노화된 인간 진피 섬유아세포에 대한 달맞이꽃의 원생 작용 2부

3. 토론

본 연구에서는 친수성 Oenothera biennis 세포 추출물(ObHEx)이 세포 노화에 미치는 영향을 조사했습니다. 이는 in vitro 및 ex vivo 모델에서 테스트했을 때 피부 노화 방지 특성을 나타냈기 때문입니다[18]. 우리는 H2O2[21,22]로 처리하기 위해 SIPS에 적용된 NHDF의 유사한 노화 모델을 사용했습니다.

Cistanche의 배당체는 또한 심장 및 간 조직에서 SOD의 활성을 증가시킬 수 있으며 각 조직에서 리포푸신 및 MDA의 함량을 크게 감소시켜 다양한 활성 산소 라디칼(OH-, H₂O₂ 등)을 효과적으로 제거하고 이로 인한 DNA 손상으로부터 보호합니다. OH-라디칼에 의해. Cistanche phenylethanoid glycosides는 자유 라디칼의 강력한 소거 능력, 비타민 C보다 더 높은 환원 능력, 정자 현탁액에서 SOD의 활성을 개선하고 MDA 함량을 감소시키며 정자막 기능에 일정한 보호 효과가 있습니다. Cistanche 다당류는 D-갈락토스에 의해 유발된 실험적으로 노화된 쥐의 적혈구 및 폐 조직에서 SOD 및 GSH-Px의 활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 및 혈장의 MDA 및 콜라겐 함량을 감소시키고 엘라스틴 함량을 증가시킬 수 있습니다. DPPH에 대한 우수한 소거 효과, 노화된 쥐의 저산소증 시간 연장, 혈청 내 SOD 활성 개선, 실험적으로 노화된 쥐의 폐의 생리학적 퇴행 지연 피부 노화 질환을 예방하고 치료하는 약물이 될 가능성이 있습니다. 동시에 Cistanche의 echinacoside는 DPPH 자유 라디칼을 제거하는 상당한 능력과 활성 산소 종을 제거하고 자유 라디칼을 방지하는 능력을 가지고 있습니다.

콜라겐 분해를 유도하고 티민 자유 라디칼 음이온 손상에 대한 복구 효과도 좋습니다.

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노화된 인간 진피 섬유아세포에 대한 ObHEx의 작용 메커니즘을 이해하기 위해 추출물에 의해 변경된 생물학적 경로의 공개를 통해 데이터 독립적인 질량 분석법 초심부 프로테오믹 접근법을 수행했습니다. 그것은 우리가 현재까지 노화 세포의 가장 완벽한 프로테옴 분석을 얻을 수 있게 했고, 처음으로 수많은 노화 마커의 동시 정량화를 가능하게 했습니다.

우선, NHFD 세포에 H2O2 처리에 의한 노화 유도를 평가하기 위해 알려진 노화 마커를 정량화했습니다. 우리의 프로테오믹스 데이터는 산화 스트레스에 의한 노화 유도를 확인했습니다. 실제로 우리는 증가된 리소좀 함량(GLB1 및 FUCA1), DNA 손상(ATR, ATM, MACROH2A1 및 MACRO2A2) 및 G2 단계 세포 주기와 관련하여 이미 알려진 노화 마커의 변경된 수준을 관찰했습니다. 체포(CDK1NA 및 MKI67). 또한 H2O2 처리 대 대조군 세포에서 가장 하향 조절된 단백질의 경로 농축 분석은 노화 증식 정지를 반영하는 유사분열을 가리킵니다.

ObHEx로 처리된 SIPS NHDF 세포의 프로테옴과 처리되지 않은 세포를 비교한 결과, 추출물을 사용한 처리가 유사분열의 여러 단계에서 중요한 역할을 하는 단백질 및 복합체 수준을 부분적으로 복원할 수 있음을 발견했습니다. ObHEx 배양은 cyclin B와 복합체를 형성하여 유사분열 진입을 유발하는 주요 유사분열 단백질인 CDK1의 수준을 증가시켰습니다[34]. 또한, 콘덴신 I 복합체의 5개 서브유닛 모두가 상향조절되었습니다. 이 복합체는 염색체(SMC) 서브유닛의 두 가지 구조 유지, SMC2 및 SMC4, 및 세 개의 비-SMC 서브유닛, NCAPD2, NCAPH 및 NCAPG로 구성됩니다. 전중기에서 콘덴신 I 복합체의 기능은 ATP 의존 방식으로 DNA에 양성 초코일을 도입하여 염색체의 유형 응축을 촉진하는 것입니다[35]. 이 외에도 추출물은 전중기 동안 중심 염색질을 반대편 스핀들 극의 미세소관에 연결하여 자매 염색분체의 분리를 촉진하는 큰 복합체인 키네토코어와 관련된 세 가지 단백질인 KNTC1, NUF2 및 TRIP13을 상향 조절했습니다. 36,37]. MCM 단백질 수준의 부분적인 회복도 감지되었습니다. 이 단백질은 이중 가닥 DNA를 풀어 단일 가닥을 DNA 중합효소의 주형으로 제공하는 복제 헬리카제 복합체의 핵심입니다. MCM 복합체는 S기 동안 활성 헬리카제로 변환되지만 말기 동안 이미 염색질에 로드됩니다[38,39]. 추출물은 IQGAP3, PBK 및 DHFR의 수치도 증가시켰습니다. 첫 번째인 IQGAP3는 Cdc2 활성화에 필수적인 cdk7 활성을 촉진하기 때문에 유사분열 진행의 중요한 조절자입니다[40,41]. PBK는 유사분열에서만 활성인 키나아제입니다. 인산화되면 p53과 상호 작용하여 이를 불안정하게 만들고 DNA 손상 경로를 약화시킵니다[42]. DHFR은 노화된 인간 섬유아세포에서 그 수준이 현저하게 감소되는 DNA 생합성의 핵심 효소입니다[43].

Bio-orthogonal 분석은 또한 ObHEx가 노화 특징, 즉 리소좀 활성 및 세포 주기 정지를 부분적으로 되돌리는 능력을 보여주었습니다. 실제로, ObHEx에 의한 유사분열 단백질 발현의 회복이 세포 주기의 재활성화로 해석되는지 확인하기 위해 추출물 처리 여부에 관계없이 SIPS NHDF 세포에 대해 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 실험을 수행했습니다. 그들은 ObHEx가 G2 단계에서 차단된 세포의 분율을 줄이고 노화 세포의 세포 주기로의 재진입을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다.

4. 재료 및 방법

4.1. 세포 배양

정상적인 인간 진피 섬유아세포(NHDF; Promocell)는 10% 태아 소 혈청(FBS; Gibco) 및 500U/mL의 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM; Gibco)에서 95% 공기 중에서 배양되었습니다. , 5% CO2 및 37ºC의 가습 대기.

4.2. 스트레스 유발 조기 노화(SIPS) 유도

총 10 1200 000개의 NHDF 세포를 37℃에서 2시간 동안 100 μM H2O2와 함께 배양하기 하루 전에 각각의 60mm 세포 배양 접시에 접종했습니다[21,22]. 그 후 H2O2를 PBS(Phosphate Buffered Saline, Gibco)로 세척하여 처리를 종료하고 정상배지에서 4일간 배양하였다. 대조군으로 사용된 비노화 세포의 경우, 2240 000 NHDF 세포를 각각의 60mm 세포 배양 접시에 접종하였다. 실험은 5개의 생물학적 복제로 수행되었습니다.

4.3. Oenothera Biennis 친수성 추출물(ObHEx) 준비

추출물은 Arterra Bioscience SpA의 실험실에서 준비되었습니다[18]. 세포 배양물은 Oenothera biennis 식물(GEEL Floricultura ss 제공)의 잎에서 얻은 캘러스가 나올 때까지 고체 한천 플레이트에서 분열조직 세포의 증식을 유도하여 얻었습니다. 세포를 액체 성장 배지(Gamborg B5, 2,4 디클로로 페녹시 아세트산(1 mg/L), 아데닌(1 mg/L) 및 키네틴(0.01 mg/L 보충)으로 옮겼습니다. )) 오비탈 쉐이킹 하에서 현탁 배양물로서 성장하였다. 약 150 g/L의 배양액이 얻어지면 세포를 모아 pH 7.4의 PBS에 용해시켜 수용성 추출물을 제조하였다. 동결건조 후, 수득된 분말을 시험을 위해 적절한 농도로 물 또는 세포 배양 배지에 용해시켰다.

4.4. Oenothera Biennis 친수성 추출물(ObHEx) 처리

NHDF 세포를 완전 배지에서 0.01%(p/v) ObHEx와 함께 24시간 동안 배양했습니다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고 무혈청 배지에서 0.01%(p/v) ObHEx로 추가 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 트립신 처리로 분리하고 500g에서 4oC에서 10분 동안 원심분리한 다음 PBS로 두 번 세척했습니다. 처리되지 않은 대조군 세포는 ObHEx 없이 동일한 배양을 거쳤습니다.

4.5. Proteomic 분석을 위한 샘플 준비

펠릿을 60µL의 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼에 재현탁하고 초음파 처리로 용해했습니다. 세포 용해물 단백질 농도는 DC™ 단백질 분석 키트(Biorad; #5000112)를 사용하여 정량화되었습니다. S-TrapTM 마이크로 스핀 컬럼(Protifi, Huntington, CA, USA) 소화는 제조업체의 지침에 따라 50µg의 세포 용해물에서 수행되었습니다. 간략하게, 샘플을 20mM 트리스(2- 카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 환원시키고 실온에서 15분 동안 50mM 티오아세트아미드(CAA)로 알킬화시켰다. 그런 다음 수성 인산을 2.5%의 최종 농도로 첨가한 다음 S-Trap 결합 완충액(90% 수성 메탄올, 100mM TEAB, pH 7.1)을 첨가했습니다. 그런 다음 혼합물을 S-Trap 컬럼에 로드했습니다. 철저한 SDS 제거를 위해 5개의 추가 세척 단계를 수행했습니다. 그런 다음, 세포 용해물을 2.5μg의 트립신(Promega)으로 47℃에서 1시간 동안 소화시켰다. 용출 후, 펩타이드를 진공 건조하고 2% ACN, 0.1% FA에 재현탁하고 Nanodrop으로 정량화했습니다.

4.6. nanoLC-MS/MS 단백질 식별 및 정량화

timsTOF Pro(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)와 결합된 나노플레이트(Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 각 시료 총 400 ng를 주입했습니다. , 독일) 질량 분석계. HPLC 분리(용매 A: 물 중 {{30}}.1% 포름산; 용매 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산)는 패킹된 이미터 컬럼(C18, 25 cm × 75 µm 1.6 µm) (Ion Optics, Fitzroy, Australia) 기울기 용출(41분 동안 용매 B 2~13%, 23분 동안 13~20%, 5분 동안 20%~30%, 5분 동안 30%~ 5분 동안 85%, 마지막으로 5분 동안 85%로 컬럼 세척). 질량 분석 데이터는 데이터 독립 분석 병렬 축적 직렬 단편화(diaPASEF) 수집 방법을 사용하여 수집되었습니다. 기저귀 설정은 400~1200Da의 질량 범위, 0.60~1.43 1/k0의 이동성 범위, 이동성 창 수 1, 주기 시간 추정치 1.79초, 주기당 질량 단계 32입니다.

4.7. MS 데이터 처리 및 생물 정보학 분석

데이터 분석은 DIA-NN 소프트웨어(버전 1.8)[44]를 사용하여 수행되었습니다. 인간 UniProtKB/Swiss-Prot Homo sapiens 데이터베이스(2021년 2월 릴리스, 20,408개 항목)에 대한 검색이 라이브러리 없는 워크플로우를 사용하여 수행되었습니다. 이를 위해 전구체 이온 생성에 대해 "라이브러리 없는 검색/라이브러리 생성을 위한 FASTA 다이제스트" 및 "딥 러닝 스펙트럼, RT 및 IM 예측" 옵션을 확인했습니다. 최대 2개의 트립신 놓친 절단이 허용되었고 최대 변수 수정은 5로 설정되었습니다. 카르바미도메틸화(Cys)는 고정된 수정으로 설정되었지만 단백질 N-말단 메티오닌 절제, 메티오닌 산화 및 N-말단 아세틸화는 변수로 설정되었습니다. 수정. 펩타이드 길이 범위는 7-30개 아미노산, 전구체 전하 범위 2-4, 전구체 m/z 범위 300-1800, 단편 이온 m/z 범위 200-1800으로 설정되었습니다. 부모 질량 및 조각 이온을 검색하기 위해 DIA-NN에 의해 ​​정확도가 자동으로 유추되었으며 각 분석에 대해 약 13ppm으로 설정되었습니다. 단백질 및 펩타이드 수준에서 FDR(False Discovery Rate)은 1%로 설정되었습니다. 실행 간의 일치가 허용되었습니다. 정량화 전략의 경우 소프트웨어 문서에서 권장하는 대로 Robust LC(고정밀)를 사용했지만 다른 알고리즘 매개변수에 대해서는 기본 설정을 유지했습니다.

웹사이트에서 무료로 제공되는 Perseus 소프트웨어(버전 1.6.15)(6월 22일021에 액세스) [45] 및 R/R Studio 및 RStudio 버전 20를 사용하여 통계 및 생물정보학적 분석을 수행했습니다. 21.09.1 30(2021년 11월 12일 액세스). 모든 R 통계 분석은 R 통계 패키지를 사용하여 수행되었습니다. DIA-NN의 pg 보고서 매트릭스 출력이 사용되었고 강도는 통계 분석을 위해 log2 변환되었습니다. 통계적 비교를 위해 각각 5개의 생물학적 복제를 포함하는 4개의 그룹을 설정했습니다. 그런 다음 데이터를 필터링하여 하나 이상의 그룹에서 3개 이상의 유효한 값을 가진 단백질만 유지했습니다. 다음으로, 측정값의 표준편차에 대해 33%의 표준편차와 평균의 1.8 표준편차 다운시프트로 난수의 가우시안 분포를 생성하여 누락된 데이터 포인트를 채우기 위해 데이터를 대치하여 낮은 분포를 시뮬레이션했습니다. 신호 값. SEN과 CTRL FDR < 0.05, S0=0.1 사이에서 Student's t-test를 수행하여 노화에 특이적인 마커의 존재를 확인했습니다. 그런 다음 노화가 유도된 세포에 대해 처리 유무의 효과 크기 차이가 동일한지 알아보기 위해 두 요인(즉, 유도 및 처리) 간의 상호 작용을 Two-way ANOVA를 사용하여 조사했습니다. 그런 다음 FDR(False Discovery Rate)을 제어하기 위해 Benjamini–Hochberg [46] 방법을 사용하여 다중 테스트를 위해 두 요인의 상호 작용에 대해 얻은 p-값을 조정했습니다. 마지막으로 q-값 < 0.05를 나타내는 단백질에 대해 Tukey HSD 사후 분석을 수행했습니다. 질량 분석 proteomics 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD034222와 함께 PRIDE [47] 파트너 저장소를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 기탁되었습니다.

4.8. 노화 관련 ß-갈락토시다제 염색

세포 신호 기술 염색 키트(#9860)를 사용하여 노화 관련 ß-갈락토시다아제(SA-ß-gal) 활성을 평가했습니다. 총 1250 000 NHDF 세포/웰을 SIPS 하루 전에 6-웰 플레이트에 시딩했습니다. 반면 대조군으로는 250 000 cells/well. 일반 배지에서 4일 후, 세포를 48시간 동안 0.01퍼센트(p/v) ObHEx와 함께 인큐베이션하거나 인큐베이션하지 않았다. 그 후, PBS로 세척하고 고정 용액으로 15분 동안 처리하였다. PBS로 2회 세척한 후 세포를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴- -D-갈락토를 포함하는 ß-gal 염색 용액(최종 pH 6.0)과 함께 배양했습니다. -피라노시드(X-Gal)를 37ºC 건조 인큐베이터에서 20시간 동안 가열합니다. 양성 세포는 파란색입니다. 색은 SA-ß-gal에 의한 갈락토오스의 X-Gal과 5-Bromo-4-클로로-3-인독실(X)의 분해로 인한 것입니다. 인독실은 5,50 -dibromo-4,40 -dichloro-indigo로 산화되어 강렬한 청색 침전물을 형성합니다. 전체 세포에서 양성 세포의 비율은 각 조건에 대해 현미경으로 캡처한 5개의 무작위로 선택된 이미지에서 100-150개의 세포를 세어 평가했습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포를 세었습니다. 실험은 세 번 수행되었습니다.

4.9. 형광 활성 세포 분류 분석

총 {{0}} NHDF 세포/웰을 SIPS 하루 전에 6-웰 ​​플레이트에 시딩했습니다. 반면 대조군으로는 50 000 cells/well. 정상 배지에서 4일 후 대조군과 노화 세포를 72시간 동안 0.01%(p/v) ObHEx로 처리하거나 처리하지 않았습니다. 그런 다음 세포를 37°C에서 30분 동안 Hoechst 33342 5 µg/mL의 존재 하에 배양했습니다. 트립신화 및 500g에서 2분 동안 원심분리한 후, PBS 200μL에 재현탁시켰다. 마지막으로 세포 형광은 BD LSRFortessa 세포 분석기로 측정했습니다. FlowJo 소프트웨어 v10.8.1을 사용하여 데이터를 분석했습니다. 실험은 세 번 수행되었습니다.

5. 결론

여기에서 얻은 깊은 노화 관련 글로벌 프로테옴 프로파일링은 SIPS에 의해 규제가 완화된 수백 개의 단백질을 제공하며, 이는 과학계에서 노화를 더 이해하고 새로운 잠재적 변조기의 효과를 평가하기 위해 이용할 수 있습니다. 또한, 우리의 연구는 노화된 인간 진피 섬유아세포에 대한 ObHEx의 유사분열 전 작용 메커니즘을 입증합니다: 유사분열 단백질 발현의 증가를 통해 노화 세포의 증식 회복을 촉진합니다. 따라서 이러한 결과를 바탕으로 우리는 피부 노화와 관련된 노화에 대한 강력한 보조제로서 ObHEx를 제안합니다.

저자 기여:개념화, SC, MCM 및 ICG; 방법론, SC, KR, IM, CC(Cerina Chhuon) 및 ICG; 소프트웨어, KR; 조사, SC, IM, CC(Cerina Chhuon), KT, SF, ADL, IP 및 CC(Corinne Cordier); 자원, MCM 및 ICG; 작문 - 원본 초안 준비, SC 및 ICG; 쓰기—검토 및 편집, SC, MCM 및 ICG 모든 저자는 원고의 게시된 버전을 읽고 이에 동의했습니다.

데이터 가용성 진술:질량 분석 프로테오믹스 데이터는 PRIDE [47] 파트너 저장소를 통해 데이터 세트 식별자 PXD034222(검토자 계정 세부 정보: 사용자 이름: reviewer_pxd034222@ebi.ac.uk, 암호: fK9Pjv90)를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 기탁되었습니다. .

감사의 말: 이 연구는 Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I "Capitale Umano", Azione I.1 "Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale"의 지원을 받았습니다. 귀중한 과학적 지원과 유익한 제안을 해주신 Proteomics 플랫폼 Necker Vincent Jung과 Joanna Lipecka의 다른 구성원들에게 감사드립니다.

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