프로테아제 활성화 수용체 1은 마우스의 신장 허혈-재관류 손상에서 미세 순환 장애 및 세뇨관 손상에 기여합니다

유관,¹나카노 다이스케²레이 리,³정하오펑,³니시야마 아키라,²예 티엔,¹그리고 레이 장¹

실제 실패를 완화하기 위해시스탄체 허브

1. 소개

그만큼신장부분 신 절제술 동안 허혈 재관류(IR) 손상을 피할 수 없으며신장이식[1]은 대사성 폐기물의 잔류를 초래하고 급성 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.신장부상 (아키) 그리고아키-만성병 환자신장질병(AKI-CKD) [2]. 현재까지 AKI 및 AKI-CKD에 대해 임상적으로 이용 가능한 특정 약물 요법은 없습니다[3]. AKI에서는 울혈 및 출혈을 포함한 미세 순환 장애[4], 급성 세뇨관 괴사[5]와 같은 몇 가지 일반적인 병리학적 변화가 발생합니다. 따라서 연구는 잠재적인 치료 후보로서 이러한 병리학적 변화를 표적으로 하는 데 초점을 맞추었습니다. 우리는 이전에 세뇨관 주위 모세 혈관을 유지하는 것을 입증했습니다.신장IR 손상은 모세혈관 혼잡을 줄이고 AKI에서 CKD로의 전환을 개선했습니다[6]. 급성 세뇨관 괴사는 치료하기 어려울 수 있습니다. 따라서, 세뇨관 세포 증식을 통한 세뇨관의 재생은 신기능의 추가 손실을 방지하기 위한 중요한 접근법일 수 있습니다[7].

Protease-activated receptor-1(PAR-1)는 protease-activated receptor(PAR) 계열에 속하며 트롬빈에 의해 자극되어 혈소판 응고를 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 최근에 PAR-1이 급성으로 유도된 사구체 손상의 발병에 기여한다는 것을 보여주었습니다[8]. 또한, thrombin/PAR-1은 상피 세포 증식 및 세포 사멸에 역할을 하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 특성에 기초하여 우리는 PAR-1이 세뇨관 주위 모세혈관 혈액 응고 또는 세뇨관 재생을 조절하여 AKI 중증도를 가속화한다는 가설을 세웠습니다. 이 연구에서는 PAR-94 선택적 음성 알로스테릭 조절제인 Q-94를 마우스에서 사용하여 PAR-1의 역할을 조사했습니다.신장IR 손상 모델 및 트롬빈 자극 배양된 인간 관 세포.

연락하다:joanna.jia@wecistanche.com

2. 재료 및 방법

2.1. 급성 신장 IR 마우스 모델.

모든 동물 실험은 Capital Medical University의 Institutional Animal Care and Use Committee 실험 지침에 따라 수행되었습니다. 그만큼신장IR 마우스 모델은 이전에 설명한 대로 설정되었습니다[8]. 간단히 말해서, 8-주령 C57/BL6 수컷 마우스를 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg, ip) 주사로 마취하고 무작위로 다음 그룹으로 나누었습니다: 가짜, I/R + 비히클, I/R (비히클: 식염수 10 mg/kg iv) + Q94(10 mg/kg iv에서 PAR-1 길항제) 그룹(각 그룹에서 n=7-8). 신장 따뜻한 IR 손상 프로토콜의 경우, 마우스는 신장 기능 손상을 평가하기 위해 신장 절제술을 받았습니다. 1주일 후, 신장 경경은 30분 동안 손상이 없는 혈관 클립으로 고정되었습니다. 48시간 동안 재관류한 후, 마우스를 희생시켰다. 신장 조직 샘플을 수집하고 4% 파라포름알데히드 용액에 고정하여 파라핀 블록을 제조했습니다. 혈액 요소 질소(BUN) 및 크레아티닌을 측정하기 위해 혈장을 얻었다.

2.2. 재료.

Q94는 Tocris Bioscience(Bristol, UK)에서 구입했습니다. 다른 화학물질은 달리 명시되지 않는 한 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

2.3. 크레아티닌 및 BUN에 대한 분석.

상용 분석 키트(Creatinine Assay Kit ab65340; Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 크레아티닌을 측정했습니다. BUN 분석 키트는 ABSBio™(UREA NITROGEN Kit, CNHAO BIO, Beijing, China)에서 구입했습니다.

2.4. 조직학.

파라핀에 포매하기 전에 신장 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 신장 파라핀 블록을 2㎛ 섹션으로 절단하고 25℃에서 밤새 슬라이드에 장착하였다. 탈파라핀화 후, 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 현미경(BX-51/DP-72; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 얻었습니다. 앞서 기술한 바와 같이[9], 신세뇨관 손상은 세뇨관 확장, 울혈/출혈, 브러시 경계 소실, 세뇨관 캐스트 형성, 세뇨관 내강의 벗겨진 파편으로 인한 세포 용해와 같은 여러 조직병리학적 변화를 기반으로 진단되었습니다. 세관 손상은 손상된 세관의 비율에 따라 점수를 매겼습니다. 0, 손상 없음; 1,<25%; 2,="" 25–50%;="" 3,="" 51–75%;="" and="" 4,="">75퍼센트 . 점수는 블라인드 방식으로 수행되었습니다.

2.5. 면역형광 및 면역조직화학.

조직학(H&E) 분석에 대해 설명한 대로 섹션을 준비한 다음 크실렌으로 탈파라핀화한 후 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 30분 동안 0.3% 과산화수소와 함께 배양했습니다. 항원 검색을 위해 절편을 proteinase K(DAKO Cytomation, Glostrup, Denmark)와 함께 10분 동안 인큐베이션했습니다. 10% 염소 혈청으로 차단한 후, 섹션을 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양하였다(항-Kim 1 항체, ab47635, Abcam; 항 Ki67 항체, ab15580, Abcam; 항-PAR{12}} 항체, ab32611 , Abcam). 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후 섹션을 25℃에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. DAB 기질(DAKO)을 사용하여 면역조직화학(IHC) 염색 결과를 시각화했습니다. Alexa Fluor 594-표지 이차 항체를 사용하여 형광 신호를 감지했습니다. 적절한 필터가 있는 FL 형광 현미경(BX51; Olympus)을 사용하여 이미지를 캡처했습니다. ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 양성 영역을 분석했습니다.

2.6. 실시간 PCR.

이러한 조건에서 mRNA 발현의 조절을 평가하기 위해 mRNA는 신장 조직에서 분리되었습니다. PCR 시스템(7300 Fast Real-Time, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 18S 및 PAR의 수준을 감지했습니다-1 mRNA. 프라이머 서열은 다음과 같았다: 18S -5' -GTAACCCGTTGAACCCCATT-3', 5'-CCATCCAATCG GTAGTAGCG-3'; PAR{11}}—5′-GTTGATCGTTTCCACG GTCT{14}}′, 5′-GCTGCCTCTGTACCAGGACT-3′. 상대 mRNA 수준은 2-ΔΔCq 방법을 사용하여 결정되었습니다. ΔΔCq 값은 대조군의 데이터를 사용하여 계산되었습니다.

2.7. 수술 절차 및 생체 내 다광자 이미징 설정.

마우스를 2% 이소플루란(Mylan, Osaka, Japan)으로 마취시켰다. 기관절개술 후, 인산염 완충 식염수에 1.{2}}μL/min의 2% 알부민으로 구성된 형광 염료 주입 및 유지액 주입을 위해 경정맥에 캐뉼러를 삽입했습니다. 각 마우스의 왼쪽 신장은 작은 옆구리 절개를 통해 외부화되었고 커버슬립에 부착되었습니다. 현미경 스테이지와 동물은 모든 실험 과정에서 가열 패드를 사용하여 데워졌습니다. 생체 내 다광자 현미경은 860nm에서 Chameleon Ultra-II MP 레이저로 구동되는 Olympus FV1000MPE 다광자 공초점 형광 이미징 시스템(Coherent, Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 현미경 대물렌즈는 1.05 개구수를 가진 25x 수침 렌즈였습니다. 현미경의 이미징 설정(세 채널 모두에 대한 이득 및 오프셋, 파란색, 녹색 및 빨간색)은 실험 내내 고정되었습니다. 30분의 회복 기간 후 로다민 B{12}}kD 덱스트란을 정맥 주사하고 3-D z-stack 이미지를 신장 표면에서 5~50μm(2μm 간격) 깊이에서 촬영했습니다.

2.8. 세포 배양.

인간 신장 2(HK2) 세포는 Cell Bank of Academy Sciences(Shanghai, China)에서 입수하고 이전에 설명한 대로 배양했습니다[10]. 세포는 37도에서 95% 공기와 5% CO2의 습한 분위기에서 10% 소태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 배양되었습니다.

2.9. 세포 증식을 평가하기 위한 WST-1 분석.

HK2 세포를 6-웰 ​​플레이트에 1×104개 세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. HK2 세포를 트롬빈으로 자극한 후 제조사의 프로토콜(catalog #C0035; Beyotime, Shanghai, China)에 따라 WST{6}} 분석을 수행하여 세포의 증식 능력을 측정했습니다. 각 웰에 100μL WST{10}} 시약으로 2시간 동안 배양한 후, 샘플의 흡광도를 450nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정했습니다.

2.10. 카스파제{2}} 분석.

Caspase{0}} 활성은 시판되는 caspase{1}} 활성 키트(catalog #C1116; Beyotime, Shanghai, China)를 사용하여 측정되었습니다[11]. caspase{4}} 활성 키트 시약과 함께 배양한 후 제조업체의 지침에 따라 405nm에서 마이크로플레이트 판독기(Spectra-Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 샘플의 흡광도를 감지했습니다.

2.11. 데이터 및 통계 분석.

일원 분산 분석을 사용하여 여러 그룹을 비교한 다음 Tukey의 다중 비교 테스트를 수행했습니다. 두 개의 개별 그룹을 비교하기 위해 Student's t-test를 사용했습니다. p < 0:05는="" 통계적으로="" 유의한="" 결과를="" 나타내는="" 것으로="">

시스탄체 튜불로사신장 질환을 예방

3. 결과

3.1. PAR-1 IR 신장에서의 발현.

우리는 먼저 PAR-1의 발현과 IR이 발현 수준에 미치는 영향을 확인했습니다.신장. 우리는 48시간에 가짜 수술 마우스에서와 비교하여 PAR-1 mRNA의 발현 수준이 거의 2-배 증가하는 것을 관찰했습니다(그림 1(a)). 또한 IR 후 48시간에 면역형광법으로 PAR-1의 발현을 측정했습니다. PAR-1은 관형 세포 브러시 경계 막에서 발현되었습니다. PAR-1 FL 형광 수준은 가짜 그룹 마우스에 비해 상향 조절되었습니다(그림 1(b) 및 1(c)). 이러한 데이터는 관상 세포에서 PAR{10}}의 위치와 그 발현 수준이 신장에서 IR 후 상향 조절되었음을 시사합니다.

3.2. 신장 기능 및 조직병리학적 변화. 우리는 평가했다신장혈장에서 BUN과 크레아티닌 수치를 감지하여 기능을 수행합니다. I/R은 가짜 수술을 받은 쥐에 비해 BUN과 크레아티닌 수치의 증가를 유도했습니다. 또한, IR에 의한 BUN 수준 증가는 Q{1}처리된 마우스에서 유의하게 감소했습니다(그림 2(a)). 혈청 크레아티닌 수치는 IR 수술만 받은 마우스에 비해 Q{3}}처리된 마우스에서 억제되었습니다(그림 2(b)). 이 데이터는 Q94의 투여가신장IR 부상 후 기능.

우리는 또한 H&E 염색을 수행하여 신장 조직병리학적 변화를 평가했습니다. 신장 IR은 가짜 마우스에 비해 비히클 처리된 마우스에서 캐스트 형성, 관 확장, 브러시 경계 손실 및 혼잡/출혈을 유의하게 증가시켰습니다. Q94 처리는 IR에 의해 유도된 이러한 변화를 현저하게 억제했습니다(그림 2(c) 및 3(a)). 그룹 간 H&E 염색 결과를 분석한 결과 각 그룹의 울혈/출혈 점수와 세뇨관 손상 점수가 나타났습니다. Q94 그룹 마우스는 훨씬 낮은 점수를 나타냈습니다(그림 2(e) 및 3(c)). 우리는 또한 Kim-1을신장IHC에 의한 신세뇨관 세포의 손상 마커 [12]. Kim{1}}양성 영역은 Q94에 의해 유의하게 억제된 IR 손상 마우스의 신세뇨관 영역에서 증가했습니다(그림 2(d) 및 2(f)). 이 데이터는 Q94가신장IR 손상으로 인한 세뇨관 손상.

3.3. 생체 내 영상에서 비정상적인 혈구 흐름.

PAR-1 및 리간드 트롬빈은 혼잡에서 중요한 역할을 합니다. Q94는 혼잡을 크게 개선했습니다. 따라서 우리는 다광자 현미경으로 생체 내 이미징을 수행했습니다. 이것은 살아있는 생쥐에서 실시간으로 모세혈관 주위의 혈구를 관찰할 수 있게 합니다(그림 3(c)). 혈장은 로다민 B와 결합된 70kDa 덱스트란에 의해 시각화되었습니다(그림 3(d)). 레이저에 반응하여 FL 형광을 생성하지 않는 혈액 세포는 로다민 B를 자극하는 데 사용되었고 그림자로 묘사되었습니다. 그림 3(e)에서 볼 수 있듯이, 신장 IR은 규칙적인 혈구 추적을 방해하고 미세 순환 장애를 유발했습니다. Q94 개선된 세뇨관주위 모세혈구 펠로우.

3.4. IR 손상 후 세관 세포 증식.

세뇨관 세포의 증식 재생은 IR 손상 후 세뇨관 구조 및 신장 기능의 회복에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다. PAR{0}}은 트롬빈에 의해 활성화될 때 상피 세포의 증식을 수정하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 우리는 Ki{1}} IHC 분석에서 신세뇨관 세포의 증식을 감지했습니다. IR 후 48시간에 증식하는 Ki{3}}세관 세포의 수가 증가했습니다. Q94는 IR 처리된 마우스에만 있는 것과 비교하여 IR 후 Ki{5}}양성 세뇨관 세포의 증가된 수를 추가로 증가시켰습니다(그림 4(a) 및 4(b)). 또한 PAR{9}} 작용제인 트롬빈과 함께 배양된 HK2 세포를 사용하여 in vitro 실험에서 PAR{9}} 억제가 세포 증식 능력에 영향을 미치는지 확인했습니다. HK2 세포의 증식 활성은 WST{13}} 분석으로 측정되었습니다. 그림 4(c)에서 볼 수 있듯이 트롬빈 처리 후 HK2 세포의 증식이 극적으로 억제되었습니다. 그러나 이 트롬빈 유도 억제는 Q94에 의해 거의 폐지되었습니다. 이러한 데이터는 PAR{18}}이 Q94 PAR{20}} 길항제에 의해 거의 제거된 신세뇨관 세포의 증식을 부정적으로 조절함을 나타냅니다.

만성콩팥병을 완화하기 위해시스탄체

3.5. 신장 세뇨관 세포 사멸.

우리는 caspase{0}}를 사용하여 신장 세포의 apoptosis를 추가로 조사했는데, 이는 가장 중요한 실행 caspase이며 apoptosis 동안 내부 및 외부 경로 모두에 의해 활성화됩니다[13]. 트롬빈 배양된 HK2 세포를 사용하여 트롬빈이 caspase-3의 활성을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 또한 Q94의 투여는 caspase-3의 활성을 억제했습니다(그림 4(d)). 이러한 데이터는 HK2 세포의 트롬빈 유도성 세포자멸사가 Q94 PAR{11}} 길항제에 의해 억제되었음을 시사합니다.

4. 토론

신장IR 손상은 울혈/출혈, 급성 세뇨관 괴사, 염증 및 깁스 형성 침착이 특징입니다[5]. 여기에서 우리는 PAR-1의 억제가 혈액 동료 관련 변화와 세뇨관 간질 변화를 모두 개선한다는 것을 보여주었습니다. PAR-1과 그 리간드인 트롬빈이 혈소판 응고에서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있으며, 트롬보모듈린[14, 15]과 같은 이 시스템의 간섭은 AKI를 예방할 수 있습니다. 우리는 PAR- 1 억제가 신장 IR 손상이 있는 마우스에서 울혈을 억제하고 세뇨관 주위 모세혈관의 혈류를 개선함을 보여 PAR-1 시스템이 미세 순환을 악화시켰음을 시사합니다. 또한, PAR{9}}의 발현 수준은 신장 IR 손상 후 세뇨관에서 상향 조절되어 세뇨관의 PAR{10}}의존계가 신장 IR 손상을 과장한다는 것을 나타냅니다. 세뇨관 세포의 재생은 세뇨관 구조를 재건하고 IR 손상 후 신장 기능을 회복하는 데 중요한 과정이라는 것은 잘 알려져 있습니다[16, 17]. 부상 정도에 따라 이 수리 능력은 무제한이 아니다[18]. 따라서, 관상 세포의 손상을 약화시키거나 증식을 가속화하기 위한 치료 옵션이 시급히 필요합니다. 우리의 시험관 내 연구에 따르면 PAR{14}}/트롬빈은 세관 세포의 증식을 부정적으로 조절했으며, 이는 차례로 PAR{15}}의 억제에 따라 가속화되었습니다. 또한, 마우스에서 IR 손상은 48시간에 세뇨관 증식을 증가시키는 것으로 나타났으며, PAR{17}} 억제 후에는 추가로 증가했습니다. 근위 세뇨관의 브러시 경계 막에서 PAR{18}}이 증가한다는 것을 발견했습니다. 신장 IR 손상 시 사구체 여과 장벽의 기능이 감소하는 것으로 보고되어[19], 사구체에서 여과된 트롬빈이 증가된 PAR{20}}을 활성화시켜 세뇨관 재생을 방해할 수 있습니다.

우리의 결과는 PAR{0}}/트롬빈 시스템이 세뇨관 세포의 증식을 억제하고 세포자멸사를 증가시켰음을 시사합니다. 그러나 다른 연구에서는 단백질 C에 의해 활성화될 때 PAR{1}}의 반대 효과가 나타났습니다[20, 21]. PAR-1의 이러한 명백한 충돌 역할은 활성화 방법에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 연구에서 그 역할에 대한 가능한 설명은 PAR-1이 필터링된 트롬빈에 의해 활성화되었다는 것입니다. 단백질 C의 크기는 60kDa 이상으로 알부민[22, 23]과 비슷하고 트롬빈(36kDa)보다 훨씬 크다. 또한 혈장 농도(<100 nm)="" is="" less="" than="" 10%="" of="" thrombin="" (="">1 μM), 이는 단백질 C가 트롬빈에 비해 더 적은 여과를 거치고 더 약한 신호를 생성함을 나타냅니다.

혈전성 에피소드는 말기 신부전 환자의 위험 인자이다[24]. 한 연구에 따르면 PAR-1 결핍이 당뇨병성 CKD를 예방하는 것으로 나타났습니다[25]. 우리 연구에서 우리는 IR 후 초기 단계에서 신장 기능에 대한 PAR-1 억제 효과를 관찰했습니다. 추가 연구에서 우리는 만성신장PAR-1과 CKD 간의 잠재적 연관성을 평가하기 위한 IR 유도 질병 모델[2].

결론적으로, 우리는 PAR{0}}이 미세순환 장애를 악화시키고 관상 세포의 증식을 부정적으로 조절한다는 것을 입증했습니다. 대조적으로, PAR-1의 억제는 IR 이후 및 신장 회복의 두드러진 기전으로 작용하는 미세 순환 및 세관 세포의 증식을 개선하는 데 기여했으며 AKI 치료의 새로운 전략으로 간주되어야 합니다.

Cistanche tubulosa는 신장 질환을 예방합니다. 샘플을 얻으려면 여기를 클릭하십시오.

1수도의과대학 북경우의병원 비뇨기과학교실

2일본 가가와현 가가와대학 가가와대학 약리학과

3중산대학교 제3부속병원 외과 신장이식과,

중국 광저우

서신은 Ye Tian에게 보내야 합니다. kidney@ccmu.edu.cn 및 Lei Zhang; leizhangkidney@gmail.com 2021년 1월 1일에 접수됨; 2021년 1월 25일 개정 2021년 2월 8일 수락됨; 2021년 2월 23일 게시됨

학술 편집자: Junyan Liu

Copyright © 2021 Yu Guan et al. 이것은 아래에 배포된 오픈 액세스 기사입니다.크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이선스, 원본 저작물이 적절하게 인용된 경우 모든 매체에서 제한 없이 사용, 배포 및 복제할 수 있습니다.

허혈-재관류-(IR-) 유발 신장 손상은 신장 이식 및 로봇 보조 부분 신장 절제술 중에 피하기 어렵습니다. 신장 IR 손상은 세뇨관 손상, 미세 순환 장애 및 염증을 특징으로 하며, 이는 신장 손상을 조정하여 증가시킵니다. 그러나 이러한 상태에 대해 사용할 수 있는 특정 치료는 없습니다. 프로테아제 활성화 수용체-1(PAR-1)와 그 리간드인 트롬빈은 응고에 관여하며 상피 세포 손상과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 여기에서 우리는 PAR-1이 신장 IR에 의한 세뇨관 세포 손상과 미세 순환 장애를 과장하고 Q94에 의한 PAR-1의 약리학적 억제가 이러한 손상을 예방할 수 있다고 가정했습니다. 신장 온열 IR은 신장 세뇨관에서 PAR{11}}의 발현을 증가시켰습니다. Q94는 신장 IR 유도 변화와 조직병리학적 손상을 약화시켰습니다. 미세 순환 장애는 조직 병리학의 혼잡으로 분석되었으며 생체 내 다광자 현미경으로 검사한 혈구 흐름은 Q94 처리에 의해 억제되었습니다. Q94는 또한 낮은 신장 손상에도 불구하고 세뇨관 세포 증식을 극적으로 증가시켰습니다. 트롬빈은 세뇨관에서 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도했습니다. 이러한 효과는 Q94 처리로 방지되었습니다. 종합하면 PAR{17}}은 신장 IR 손상과 관련이 있습니다. PAR{18}} 억제는 신장 미세순환 및 세뇨관 세포 생존/증식을 개선함으로써 손상을 개선할 수 있습니다.

Data A바일ab일리트y

저자는 이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터가 기사 내에서 이용 가능함을 확인합니다.

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모든 저자는 경쟁 이익이 없음을 선언했습니다.

Aut호rs' C~에트르i부ti~에s

Yu Guan과 Daisuke Nakano가 원고를 작성하고 동물 실험을 수행했습니다. Lei Li는 시험관 내 실험을 수행했습니다. Haofeng Zheng이 통계 분석을 수행했습니다. 니시야마 아키라가 원고를 수정했습니다. Lei Zhang과 Ye Tian이 이 연구를 설계했습니다.

Ac크owledgmenTS

이 연구는 중국 국립자연과학재단(No. 82000712)과 중국박사후과학재단(No. 2020M670385)의 지원을 받았습니다.

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