사전 공포 학습을 통해 새로운 공포 기억을 대뇌 피질 네트워크에 직접 빠르게 동화시킬 수 있습니다. 2부
Sep 25, 2023
사전 상황별 공포 학습을 통해 전대상 피질이 새로운 기억을 즉시 인코딩할 수 있습니다.
현재까지 우리는 청각적 공포 기억에서 시스템 통합의 역학을 조사했습니다. 그러나 시스템 통합 모델은 대부분 해마 의존 기억에 대한 연구에서 비롯됩니다.
청각적 공포는 사람들의 일상생활에 큰 영향을 미칠 수 있는 매우 흔한 심리적 문제입니다. 청각공포증이 발생하면 사람들은 매우 불편함을 느낄 수 있으며, 심지어 다양한 건강상의 문제를 일으킬 수도 있습니다. 그러나 동시에 청각적 두려움이 기억력을 향상시킬 수 있음을 입증하는 실험도 있습니다.
최근 몇 년 동안 연구자들은 청각 공포증이 있는 사람들이 다른 사람들보다 주의력이 더 뛰어나고 예민하다는 사실을 발견했습니다. 그들의 뇌는 소리 자극에 더 강력하고 빠르게 반응합니다. 이 반응은 아이들을 삶의 소리에 더욱 민감하게 만듭니다. 어떤 경우에는 다양한 정보를 더 잘 처리하고 소리에서 더 유용한 단서를 얻어 잠재적으로 전반적인 기억력을 향상시킬 수 있습니다.
사람이 긴장하거나 불안한 감정 상태에 있을 때 뇌는 아드레날린이라는 물질을 방출합니다. 이 물질은 뇌 뉴런의 활동을 촉진하고 사람들의 집중력을 높일 수 있습니다. 따라서 청각적 공포 상태에서 아드레날린이 방출되면 청취자의 집중력과 기억력이 향상됩니다.
동시에 오디오 공포 자극이 지속되면 뇌는 소리에 대한 더 깊은 기억을 구축하여 이 자극에 적응할 수 있습니다. 이 기억은 환자가 다양한 소리 자극에 더 잘 반응하도록 도와주어 환자가 더욱 자신감 있고 독립적이 되도록 해줍니다.
따라서 청각적 공포는 사람들의 일상생활에 많은 불편을 초래할 수 있지만, 기억력에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 사람들이 이러한 심리적 문제를 다루는 방법을 배우면 두려움을 극복하고 심지어 그로부터 유익을 얻을 수도 있습니다. 이는 또한 우리가 더 나은 삶을 살기 위해서는 심리적 문제를 올바르게 보고, 정신 건강에 주의를 기울이고, 어려움에 대처할 때 긍정적인 태도를 취해야 함을 상기시켜 줍니다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. Cistanche Deserticola는 아세틸콜린 및 성장 인자 수치를 높이는 등 신경 전달 물질의 균형을 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 고기는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양분과 에너지를 공급하여 뇌의 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
이러한 기억은 처음에는 해마와 피질 수준 모두에서 형성되는 것으로 생각됩니다. 시간이 지남에 따라 해마와 피질 네트워크 사이의 조화로운 상호 작용은 결국 원격 기억을 저장하는 피질 회로의 점진적인 리모델링으로 이어집니다[1-5]. 이에 맞춰, 순진한 동물에서 해마 의존성 공포 기억, 즉 맥락적 공포 기억은 처음에는 해마에 의존하다가 점차 ACC와 전전두엽 피질을 포괄하는 피질 네트워크에 의존하게 됩니다[1,2,6-8 ].
따라서 우리는 이전 메모리의 시스템 통합이 이전에 발생한 경우 이러한 시간 의존적 재구성이 다르게 발생했는지 여부를 고려했습니다. 쥐는 맥락을 미국과 연관시키도록 훈련되었습니다. 2주 전에 한 그룹의 쥐는 다른 상황과 미국 사이의 또 다른 연관성(CtxA-CtxB)을 배웠고, 다른 그룹은 상황에 따른 공포 학습을 방해하는 즉각적인 고통스러운 자극만 받았습니다(충격-CtxB)(S1A 그림). 상황별 학습 후 24시간에 동물에게 CNQX 또는 식염수를 ACC에 주입했습니다(그림 4A 및 S1B).
이전 연구[1,6,8]에 따르면, 이전에 또 다른 공포 연관성을 학습하지 않은 동물에서 ACC의 비활성화는 CtxB의 동결을 영향을 받지 않은 상태로 남겨두었으므로 이 조작이 최근 기억에 영향을 미치지 않았음을 시사합니다. 그러나 청각 공포 학습에서 얻은 데이터와 유사하게 ACC의 비활성화는 이전 상황에 따른 공포 연관성을 학습한 쥐의 최근 CtxB에 대한 동결을 감소시켰습니다(그림 4B 및 4C).
이 현상은 두 가지 공포 사건이 단지 7시간 또는 24시간 간격으로 분리된 동물과 두 공포 사건이 모두 발생한 후 24시간 후에 ACC가 비활성화된 동물에서는 나타나지 않았기 때문에 첫 번째 기억의 느린 시스템 통합의 발달과 인과적으로 관련이 있었습니다. 첫 번째와 두 번째 상황적 공포 학습. 더욱이 US가 없는 상태에서 첫 번째 컨텍스트 탐색을 경험한 쥐(Context-CtxB 그룹)에서는 이 현상이 없었습니다(그림 4D 및 4E).
비판적으로, 학습 후 1시간 동안 수행된 ACC의 비활성화는 최근 공포 기억에도 영향을 미쳤습니다(그림 4F 및 4G). 이 시점에서 아니소마이신 투여는 이전에 상황에 따른 공포 학습을 경험한 동물의 CtxB에 대한 동결을 감소시켰습니다(그림 4H 및 4I). 이러한 데이터는 일단 첫 번째 공포 사건이 기억되면 시냅스 강화 메커니즘만 사용하여 신피질이 즉시 새로운 기억에 필수적이라는 아이디어를 뒷받침합니다.
사전 상황별 공포 학습은 ACC-BLA 예측을 재구성하여 최근 기억을 지원합니다.
다음으로 우리는 순진한 동물의 원격 기억 보유 중에 모집된 신경 연결이 이전에 또 다른 상황적 공포 기억을 학습한 동물의 최근 기억 보유에도 참여할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 이를 위해 우리는 ACC에서 BLA로의 최근 및 원격 상황별 기억 유지에 대한 예측의 참여를 조사했습니다.
이전 연구에서는 전두엽 피질에서 BLA로 투사된 축삭 말단의 광유전학적 억제가 순진한 동물의 원격 시점에서는 아니지만 최근 시점에서는 상황에 따른 공포 기억 유지를 손상시키는 것으로 나타났습니다[7]. 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry) 또는 대조 벡터(AAV5-CaMKIIa-mCherry)를 다음과 같이 두 그룹으로 나누어 ACC에 주입했습니다. 위에서 설명한 실험 (그림 5A-5C 및 S3C). eNpHR3.0-mCherry 벡터가 주입되고 이전에 뚜렷한 context-US 연관을 학습한 동물에서만 최근 상황별 공포 기억 유지 동안 BLA에서 ACC 말단의 광유전학적 억제가 CtxB에 대한 동결을 손상시켰습니다(그림 5D). ).
이 그룹에서는 BLA에서 ACC 말단의 후속 억제로 인해 CtxA에 대한 동결이 크게 감소하여 원격 컨텍스트-US 연관 유지에도 영향을 미쳤음을 나타냅니다(그림 5E). 이러한 결과는 첫 번째 공포 사건에 대한 원격 기억과 새로운 유사한 사건에 대한 최근 기억을 유지하는 데 동일한 신경 경로가 필수적이라는 아이디어를 뒷받침합니다. 이 데이터는 또한 첫 번째 기억에 의해 유도된 BLA로 내려가는 피질 경로의 재배열이 청각 및 상황적 공포 기억 모두에 대한 일반적인 과정임을 시사합니다.
사전 공포 학습 후, 등쪽 해마와 ACC는 모두 새로운 기억 형성에 필요합니다.
이러한 발견은 이전에 상황에 따른 공포 학습이 발생한 경우에도 해마가 새로운 기억을 형성하는지 여부에 대한 의문을 제기합니다. 또는 해마가 없더라도 피질이 새로운 기억을 형성할 수도 있습니다. 이러한 질문에 답하기 위해 위 실험과 유사한 두 그룹의 상황별 공포 학습 후 1시간 후에 해마를 비활성화했습니다.
시스템 통합에 관한 대부분의 문헌은 해마가 영구적으로 파괴된 연구에서 나왔기 때문에 우리는 학습 후 1시간 후에 등쪽 해마를 비가역적으로 병변화하는 것으로 시작했습니다(그림 6A-6C). 해마 병변은 두 그룹 모두에서 CtxB에 대한 동결이 크게 감소했습니다(그림 6C). 흥분독성 병변은 ACC와 같은 해마 외부 뇌 영역의 활동을 일시적으로 방해할 수 있기 때문에 우리는 국소 AMPA 글루타메이트 수용체를 차단하기 위해 CNQX로 등쪽 해마를 비활성화하여 이 실험을 반복했으며 두 그룹 모두에서 기억 상실 효과를 발견했습니다(그림 6D 및 6E). ).
이러한 결과는 이전에 공포 학습이 발생했는지 여부에 관계없이 새로운 상황별 기억을 형성하는 데 해마가 필요하다는 것을 보여주었습니다. 위의 결과와 함께, 이 데이터는 또한 이전에 상황에 따른 공포 사건을 학습한 동물에서 최근 공포 기억을 형성하는 데 해마와 ACC가 모두 필요하며, 이들 사이트 중 어느 것도 부재 시 기억 형성을 지원할 수 없음을 나타냅니다. 다른 것.
우리는 학습 후 해마 병변을 1주일로 지연시켜 해마 침범의 시간 경과를 조사했습니다. 이전 연구 결과와 일치하여[46], 해마 병변은 이전에 다른 공포 연관성을 배운 적이 없는 동물의 기억 형성에 여전히 영향을 미쳤습니다. 반대로, 이전 공포 사건을 학습한 그룹에서는 해마 병변이 기억 유지에 영향을 미치지 않았으며(그림 6F 및 6G), 이는 이전 공포 기억이 해마 관련 기간(2주에서 1주로)을 단축함을 시사합니다. 공간 학습에서도 관찰되었습니다 [3,20,21].
논의
본 연구에서 우리는 청각 공포 기억의 사전 시스템 통합을 통해 Te2가 시냅스 통합을 통해 새로운 청각 공포 기억을 즉시 인코딩할 수 있음을 발견했습니다. 더욱이, 이전 학습을 통합하는 동안 활성화된 Te2에서 BLA로의 하강 투영은 새로운 청각 공포 기억의 형성에 필요해집니다.
해마 의존적 상황별 공포 학습에서도 비슷한 결과가 관찰되었습니다. 후자의 작업에서 우리는 또한 사전 학습이 최근 상황별 공포 학습에서 해마 참여 기간을 단축한다는 것을 발견했습니다. 종합해 보면, 우리의 연구 결과는 사전 학습이 뇌 회로를 재구성하여 새로운 유사한 정보가 피질 구조에서 즉시 학습될 것임을 시사합니다.
해마 의존 기억의 시스템 통합에 대한 현재 개념은 해마가 시간 제한 방식으로 관여하고 시간이 지남에 따라 뇌 회로 재구성의 점진적인 과정이 발생하여 피질 네트워크가 점진적으로 더 중요해진다고 가정합니다[1-5].
대체 이론도 존재하지만[47], 수많은 연구는 인간과 동물 모델 모두에서 기억 과정에서 해마의 시간적으로 제한된 역할을 뒷받침합니다[1-3]. 반대로, 시간이 지남에 따라 기억을 지원하는 뇌 회로의 재구성은 주로 동물 모델에서 입증되었지만 인간에서의 증거는 더 논란의 여지가 있습니다 [3].
일부 연구에 따르면 인간의 기억 검색 중 해마 활동은 몇 주 및 몇 달에 걸쳐 점진적으로 감소하는 반면, 복부 내측 전두엽 영역[48], 측두 신피질[49] 또는 피질 영역 간의 연결성[48]의 활동이 크게 증가했습니다. 오히려 최근 연구에서는 해마의 활동이 시간이 지남에 따라 감소하더라도 피질의 활동은 시간이 지나도 안정적으로 유지되거나[50], 감소하는 것으로 나타났습니다[51]. 시간이 지남에 따라 기억을 지원하는 뇌 회로의 재구성에 대한 보다 일관된 증거가 동물에서 얻어졌습니다[1-3]. 이 연구는 실험적으로 경험이 없는 동물을 대상으로 수행되었습니다.
이전에 공포 기억을 형성한 동물에서 이 문제를 조사함으로써 우리는 이전 공포 학습이 발생했는지 여부에 관계없이 새로운 기억을 형성하는 데 해마가 필요하다는 것을 발견했습니다. 그러나 첫 번째 학습에 의해 촉발된 뇌 회로의 재구성은 단순히 시냅스 강화의 세포 메커니즘을 통해 신피질이 새로운 기억을 즉시 인코딩할 수 있게 해줍니다. 이 현상은 해마 의존적 및 독립적 공포 기억 모두에 적용되며 특히 초기 학습 이벤트에 의해 촉발된 느린 시스템 통합에 의해 유발되었습니다.
2번의 학습 시도가 시간적으로 서로 가까운(몇 시간 또는 1일) 쥐와 첫 번째 학습 후 피질의 비활성화로 인해 피질의 재배열이 불가능하고 이후에 새로운 물질의 빠른 동화에 관여하는 쥐에서는 나타나지 않았습니다. 추억. 더욱이, 첫 번째 공포 학습이 뇌 연결성을 재구성하면 피질에서 BLA로 내려가는 경로는 순진한 쥐에서처럼 원격 기억을 유지하는 데뿐만 아니라 최근의 기억에도 필요합니다. 우리는 유사한 기억이 이전에 인코딩된 경우 뇌 회로의 재구성이 이미 발생했으며 새로운 기억의 형성에 더 이상 필요하지 않을 수 있으며, 반대로 피질과 피질하 부위와의 상호 작용이 즉시 관련된다는 결론을 내립니다.
순진한 동물에서 시간에 따른 뇌 회로의 재구성을 보여주는 수많은 연구에도 불구하고, 이 과정의 정확한 목적은 아직 정의되지 않았습니다. 기억과 관련된 행동 반응은 시간이 지나도 유사하게 유지될 수 있기 때문에 이 과정은 시간이 지남에 따라 기억 안정성을 향상시키는 역할을 하는 것으로 생각됩니다[1,2,52]. 우리의 연구 결과를 바탕으로 우리는 시스템 통합 모델에 설명된 대로 공포 사건이 처음 발생할 때 뇌 회로가 장기간의 재구성 과정을 겪는다고 제안합니다. 이 과정은 공포 기억을 영구적으로 저장하는 신경망을 재배열하여 시냅스 강화 메커니즘을 통해 새로운 유사 정보를 즉시 획득할 수 있도록 하는 역할을 할 수 있습니다. 실제로 이러한 운영 메커니즘은 새로운 관련 정보를 획득하기 위한 자원 지출을 줄여 새로운 관련 없는 정보를 학습하는 데 더 많은 자원을 할당할 수 있기 때문에 새로운 학습을 더욱 "경제적"으로 만들 수 있습니다.
우리 연구 결과에서 발생하는 중요한 질문은 사전 학습이 신경망을 영구적으로 변경하여 유사한 경험이 아주 먼 시간 간격으로 발생하더라도 신피질에 즉시 저장될 수 있는지 여부입니다. 또는 새로운 유사한 경험이 곧 발생하지 않으면 시스템이 순진한 동물의 초기 수준으로 재설정될 수도 있습니다. 첫 번째 학습과 두 번째 학습 사이의 시간 간격을 늘리면서 신피질의 관련성을 평가하는 실험을 통해 이 점을 명확히 할 수 있습니다.
우리는 또한 첫 번째 경험의 초기 통합 동안 신피질의 봉쇄가 신피질에 대한 새로운 유사한 경험의 즉각적인 할당을 방해한다는 것을 발견했습니다(그림 1F 및 4D 참조). 이러한 결과는 신피질 내에서 첫 번째 학습 직후에 발생하는 세포 과정이 시스템 기억 통합 과정에서 신피질을 모집하는 데 필요함을 시사합니다. 이 아이디어는 일부 "태그된" 세포가 순진한 동물의 학습 시 신피질 내에서 활성화되고 원격이지만 최근 기억은 아닌 기억을 저장하는 역할을 한다는 연구 결과와 일치합니다[7,8,12,44]. 이러한 세포가 사전 학습 후에도 이 역할을 하는지, 아니면 최근 기억 형성에도 참여하는지 여부를 명확히 하기 위한 향후 연구가 필요합니다.
원래 시스템 통합 모델은 해마가 새로운 정보를 빠르게 학습하는 반면 신피질은 느리게 학습한다는 추가적인 아이디어를 이끌어 냈지만 후속 연구에서는 신피질도 빠른 학습 과정을 수행할 수 있음이 입증되었습니다[3,20,21,53]. 우리의 데이터에 따르면 이전에 유사한 사건이 발생한 경우 2개의 서로 다른 피질(Te2 및 ACC)이 즉시 새로운 정보를 학습할 수 있습니다.
이전 연구[10,16,17,34,43,45]에 따르면 Te2라는 용어를 사용하여 Zilles의 연구[24,25]에 기반한 벨트 청각 영역의 가장 뒤쪽 영역을 나타냅니다. 시간적 연관성과 외후각 영역. 우리의 결과가 주변 영역, 즉 인접한 시각 피질, 일차 청각 피질 및 주변 피질에서도 약물 효과의 기여를 반영할 수 있다는 점을 배제할 수는 없지만, 순진한 동물에서 얻은 데이터는 주로 Te의 비활성화로 인한 것임을 시사합니다. .
우리는 순진한 동물에서 Te2가 원격 청각 기억에 필요하지만 최근 청각 기억에는 필요하지 않은 반면, 인접한 시각 피질의 비활성화는 원격 청각 기억에 영향을 주지 않는다는 것을 발견했습니다[10]. 반대로, 일차 피질과 Te2 피질의 결합된 차단은 최근 기억도 손상시킵니다[34]. 마찬가지로, 전후각주위 피질의 비활성화는 공포 기억을 손상시키는 반면[32,54], 후후후각 피질의 비활성화는 최근[54] 및 원격[10] 공포 기억에 영향을 미치지 않았습니다.
또한 ACC 및 상황적 공포 기억의 경우, 인접한 일차 및 이차 운동 피질의 비활성화는 최근 및 원격 기억에 영향을 미치지 않은 반면[55], 인접한 전변연 피질의 비활성화는 최근 및 원격 기억 모두 손상되었습니다[11].
기억 과정에서 이러한 피질이 수행하는 역할과 관련하여 Te2는 소리와 짝을 이루는 감정적 가치의 기억에 참여합니다[10,13,16,56]. 이 아이디어는 최근 고차원 시각 피질에서도 입증되었습니다[57,58]. 반면에 ACC는 기억을 형성하고 저장할 수 있지만 다른 피질 영역의 활동을 조절할 수도 있습니다[1-3,6].
Te2와 ACC가 원격 기억에는 필요하지만 최근 기억에는 필요하지 않다는 것을 보여주는 많은 연구에도 불구하고, 최근 일부 연구에서는 이러한 피질이 최근 청각[34,59] 및 상황적[55] 공포 기억을 유지하는데 필요할 수 있다고 보고했습니다. 최근 기억에 대한 이러한 피질의 필요성을 결정할 수 있는 정확한 경계 조건은 잘 알려져 있지 않습니다.
이러한 연구 중 하나는 감정적 경험의 강도가 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했지만[34], 향후 연구에서는 이 문제를 더 잘 다루어야 합니다. 향후 연구에서는 또한 순진한 동물의 학습 시 신피질 내에서 활성화되고 최근 기억은 아니지만 먼 기억을 저장하는 역할을 하는 세포[7,8,12,44]가 이전 연구 이후에도 이러한 역할을 하는지 여부를 명확히 해야 합니다. 학습 여부, 또는 최근 기억 형성에 참여하는지 여부.
기억 과정에 대한 해마 참여와 관련하여, 여기서 우리는 이전 맥락 학습이 발생한 경우에도 새로운 맥락 기억을 학습하는 데 등쪽 해마가 필요하다는 것을 발견했습니다. 원격 기억과 최근 상황 기억을 모두 학습한 쥐를 대상으로 피험자 내 설계를 수행함으로써 유사한 결과가 관찰되었습니다[60]. 한편, 해마에서 후속 학습을 중재하는 세포 메커니즘이 이전 학습 시험 동안 관련된 메커니즘과 다를 수 있다는 것도 나타났습니다[22,61].
우리는 또한 처음으로 상황에 따른 두려움을 경험한 동물의 경우, 순진한 동물의 이전 발견과 일치하여 학습 후 1주일에도 해마가 필요하다는 것을 발견했습니다[46]. 반대로, 다른 그룹에서는 해마 병변이 이 시간 간격에서 기억 유지에 영향을 미치지 않았으며, 이는 공간 학습에서도 관찰된 것처럼 사전 공포 학습이 해마 관련 시간 창을 단축한다는 것을 시사합니다[3,20,21]. 따라서 이러한 연구와 현재 연구는 해마 병변에 의해 유발된 시간적 기억상실의 시간 창이 공간적 기억과 감정적 기억 모두에서 이전에 학습된 경험에 달려 있다는 수렴 증거를 제공합니다.
해당 연구에서 저자는 또한 공간 작업에서 장기간 동안 쥐를 훈련하면 새로운 관련 정보가 빠르게 동화될 수 있는 지식의 "정신적" 스키마가 생성된다고 제안했습니다[3,20,21,53]. 우리의 연구 결과가 이 아이디어와 일치할 수도 있지만, 두려움 학습에 대한 하나의 시도가 지식의 연관 "스키마"를 형성할 수 있는지, 그리고 다른 환경에서 발생하는 새롭고 다른 사건이 이 스키마 내에 통합될 수 있는지 말하기는 매우 어렵습니다. . 이 문제를 명확히하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 어쨌든 인간과 다른 동물의 대부분의 기억은 과거 경험을 바탕으로 구축되었다는 점을 고려할 때 처음으로 원격 공포 기억을 저장하는 뇌 네트워크는 일생 동안 최근 및 원격 공포 기억을 모두 인코딩하는 네트워크일 수 있습니다.
방법 실험 모델 및 주제 세부 사항
동물
내부 동물 시설에서 파생된 건강한 수컷 Wistar 쥐(연령, 65~70일, 체중, 250~350g, 야생형)를 케이지당 3마리씩 사육했으며, 12시간 조명 하에서 자유롭게 음식과 물을 섭취할 수 있었습니다. /22 ± 1˚C의 일정한 온도에서 암흑 주기(오전 7:00에 켜짐). 모든 실험은 이탈리아 보건부(승인 번호 408/2020-PR)와 토리노 대학교 지역 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
실험적 설계
데이터 재현성은 다양한 반복실험을 통해 평가되었습니다(S1 표). Te2의 첫 번째 CNQX 비활성화 실험(그림 1A-1C)은 우리가 수행한 첫 번째 실험이고 우리 연구의 주요 가설을 테스트하는 데 사용되었기 때문에 더 많은 반복 횟수로 수행되었습니다. 동물은 체중 균형 방식으로 다양한 행동 그룹에 선험적으로 할당되었습니다.
동일한 무리의 수컷 동물을 각 실험 그룹에 무작위로 할당했습니다. 우리는 먼저 우리 연구의 주요 가설을 다루었습니다. 즉, 대뇌 피질의 비활성화는 실험적으로 순진한 쥐와 이전 공포 사건을 배운 동물의 새로운 공포 기억의 통합에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다. 이들 그룹 사이에 통계적 차이가 있는 경우, 결국 식염수 주입을 통해 추가 대조 그룹을 수행했습니다. 유사한 접근법이 광유전학 실험에 적용되었으며, AAV 대조군은 순진한 쥐와 이전에 훈련된 쥐 사이의 통계적 차이가 감지된 후에만 수행되었습니다. 이러한 실험 일정을 통해 우리는 동물 실험에 관한 유럽 및 이탈리아 법률(3 Rs 원칙)의 주요 문제인 불필요한 통제 그룹과 불필요한 동물의 사용을 피할 수 있었습니다.
행동 절차
모든 실험은 하루 중 가벼운 단계(오전 8시부터 오후 4시) 동안 수행되었습니다. 동물은 실험 요구 사항에 따라 서로 다른 작은 투명 버킷 내에서 시설에서 실험실로 단독으로 운반되었습니다.
청각 훈련: 첫 번째 행동 세션.
청각적 공포 조건을 지닌 동물(CS1-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 집에서 조심스럽게 꺼내어 수용실에서 방음실로 옮겼습니다. 일단 거기에, 동물을 충격 전달 장치에 연결된 스테인리스 스틸 막대 그리드(직경 1cm, 간격 1.5cm)가 장착된 검은색 직사각형 케이지(35 × 40cm)로 구성된 컨디셔닝 장치 내부에 배치했습니다. 설정. 쥐를 1분간 가만히 두었습니다. 이 시간 후, 15kHz 주파수(각각 15초 지속 시간, 80dB, 36초 시험 간격)의 순음으로 구성된 7개의 조건 자극(CS)이 투여되었습니다. 각 톤의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 집 케이지로 다시 데려왔습니다.
충격 전용 동물(shock-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 동일한 컨디셔닝 장치 내부에 유사하게 배치했습니다. 그 직후, 각 쥐는 차례로 7-발 충격(1초, 0.5mA)을 받았습니다. 자극이 끝나면 동물을 다시 집으로 데려왔습니다. 컨디셔닝 케이지의 시간 영속성은 9초 미만이었습니다. 이전 연구에서는 이 절차가 고통스러운 자극과 감각 자극 사이의 연관 과정을 피할 수 있음을 보여주었습니다[29,30].
냄새 공포 조건을 갖춘 동물(odor-CS2). 이 그룹에서는 위의 실험 그룹에서 사용된 것과 동일한 직사각형의 검은색 우리 안에 쥐를 배치하고 충격 전달 장치에 연결했습니다. 쥐를 2분간 가만히 두었습니다. 이 시간 후, 바닐라 향으로 구성된 7개의 CS가 투여되었습니다(각각 10초의 지속 시간, 24초의 시험 간격). 각 냄새의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 모듈은 오프셋 후 전달된 자극의 지속성을 피하기 위해 환기원 근처에 배치되었습니다. 케이지는 상부 그리드로 확보되었습니다. 냄새는 흐름 희석 후각계를 사용하여 제시되었습니다. 깨끗한 공기(1.5L/분)는 솔레노이드 밸브로 보내졌고, 작동 시 바닐라 냄새 10ml가 들어 있는 15ml 병에 공기가 전달되었습니다.
톤 전용 동물(Tone-CS2). 이 그룹의 쥐는 동일한 검정색 우리 안에 배치되었으며 US가 없을 때 전달되는 15-kHz 톤(7자극, 15초 지속, 36초 ITI)을 제공받았습니다.
사전 노출된 동물(Tone-CS1-CS2). 쥐를 컨디셔닝 케이지 안에 넣고 1분 후에 15-kHz 톤만 20번 제시했고, 24시간 후에 동일한 톤이 US와 짝을 이루어 CS1이 되었습니다.
백색소음 공포 조건화 동물(WN-CS2). 이 그룹에서는 쥐를 직사각형의 검정색 우리 안에 넣고 1분 동안 방해받지 않고 방치했습니다. 이 시간 이후에는 WN(각각 15초의 지속 시간, 75dB, 36초의 시험 간 간격)으로 구성된 7개의 CS가 투여되었습니다. 각 신호음의 마지막 1초는 고통스러운 미국(0.5mA, 1초)과 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 집 케이지로 다시 데려왔습니다.
청각적 공포 학습: 두 번째 행동 훈련.
위 단락에 설명된 절차 2주 후, 동물은 또 다른 청각 공포 조건화 작업에 대한 훈련을 받았습니다. 이전 연구[10]에서와 같이 쥐를 표준 스키너 상자에 넣고 2분 동안 그대로 두었습니다. 이 시간 이후에는 3kHz 주파수(각각 8초의 지속 시간, 80dB, 22초의 시험 간 간격)의 순음으로 구성된 7개의 CS가 전달되었습니다. 각 톤의 마지막 1초는 고통스러운 US(0.5mA, 1초)와 짝을 이루었습니다. 컨디셔닝 세션이 끝나면 쥐를 집 케이지로 다시 데려왔습니다.
기억력 유지에 대한 두려움. CS2(3kHz)에서 최근 획득한 청각적 공포 기억의 유지를 4일 후에 테스트했습니다. 광유전학 실험의 경우, CNQX 투여를 통해 대뇌 피질 비활성화를 수행한 시간 간격(즉, 24시간 후)과 유사하게 CS2-US 학습 후 24시간 동안 레이저 전달을 통해 최근 기억 테스트를 수행했습니다. 훈련). 쥐는 상황에 따른 단서에 대한 조건화된 공포 행동을 피하기 위해 조절에 사용된 것과 다른 장치에 익숙해졌고 다른 방에 배치되었습니다[10,62]. 새로운 장치는 인클로저에서 악취가 나는 공기를 제거하고 60dB의 배경 소음을 제공하는 배기 팬이 장착된 소음 감쇠 상자 내에 검정색으로 칠해진 측면이 있는 투명한 플라스틱 케이지로 구성되었습니다. 동물은 습관화 세션 동안 하루 5분 동안 케이지를 탐색할 수 있었습니다. 공포 기억 유지 테스트 당일, 2분간의 자유 탐색 후 우리는 US가 뒤따르지 않는 3kHz의 4 CS2(8s—22 ITI)를 전달했습니다.
실험적 요구에 따라 필요한 경우, 두 번째 청각 공포 조건화 시험 2주 전에 획득한 원격 공포 기억 유지에 대해 쥐를 테스트했습니다. 이를 위해 3-kHz 톤에 대한 공포 기억 유지 테스트 후 7일 동안 동물을 새로운 환경(흑백 줄무늬 우리)에 배치한 다음 15-kHz 톤을 제시했습니다. 4개의 톤이 36초 간격으로 제시되었습니다.
상황별 훈련: 첫 번째 행동 세션.
상황에 따른 공포 조절 그룹(CtxA-CtxB). 이 그룹에서는 쥐를 우리에서 조심스럽게 꺼내어 양동이에 넣은 다음 사육실에서 방음실로 옮겼습니다. 일단 그곳에서, 충격 전달 장치에 연결된 스테인리스 스틸 막대 그리드가 장착된 앞서 언급한 직사각형 검정색 케이지로 구성된 컨디셔닝 장치 내부에 동물을 배치했습니다. 쥐를 1분간 가만히 두었습니다. 이 시간 이후에는 51초 간격으로 5 US(0.5 mA, 1초)가 투여되었습니다. 세션이 끝나면 동물을 집 우리로 다시 데려왔습니다.
충격 전용 그룹(shock-CtxB). 일단 컨디셔닝 장치 내부에 배치된 쥐는 즉시 5-발 충격(1초, 0.5mA)을 차례로 받았습니다. 컨디셔닝 케이지의 시간 영속성은 7초 미만이었습니다. 이전 연구에서는 이 절차가 고통스러운 자극과 감각 자극 사이의 연관 과정을 피할 수 있음을 보여주었습니다[29,30].
컨텍스트 전용 동물(context-CtxB). 쥐를 위의 실험에 사용된 것과 동일한 검은색 케이지 안에 5분 동안 미국을 넣지 않고 배치했습니다.
새로운 상황에 따른 공포 조건화 및 최근의 공포 기억 유지. 위 단락에 설명된 절차 2주 후에 모든 그룹은 새로운 상황적 환경(다른 방에 배치된 스키너 박스 모듈)을 고통스러운 US(0.5mA, 1s)와 연관시키도록 훈련되었습니다. . 각 동물을 새로운 방에 넣고 2분 동안 그대로 두었습니다. 그런 다음 30초 간격으로 5개의 US에 노출되었습니다.
상황에 따른 공포 기억의 유지는 공포 조절 절차 후 4일 동안 쥐를 Skinner 상자 챔버에 3분 동안 다시 넣어 테스트했습니다. 광유전학 실험의 경우, CNQX 투여를 통해 대뇌 피질 비활성화를 수행한 시간 간격(즉, 훈련 후 24시간)과 유사하게 CtxB-US 학습 후 24시간에 레이저 전달을 통해 최근 기억 테스트를 수행했습니다. 실험적 요구에 의해 요구되는 경우, 쥐는 새로운 연관성 2주 전에 미국과 짝을 이루는 맥락에 동물을 배치하여 원격 공포 기억의 유지 여부를 테스트했습니다.
동물들은 서로 다른 상황별 절차에 따라 2개의 서로 다른 양동이에 담겨 컨디셔닝 챔버로 운반되었습니다.
동결 조치. 모든 실험 절차에서 공포 기억 보유에 대한 평가는 동결 반응으로 결정되었으며[10], 호흡 운동을 제외한 신체 이동성이 전혀 없는 것으로 분석되었습니다. 각 동물에 대해 냉동에 소비된 시간(초)은 동물 그룹을 알지 못하는 2명의 독립적인 관찰자가 오프라인으로 측정했습니다.
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