고속 역류 크로마토그래피를 통한 Cistanches Deserticola YC Ma로부터 4가지 화합물의 분취 분리 및 정제

1. 소개

시스탄체스 데세르티콜라YC Ma의 일종시스탄체스그것은에 속한다오로바차과가족은 신장 결핍, 여성 불임, 병적 대하수체증, 신경 실행증 및 노인성 변비의 치료에 대해 잘 알려진 전통 중국 의학입니다[1]. 중국 서북부에 널리 분포하는 기생식물이다. 지금까지 다음을 포함한 여러 화합물이 사용되었습니다.페닐에타노이드 배당체(PhG), 이리도이드, 리그난이 이 종에서 분리되었습니다[2]. PhG 중 일부는 항산화, 간 보호 및 신경 보호 활동을 갖는 것으로 보고되었습니다 [3-6]. 그러나 PhG의 분리 및 정제 절차는 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 더욱이 기존의 다중 크로마토그래피 방법은 다량의 유기 용매를 사용할 뿐만 아니라 시료 회수율도 낮습니다. 지지대가 없는 액체-액체 분배 크로마토그래피 기술인 고속 역류 크로마토그래피(HSCCC)는 일부 기존 방법에 비해 탁월한 시료 회수율을 제공하며 다양한 천연물의 분리 및 정제에 널리 사용되어 왔습니다[7-9] . 여러 PhG가 정제되었지만시스탄체스속 및 기타 HSCCC [10-14]에 따르면 acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'-의 정제에 대해 보고한 논문은 없습니다. -L-람노피라노시드 및 2'-하나의 이상 시스템의 아세틸락티오사이드.

성기능 개선을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

이 논문에서는 C. Deserticola에서 4가지 PhG를 분리하고 정제하는 간단한 방법을 보고합니다. 최종적으로 30.9 mg의 액티오사이드, 13.0 mg의 이소액티오사이드, 12.5 mg의 시린갈라이드 A 3'- -L-rhamnopyranoside 및 7.2 mg의 2'-아세틸액티오사이드를 한 단계 분리로 얻었습니다. 순도가 각각 99%, 95%, 99%, 98%인 297mg의 분획물에서 추출됩니다. 이들의 구조는 1H 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터와 HR-MS 스펙트럼을 기반으로 특성화되었습니다. 이번 조사에서 확인된 4가지 PhG의 구조는 그림 1에 나와 있습니다.

2. 결과 및 고찰

2.1. 조추출물의 HPLC 분석

C. Deserticola로부터 n-부탄올 추출물의 성분 농축 분획을 HPLC-UV로 분석하였다. 사용된 컬럼은 Accurasil C18(250 mm × 4.6 mm, id 5 μm)(Thermo-Fisher Scientific Instruments, city, state abbrev, USA)이었고 이동상은 메탄올-물(30:70, v/v)이었습니다. 유속은 1mL/분이었습니다. 검출기 파장은 254 nm로 설정되었습니다. HPLC 크로마토그램은 그림 2에 나와 있습니다. 피크 1~4는 각각 액티오사이드(1), 아이소액티오사이드(2), 시린갈라이드 A 3'- -L-람노피라노사이드(3) 및 2'-아세틸액티오사이드(4)에 해당합니다. .

2.2. 2상 용매 시스템 선택

HSCCC에 의한 성공적인 분리는 적합한 2상 용매 시스템의 선택에 크게 좌우됩니다. 2상 용매 시스템은 각 대상 성분의 분배 계수 값(K)에 따라 선택되었으며 K의 최적 범위는 {{ 2}}.5 ~ 2.

면역력 향상을 위한 천연 시스탄체 투불로사 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

실험에서 여러 2상 용매 시스템의 대상 성분에 대한 K 값이 표 1에 나와 있습니다(피크 4의 경우 약간 더 높지만 결과는 허용 가능한 것으로 나타났습니다). 그 중 에틸아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)은 목적 화합물에 적합한 분배계수를 제공했습니다. 결국, 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)로 구성된 용매 시스템을 사용하여 C. Deserticola의 4가지 화합물을 분리하고 정제했습니다. 그림 3. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 각 HSCCC 분획의 HPLC 분석 결과 4개의 순수 PhG(acteoside, 99%; isoacteoside, 95%; syringalide A 3'{20}}L-rhamnopyranoside 99% 및 2'- 아세틸액티오사이드 98%)를 조분획으로부터 얻을 수 있었습니다.

3. 실험적

3.1. 장치 HSCCC

본 연구에 사용된 장비는 직렬로 연결된 3개의 예비 다층 코일 분리 컬럼(직경)을 갖춘 TBE{{0}}B 고속 역류 크로마토그래피 시스템(Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China)이었습니다. 튜브=2.6 mm, 총 부피=300 mL) 및 2{{1{21}}}} mL 샘플 루프. 회전반경 또는 원심분리기의 홀더축과 중심축(R) 사이의 거리(R)는 5 cm였으며, 그 값은 내부 단자에서 0.5에서 외부 단자에서 0.8(= r/R, 여기서 r은 코일에서 홀더 샤프트까지의 거리입니다. 실험에서 온도를 조절하기 위해 HX 105 항온 순환 장치(Beijing Changliu Lab Instrument Company, 베이징, 중국)를 사용했습니다. HSCCC 시스템에는 모델 TBP-5002 중간 압력 정유량 펌프, 254 nm에서 작동하는 모델 TBP-2000 UV 검출기 및 모델 V4.0 워크스테이션(Jinda Bio-chemistry Instrument)이 장착되었습니다. 회사, 중국 상하이).

사용된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장비는 G1312A 바이너리 펌프, G1329A 자동 샘플러, G1314A 가변 파장 검출기(VWD), G1316A 온도 조절 컬럼 구획, G1379B 탈기 장치 및 Agilent LC 워크스테이션으로 구성된 Agilent 1200 시스템이었습니다. . 순도 검출을 위해 alltech 3300 ELSD를 사용했습니다. Agilent 6520 Q-TOF 및 Bruker AVANCE III 500-NMR 분광계는 화합물의 구조 식별에 사용되었습니다. 1 H 및 13C-NMR 스펙트럼(각각 500 및 125 MHz)은 실온(22도/295.1 K)에서 측정되었습니다.

3.2. 시약 및 재료

에틸아세테이트, n-부탄올, 에탄올은 분석등급이었고, 메탄올은 HPLC 등급이었습니다. 모든 용매는 Tianjin Concord Technology Company(중국 천진)에서 구입했습니다. 모든 용액 및 희석에는 Milli-Q 물(18.2MΩ)(Millipore, Bedford, MA, USA)을 사용했습니다. C. Deserticola의 뿌리줄기는 2009년 6월 중국 내몽고 지역에서 채취되었습니다. 식물은 Lijuan Zhang 교수에 의해 확인되었으며, 바우처 표본(No. 20091001)이 우리 연구실에 기탁되었습니다.

3.3. 조 시료의 준비

C. Deserticola의 분말 공기 건조 다육질 줄기(1 Kg)를 수성 에탄올(8 L, 60% v/v)과 함께 매번 2시간 동안 2회 환류시켰습니다. 에탄올이 완전히 증발할 때까지 추출물을 감압 하에 60도 온도에서 증발시켰다. 잔류물을 물에 현탁시키고 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올로 3회 연속 추출하여 감압 하에서 증발 건조시킨 후 n-부탄올 추출물 5.16g을 얻었다. 그런 다음 n-부탄산 추출물을 점진적 구배 용리(CHCl3-MeOH, 10:1→1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼(200-300 메시)에서 분리하여 8개의 분획을 얻었습니다. 분획 6(297 mg)은 추가 HSCCC 분리 및 분리를 위해 사용되었습니다.

천연 시스탄체 투불로사 중국 전통 의학 PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. 2상 용매 시스템 선택

2상 용매 시스템은 C. Deserticola 분획 내 표적 성분의 분배 계수(K)에 따라 선택되었습니다. K 값은 다음과 같이 LC 분석에 의해 결정되었습니다. 적절한 양의 조 추출물 분말(분획 6)을 용매 시스템의 하부 상에 용해시키고 HPLC로 분석했습니다. 피크의 면적은 A1으로 기록되었습니다. 그런 다음 동일한 부피의 상부 상을 용액에 첨가하고 완전히 혼합하여 분배 평형에 도달했습니다. 그 다음 하부 상을 HPLC로 다시 분석했습니다. 후자의 피크 영역은 A2로 기록되었습니다. K-값은 다음 방정식에 따라 계산되었습니다: K= (A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. 2상 용매 시스템 및 샘플 용액 준비

본 연구에서는 HSCCC 분리를 위해 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v)로 구성된 2상 용매 시스템을 사용했습니다. 각 용매를 분별 깔때기에 첨가하고 실온에서 완전히 평형을 이루도록 했습니다. 상부 상과 하부 상을 분리하고 사용 직전에 30분 동안 초음파 처리하여 탈기했습니다. 샘플 용액은 분획 6 297mg을 하부 에틸 아세테이트-n-부탄올-에탄올-물(40:6:6:50, v/v/v/v) 15mL에 용해하여 제조되었습니다.

3.6. HSCCC 분리 절차

HSCCC는 다음과 같이 수행되었습니다. 다층 코일형 컬럼은 먼저 상부 유기 고정상으로 채워졌습니다. 이어서 하부 수성 이동상을 1.5 mL/분의 유속으로 컬럼의 헤드 끝으로 펌핑하고 동시에 HSCCC 장치를 900 rpm의 회전 속도로 작동시켰습니다. 꼬리 출구에서 투명한 이동상이 용출되는 것으로 표시된 바와 같이 유체역학적 평형이 확립된 후(약 2시간 후), 297mg의 조 추출물(분획 6)을 함유하는 15mL 샘플 용액을 주입 밸브를 통해 주입했습니다. 컬럼의 유출물은 254nm에서 지속적으로 모니터링되었습니다. 크로마토그램에 따라 4개의 피크 분획을 수집한 후 감압 하에 증발시켰습니다. 장치의 온도는 25도로 설정되었습니다.

3.7. HSCCC 피크 분획의 HPLC 분석 및 식별

HSCCC의 피크 분획을 HPLC-ELSD로 분석했습니다. 사용된 컬럼은 Accurasil C18(250mm×4.6mm, id 5μm)이었으며, 이동상은 메탄올-물(30:70, v/v)이었다. 유속은 1mL/분이었습니다. ELSD는 온도 45도, 가스 1.6L/min의 조건에서 작동되었습니다. 4개의 HSCCC 피크 분획의 구조적 식별은 HR-ESI-MS, 1H 및 13C-NMR 분광학에 의해 수행되었습니다.

3.8. 구조적 식별

분획 I: m/z 623.2001(MH)−에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O15에 대한 계산치, 623.1981. 1 H-NMR(500MHz, CD3OD) δppm: 1.09(3H, d, J=6Hz, 람노스의 CH3), 2.79(2H, t, J=7.5Hz, Ar- CH2-), 4.37(1H, d, J=8Hz, H-1의 포도당), 5.18(1H, d, J=1Hz, H{{34 }} 람노스), 6.27(1H, d, J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 7.59(1H, d, J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.1(6H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δppm: 131.5(C-1), 117.2(C-2), 146.2(C-3), 144.7(C-4 ), 116.4(C-5), 121.3(C-6), 72.4(C- ), 36.6(C- ), 127.7(Caf-1), 115.3(Caf{{89 }}), 146.9(Caf-3), 149.8(Caf-4), 116.6(Caf-5), 123.2(Caf{101}}), 168.3(Caf- ), 114.8(Caf-), 148.1(Caf-), 104.3(G-1), 76.1(Glc-2), 81.7(Glc-3), 70.5(Glc-4 ), 76.3(Glc-5), 62.4(Glc-6), 103.1(Rha-1), 72.3(Rha-2), 72.1(Rha-3 ), 73.9(Rha-4), 70.7(Rha-5), 18.5(Rha-6). 문헌[17]에 제공된 데이터와 비교하면, 분획 I은 액티오사이드에 해당합니다.

분획 II: m/z 623.1987(MH)−에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O15에 대해 계산됨, 623.1981. 1 H-NMR(500MHz, CD3OD) δppm: 1.25(3H, d, J=6.5Hz, 람노스의 CH3), 2.78(2H, t, J=7Hz, Ar-CH2-), 4.33(1H, d, J=8Hz, H-1 글루코스), 5.17(1H, d, J { {33}}Hz, H-1 람노스), 6.28(1H, d, J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 7.56(1H, d, J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0(6H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δppm: 131.5(C-1), 117.2(C-2), 146.2(C-3), 144.7(C-4 ), 116.5(C-5), 121.3(C-6), 72.4(C- ), 36.7(C- ), 127.8(Caf-1), 115.2(Caf{{89 }}), 146.8(Caf-3), 149.7(Caf-4), 116.6(Caf-5), 123.2(Caf{101}}), 169.2(Caf- ), 115.0(Caf-), 147.3(Caf-), 104.5(G-1), 75.5(Glc-2), 84.2(Glc-3), 70.1(Glc-4 ), 75.7(Glc-5), 64.7(Glc-6), 102.8(Rha-1), 72.4(Rha-2), 72.4(Rha-3 ), 74.1(Rha-4), 70.5(Rha-5), 17.9(Rha-6). 1 H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터는 문헌에 보고된 바와 같이 isoacteoside의 데이터와 일치했습니다[18].

분수 III: m/z 6{{1{129}}8}}7.2032(MH)−에서 관찰된 HR-ESI-MS, C29H35O14에 대해 계산됨, 607.2032. 1 H-NMR(500MHz, CD3OD) δppm: 1.09(3H, d, J=6Hz, 람노스의 CH3), 2.84(2H, t, J=7.5Hz, Ar- CH2-), 4.37(1H, d, J=8Hz, H-1의 포도당), 5.19(1H, d, J=1.5Hz, H{ {35}} 람노스), 6.27(1H, d, J=16Hz, Ar-CH=CH-), 7.59(1H, d, J=16Hz, Ar- CH=CH-), 6.6–7.1 (7H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δppm: 130.8(C-1), 116.2(C-2), 130.9(C-3), 156.8(C-4 ), 130.8(C-5), 116.2(C-6), 72.4(C- ), 36.4(C- ), 127.8(Caf-1), 114.8(Caf{{88 }}), 149.8(Caf-3), 146.9(Caf-4), 116.6(Caf-5), 123.2(Caf-6), 168.3(Caf- ), 115.4(Caf-), 148.0(Caf-), 104.3(G-1), 76.3(Glc-2), 81.7(Glc-3), 70.4(Glc-4 ), 76.1(Glc-5), 62.5(Glc-6), 103.0(Rha-1), 72.3(Rha-2), 72.2(Rha-3 ), 73.9(Rha-4), 70.7(Rha-5), 18.4(Rha-6). 문헌[18]에 따르면 분획 III은 시린갈리드 A 3'- -L-람노피라노사이드에 해당합니다.

분획 IV: m/z 665.21{{20}} (M−H)−에서 관찰된 HR-ESI-MS, C31H37O16에 대한 계산치, 665.2087. 1 H-NMR(500MHz, CD3OD) δppm: 1.09(3H, d, J=6.5Hz, 람노스의 CH3), 2.00(3H, s, OAc), 2.72(2H, t, J=7.5Hz, Ar-CH2-), 4.55(1H, d, J=8Hz, H-1 글루코스), 4.90(1H, d, J=1Hz, H-1 람노스), 6.29(1H, d, J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 7.62(1H, d , J=15.5Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0(6H, 방향족 H). 13C-NMR(125MHz, CD3OD) δppm: 131.9(C-1), 117.3(C-2), 146.1(C-3), 144.7(C-4 ), 116.4(C-5), 121.4(C-6), 72.7(C-), 36.4(C-), 127.7(Caf-1), 115.4(Caf{{93 }}), 146.9(Caf-3), 149.9(Caf-4), 116.6(Caf{102}}), 123.2(Caf-6), 168.1(Caf- ), 114.7(Caf-), 148.2(Caf-), 101.8(G-1), 75.3(Glc-2), 80.3(Glc-3), 70.8(Glc-4 ), 76.2(Glc-5), 62.3(Glc-6), 103.3(Rha-1), 72.0(Rha-2), 71.8(Rha-3 ), 73.7(Rha-4), 70.8(Rha-5), 18.5(Rha-6), 171.5(C=O), 20.9(OAC). 1 H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터는 2'-아세틸액티오사이드의 데이터와 일치했습니다[17].

4. 결론

Cistanches Deserticola YC Ma의 acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside 및 2'-아세틸acteoside의 제조 분리 및 정제를 위한 HSCCC 방법이 확립되었습니다. 본 연구는 HSCCC가 식물 재료에서 생리활성 성분을 예비 분리 및 정제하는 데 매우 강력한 기술임을 나타냅니다. 또한, 화합물은 고순도로 충분히 대규모로 분리될 수 있으며 크로마토그래피 또는 생체 활성 연구를 위한 참조 물질로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 천연 제품의 신속한 제조 분리를 위한 실행 가능하고 경제적이며 효율적인 기술입니다.

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