노화된 인간 진피 섬유아세포에 대한 달맞이꽃의 원생 작용 1부

추상적인: 노화된 진피섬유아세포의 축적이 피부노화를 촉진합니다. 증식의 재활성화는 세포 노화를 조절하는 하나의 전략이다. 최근 우리는 Oenothera biennis 세포 배양액(ObHEx)의 친수성 추출물의 정확한 화학 성분을 보고했으며 피부 노화 방지 특성을 보여주었습니다. 이 작업은 특히 세포 노화에 대한 생물학적 효과를 평가하는 것을 목표로 합니다. ObHEx 작용은 스트레스 유발 조기 노화(SIPS)에 노출된 정상 인간 진피 섬유아세포에서 울트라 심층 프로테옴 분석을 통해 평가되었으며, 지금까지 가장 세계적인 노화 관련 프로테옴으로 이어졌습니다. 질량 분석 데이터는 ObHEx로 처리하면 노화 세포에서 강력하게 하향 조절되는 중요한 유사분열 단백질의 수준을 다시 설정한다는 것을 보여줍니다. Proteomics 연구 결과를 검증하기 위해 ObHEx가 부분적으로 노화 세포의 가장 일반적인 특징인 '노화 관련-ß-갈락토시다제'의 활성을 복원할 수 있음을 입증했습니다. 또한 유사분열 단백질 수준의 상향 조절이 세포 주기 재진입으로 해석되는지 평가하기 위해 FACS 실험을 수행하여 ObHEx에 의한 노화 세포 증식의 작지만 중요한 재활성화를 입증했습니다. 결론적으로, 여기에 게시된 심층 노화 관련 글로벌 프로테옴 프로파일링은 SIPS에 의해 규제가 완화된 수백 개의 단백질 패널을 제공하며 커뮤니티에서 노화와 새로운 잠재적 조절자의 영향을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, proteomics 분석은 노화 세포에 대한 ObHEx의 특정 친유사분열 효과를 지적했습니다. 따라서 우리는 피부 노화와 관련된 노화에 대한 강력한 보조제로서 ObHEx를 제안합니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활동을 개선하고 MDA의 함량을 감소시키며 정자 막 기능에 대한 특정 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력을 가지고 있으며 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼로 인한 콜라겐 분해를 방지하며 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 우수한 복구 효과도 있습니다.

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키워드: 달맞이꽃 친수성 추출물; 노화; 섬유모세포; 프로테오믹스; 질량 분석; 디아파세프; 유사 분열; 피부노화

1. 소개

노화는 노화와 노화 관련 질병의 주요 원인입니다. 노화 세포는 생리학적 텔로미어 침식(복제적 노화) 또는 DNA 손상, 산화 스트레스, 소기관 변형 및 발암유전자 활성화(스트레스 유발 조기 노화, SIPS)를 포함한 스트레스 트리거에 대한 반응으로 증식 정지를 겪습니다[1]. DNA 손상 반응(DDR) 유도 성장 정지에도 불구하고 노화 세포는 높은 대사 상태와 리소좀 활성을 나타내며, 이는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 증가된 분비 활동에 중요합니다[2,3]. SASP 인자에는 수용성(인터루킨, 케모카인, 성장 인자, 분비 프로테아제) 및 불용성(분비된 불용성 단백질 및 세포외 기질 성분) 단백질의 여러 계열이 포함되며, 이는 주변 조직에 부정적인 영향을 미쳐 만성 저등급 염증 상태를 유발합니다.

진피에 노화 섬유아세포의 축적은 피부 노화를 촉진하여 세포외 기질(ECM)의 완전성과 인접한 미세혈관 내피 세포, 표피 멜라닌 세포 및 각질 세포의 기능을 손상시킵니다[4-6]. 노화에 대응하는 세 가지 주요 전략은 (i) 세포사멸 유도 또는 면역 활성화에 의한 노화 세포 제거; (ii) SASP의 조절 및 (iii) 세포 증식의 재활성화. 실제로, 노화는 원래 비가역적인 세포 주기 정지로 기술되었지만 현재의 증거는 증식이 회복될 수 있음을 시사합니다[7-9].

이 시나리오에서 세포 노화를 방지 및/또는 조절할 수 있는 성분은 피부 노화에 대응하는 귀중한 무기로서 화장품 분야에서 큰 관심을 받고 있습니다. 특히 Onagraceae과에 속하는 Oenothera biennis(O. biennis, Evening Primrose) 종에서 추출한 추출물은 항염증 및 항산화 작용으로 인해 전통적으로 화장품 용도로 사용되었습니다[10]. 지상부에서 제조된 메탄올 추출물과 수성 잎 추출물은 주로 페놀산과 플라보노이드를 함유하고 있는 반면, 뿌리에서 얻은 메탄올 추출물은 대부분 스테롤과 트리테르펜을 함유하고 있다[11]. 알코올성 및 하이드로알코올성 지상부 추출물의 생물학적 활성이 입증되었지만 [12–14], 가장 자주 사용되는 O. biennis 추출물은 지방산이 매우 풍부한 종자에서 얻은 오일입니다. 실제로 O. biennis 종자유는 리놀레산(LA)과 리놀렌산(GLA) 함량이 높기 때문에 피부의 적절한 기능을 개선하고 특히 만성 피부염 환자에게 유익한 효과를 보였습니다[11, 15].

보다 최근에는 O. biennis 세포 배양에서 얻은 추출물이 생물 지속 가능하고 오염 물질이 없으며 표준화된 2차 대사 산물 혼합물이기 때문에 자생 식물 추출물을 완전히 대체할 수 있다고 제안되었습니다[16]. 식물 추출물의 전반적인 활동을 담당하는 것은 바로 시너지 효과가 있는 화합물의 조합입니다[17].

여기에서 우리는 리그난과 트리테르펜이 풍부한 O. biennis 세포 배양액(ObHEx)의 친수성 추출물에 초점을 맞추었습니다. 이는 시험관 내 및 생체 외 모델에서 테스트했을 때 피부 노화 방지 특성을 나타냈기 때문입니다[18]. 이 추출물의 질량 분석 기반 화학적 특성화는 흥미로운 이차 대사 산물의 여러 부류를 포함하고 있음을 밝혔습니다. 이들은 리그난(살바도라시드 및 리리오덴드론) 및 트리테르펜(muriatic acid, arjunolic acid, aspartic acid 및 hederagenin)에 속하며, 이들 중 일부는 이전에 인간 섬유아세포에서 pro-collagen I 생산과 관련이 있었습니다[19,20]. 특히, 우리는 ObHEx가 매트릭스 콜라겐 수축, 액틴 중합 및 ECM 단백질 생성을 촉진하여 Myosin light chain kinase(MYLK) 유전자 발현 증가를 통해 피부 탄력과 탄력을 향상시킨다는 것을 이전에 입증했습니다.

현재까지 특히 피부 노화 및 세포 노화에 대한 ObHEx 효과의 분자 메커니즘은 조사되지 않았습니다. 이 작업은 노화된 인간 진피 섬유아세포에 대한 ObHEx 활동을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 우리는 데이터 독립적인 질량 분석 초심층 단백체 접근법을 사용하여 작용 메커니즘의 힌트를 얻고 이를 검증하고 조사하기 위한 생체 직교 방법을 사용했습니다(그림 1).

2. 결과

스트레스 유발 조기 노화(SIPS)는 과산화수소(H2O2)로 처리하여 정상적인 인간 진피 섬유아세포(NHDF)에서 수행되었습니다. 산화 스트레스에 의해 유발된 노화 세포는 노화 연구를 위한 우수한 체외 모델이며 이를 달성하기 위해 H2O2가 널리 사용됩니다[21,22].

노화된 NHDF 세포에서 ObHEx에 의해 변경된 생물학적 경로를 이해하기 위해 우리는 초심층 프로테오믹 접근법을 사용했습니다. SIPS 및 대조군 세포는 0.01%(p/v)의 추출물로 48시간 동안 처리되거나 처리되지 않았습니다. 48시간 배양 후 모든 세포 독성.

그런 다음 세포 용해물을 트립신 소화 및 나노-UPLC MS/MS 분석에 적용했습니다. 프로테옴의 최적 깊이를 얻기 위해 DIA(Data Independent Acquisition) 모드에서 질량 분석 데이터를 수집하여 9650개 단백질(표 S1)의 강력한 정량화를 허용했으며 데이터 완성도는 98%입니다. 우리의 연구는 현재까지 노화 세포의 가장 완벽한 프로테옴 분석을 보고합니다.

2.1. 스트레스 유발 조기 노화(SIPS) 평가

먼저 H2O2-처리된 NHDF의 global proteome을 MS(mass spectrometry)로 분석하고 flow cytometry로 형태를 조사하여 NHDF의 노화 유도가 성공했는지 확인하였다.

2.1.1. 질량분석법(MS)에 의한 SIPS 평가

SIPS 유도를 평가하기 위해 H2O2- 처리된 NHDF 세포와 처리되지 않은 NHDF 세포의 총 프로테옴을 비교했습니다. 규제가 완화된 3256개의 단백질 중에서 노화의 여러 바이오마커가 크게 변경된 것으로 나타났습니다(그림 2A, B). 첫째, 노화 세포의 가장 널리 사용되는 바이오마커인 'senescence-associated-ß-galactosidase'(SA- -gal, GLB1)의 상향조절을 관찰하였다. MS에 의해 상향 조절되는 것으로 밝혀진 리소좀 효소 GLB1 및 조직 알파-L-푸코시다제(FUCA1)의 증가된 수준은 노화 세포의 리소좀 함량의 특징적인 증가를 반영합니다[23,24]. 실제로 리소좀은 노화와 관련된 분비에 필요한 에너지와 원료를 제공하는 이화 과정을 선호합니다[25].

둘째, DDR 신호전달에 관여하는 serine/threonine-protein kinase ATR과 serine-protein kinase ATM의 단백질 수준도 증가하는 것으로 나타났다[26]. DDR은 일반적으로 세포 노화의 확립과 관련된 핵 DNA 손상에 의해 활성화되며 종양 억제 인자 p53의 활성화로 수렴됩니다. 이 외에도 히스톤 2A 변이체 MACROH2A1 및 MACRO2A2의 상향 조절도 관찰되었습니다. 이러한 단백질은 노화 세포의 특징인 조밀하고 억압적인 염색질 구조인 SAHF(Senescence Associated Heterochromatin Foci)의 ATR 의존적 형성에 참여합니다[1,2,27].

마지막으로, Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1A 또는 p21(CDK1NA) 및 증식 마커 단백질 Ki-67(MKI67)의 조절되지 않은 수준은 G2 단계에서 노화 세포 주기 정지를 반영합니다[28,29]. 실제로 p21은 DNA 손상 유발 p53 경로에 의해 촉진되는 수준을 증가시키고 CDK2-사이클린 E 복합체를 억제합니다. 이것은 망막모세포종 단백질(RB)의 탈인산화를 유발하며, 이는 저인산화 상태에서 세포 주기의 진행을 선호하는 전사 인자인 E2F를 격리시킵니다[2].

이러한 이미 알려진 노화 마커 외에도 H2O2 처리 대 대조군 세포에서 가장 상향 조절된 단백질의 더 광범위한 경로 농축 분석은 DNA 손상에 의해 유도된 p53/p21 경로 활성화를 가리킵니다(그림 2C, 표 S2). 대신, 증식 및 유사분열과 관련된 단백질이 하향 조절되어 결과적인 증식 정지를 가리킵니다(그림 2D, 표 S3).

2.1.2. 유세포 분석에 의한 SIPS 평가

SIPS는 유세포 분석으로도 확인되었습니다. 우리는 노화 세포에서 리소좀의 수와 크기의 증가로 인해 H2O2-처리된 세포의 세포질 세분성의 증가를 관찰했습니다(그림 S1A, B). 이것은 기능 장애가 있는 리소좀의 점진적인 축적과 새로운 리소좀의 생성 사이의 균형의 결과입니다[25]. 또한 리포푸신 응집체의 리소좀 내 축적도 감지했습니다. 유세포 분석기의 525/50 nm 대역통과 채널에서 자가형광 증가와 ​​관련된 이 성장은 리소좀 기능 장애와 관련된 노화의 또 다른 마커입니다(그림 S1C, 라) [30].

2.2. 노화 NHDF 세포에서 하향 조절된 ObHEx 부분적으로 복원된 유사분열 단백질

ObHEx 처리는 노화 상태에서 조절 해제된 71개 단백질의 수준을 부분적으로 복원할 수 있었습니다(양방향 ANOVA 테스트 q-값 < 0.05). 보다 정확하게는 추출물에 의해 46개의 단백질이 하향 조절되었고 25개의 단백질이 상향 조절되었습니다(그림 3A, 표 S4 및 S5).

ObHEx에 의해 수준이 감소된 46개 단백질의 리액톰 농축 분석은 추출물이 p53 경로 활성화를 감소시킬 수 있고 포스파티딜이노시톨 대사 및 Hedgehog 신호에 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 이들의 변화는 노화에서 발견되었습니다[31,32](그림 3B, 표 S6).

25개의 상향 조절된 단백질과 관련하여 농축 분석은 유사분열 세포 주기 경로 재활성화, 특히 DNA 풀림 및 복제, 염색체 응축 및 자매 염색분체의 분해를 가리킵니다(그림 3C, 표 S7).

심층 분석 결과 25개의 복원된 단백질 중 18개가 강하게 함께 모여 있는 것으로 나타났습니다(그림 4A). 이 클러스터에서 CDK1, 콘덴신 I 복합체의 모든 서브유닛(SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH 및 NCAPG), 3개의 동역학 관련 단백질(KNTC1, NUF2 및 TRIP13), 모든 6개의 서브유닛을 식별할 수 있습니다. IQGAP3, PBK 및 DHFR과 함께 복제 미니염색체 유지(MCM) 복합체(MCM2-7)의

이러한 단백질의 수준을 부분적으로 복원하는 ObHEx의 능력은 그림 4B의 프로파일 플롯에 잘 나타나 있습니다. ObHEx 치료.

2.3. 생물학적 분석으로 ObHEx Promitotic 작용 메커니즘 확인

노화 세포의 가장 일반적인 특징은 염색 분석으로 평가할 수 있는 증가된 SA{0}}gal 활성입니다. 우리의 결과는 H2O2 처리가 SA- -gal 양성 세포(파란색)의 수를 4.7%에서 22.9%로 크게 증가시켰음을 보여줍니다(그림 5A, B). ObHEx 배양은 SA- -gal 활동을 38.4% 감소(p < 0.01)하여 크게 줄였습니다.

또한, ObHEx에 의한 유사분열 단백질 발현의 회복이 세포 주기의 재활성화로 해석되는지를 평가하기 위해 대조군과 노화 세포를 추출물로 72시간 동안 처리하고 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 실험을 수행했습니다. 노화 세포 결과는 세포 주기의 G2/M 단계(36.8%)에서 차단을 보인 반면 대조군 세포의 훨씬 낮은 부분(7.2%)만이 합류에 도달했기 때문에 이 단계에 있었습니다. 33] (그림 5C, D). ObHEx로 노화 세포를 처리하면 G2/M 개체군이 4.3% 감소할 수 있었습니다(p < 0.05). 주목할 점은 SIPS 후 노화 세포 부분(22.9%)과 관련될 때 G2/M 탈출은 18.9%로 추정될 수 있다는 것입니다. 48시간 동안 동일한 ObHEx 처리가 수행되었지만 결과는 통계적으로 유의하지 않았습니다.

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