; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); 아이린_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 살라망카 생의학 연구소, 살라망카 대학 병원, 살라망카 대학, CSIC, 37007 Salamanca, Spain

3 Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spain * 서신: mdesteban@usal.es ; 전화: 플러스 34-923-29-4908