Hsa-microRNA-4535-매개 TGF/Smad 신호를 통한 H2O2/UVB 유도 진피 섬유아세포 콜라겐 분해에 대한 Cistanche의 보호 효과
May 06, 2023
추상적인
이 연구는 그 기저에 있는 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 했습니다.cistanche의 보호 효과시험관내 및 생체내 광손상 모델을 사용하여 H2O2/UVB로 인한 손상에 대해 또한, 우리는 이 과정에서 miRNA 조절의 관련성을 확인했습니다. H2O2/UVB 처리된 HS68 인간 진피 섬유아세포 및 UVB 유도된 C57BL/6J 누드 마우스는 시험관내 및 생체내 광손상 모델로 사용되었습니다. 결과는시탕슈 트리트먼트H2O2/UVB로 인한 세포 생존력 감소 완화, TGF/Smad 신호 장애, 피부 노화. microRNA 어레이 분석 및 데이터베이스 검색 결과를 기반으로 has-miR-4535은Smad4를 표적으로 하는 잠재적 후보 miRNA. 시험관 내에서 cistanche 처리는 Smad2/3/4 복합체를 활성화하고 H2O2/UVB에 노출된 세포에서 hsa-miR-4535 발현을 억제했습니다. 생체 내에서, C57BL/6J 누드 마우스의 등쪽 피부에 저용량(12mg/kg) 및 고용량(24mg/kg)의 시스탄슈를 국소 적용하면 TGF/Smad 콜라겐 합성 신호 전달을 촉진하여 UVB 유발 피부 광손상을 상당히 완화시켰습니다. 표피 증식, 주름 형성 및 피부 노화를 감소시키고 hsa-miR-4535 발현을 억제합니다. 종합하면, 우리의 연구 결과는 hsa-miR-4535과 TGF/Smad 콜라겐 합성 신호 사이의 연관성을 나타내며 이러한 요인이 H2O2/UVB 유발 노화에 대한 진피 섬유아세포의 광 보호 메커니즘에 관여하는 것으로 제안합니다. 증거는노화 방지 속성을 가진 cistanche될 수 있다에서 보충으로 간주스킨 케어 제품.
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소개
인간 피부 노화의 임상 징후에는 주름 증가, 이완 및 불규칙한 색소 침착이 포함됩니다[1]. 피부 노화의 과정은 복잡하며 내인성 노화와 외인성 노화의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. 내적노화는 시간의 경과와 유전적 요인에 의한 것이며, 외적노화는 광노화라고도 하며 주로 자외선에 노출되어 발생한다[2, 3]. 이전 연구에서는 내인성 및 외인성 노화 과정에서 풍부한 활성산소종(ROS)이 생성되는 것으로 나타났습니다. ROS의 축적은 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 전달을 유도하고 다운스트림 전사 인자인 활성제 단백질-1(AP-1)을 활성화할 수 있습니다. 활성화된 AP-1는 핵으로 이동하여 MMP(matrix metalloproteinases)의 프로모터 영역에 결합할 수 있습니다[4]. MMP는 아연에 의존하는 큰 엔도펩티다제 그룹으로, 피부 진피 세포외 기질(ECM)의 분해에 기여합니다. 특히 콜라게나제인 MMP-1는 콜라겐 1형과 3형의 절단에 관여한다[5]. ECM의 주요 성분인 콜라겐 I형과 III형은 피부 진피에 지지력과 힘을 부여할 수 있으며 이들의 혼란은 노화된 피부의 특징적인 주름과 늘어짐을 유발합니다[6]. Transforming growth factor-beta(TGF )는 인간 피부 진피에서 콜라겐 합성을 긍정적으로 조절할 수 있는 TGF 1, TGF 2 및 TGF 3의 세 가지 다른 이소형을 가진 유비쿼터스 및 강력한 사이토카인입니다[2]. TGF는 TGF 수용체 유형 I(TRI) 및 II(TRII)를 포함하는 특정 세포 표면 세린/트레오닌 키나아제 수용체 복합체와 상호작용하여 신호를 개시합니다. TRI 인산화는 R-Smads(Smad2 및 Smad3)의 인산화를 유발합니다. 활성화된 R-Smads는 Smad4와 상호작용하여 핵 전좌를 조절하고 Smad 결합 요소(SBE)의 프로모터에 결합함으로써 콜라겐 유형 I 및 III을 전사적으로 활성화합니다[7, 8]. 내인성 또는 광노화에 의해 유도된 증가된 ROS 생성이 TGF/Smad 신호 전달 경로 손상에 기여하며, 결과적으로 인간 피부 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성이 감소한다는 증거가 늘어나고 있습니다[9, 10]. 플라보노이드 계열의 천연 구성원인 cistanche(3,5,7-trihydroxy flavone)는 Alpinia officinarum과 프로폴리스에 풍부합니다. cistanche는 허혈성 뇌졸중, 당뇨병 및 다양한 암 유형을 치료할 수 있는 잠재적인 후보입니다[11-13]. 또한, cistanche는 라디칼 소거 및 항염증 활성을 가지고 있습니다[14, 15]. 우리는 이전에 Cistanche가 H2O2-유도 염증을 감소시키고 HS68 세포에서 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGFI-R)/ERK1/2 신호 경로를 통해 콜라겐 형성을 촉진한다는 것을 보여주었습니다[16, 17]. 또한 한 연구에 따르면 cistanche는 Alpinia officinarum의 화합물로 확인되었으며 진피 섬유아세포에서 콜라게나제 억제 효과를 나타냅니다[18]. 그러나 cistanche가 진피 피부 노화를 조절하는 방법과 관련된 더 자세한 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. MicroRNA(miRNA)는 평균 길이가 22개 뉴클레오티드인 작은 단일 가닥 비코딩 RNA 분자 그룹입니다. 성숙한 miRNA는 DNA 서열에서 전사됩니다. 대부분의 경우, 성숙한 miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 결합하여 mRNA 번역을 침묵시킵니다[19]. 인간 피부에서 miRNA는 세포 대사, 암, 노화 및 콜라겐 형성의 조절에 중요한 역할을 합니다[20-23]. 예를 들어, miR-377는 DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1) 발현을 억제하여 진피 섬유아세포 노화를 유도할 수 있으며, 이는 이후 p53 프로모터 및 진피 섬유아세포 노화에서 더 적은 메틸화로 이어집니다[22]. 인간 진피 유두 세포(nHDPs)에서 UVB로 유발된 손상의 miRNA 프로파일은 이전에 조사되었습니다[24]. 그러나, 특히 천연 화합물의 관여에서 miRNA 조절을 통한 UVB 유도 진피 섬유아세포 노화는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 H2O2/UVB로 유발된 피부 손상에 대한 시스탕의 보호 효과와 이 과정에서 마이크로 RNA 매개 콜라겐 분해의 역할을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 또한 콜라겐 합성 조절에 관여하는 마이크로 RNA를 확인하는 것을 목표로 했습니다.
결과
cistanche는 HS68 인간 진피 섬유아세포에서 UVB/H2O2- 유도 세포독성을 억제합니다.
체외에서 시스탕의 세포독성(그림 1A)을 조사하기 위해 HS68 세포를 다양한 용량의 시스탕(0, 10, 20, 30, 40, 50 μM)으로 처리했습니다. 24시간 동안. MTT 분석 결과는 cistanche가 HS68 세포에 세포독성이 없음을 보여주었습니다(그림 1B). 다음으로, 우리는 24시간 동안 H2O2(0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) 및 UVB(0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²)의 다른 용량에 HS68 세포를 노출시켰습니다. H2O2 및 UVB 처리는 용량 의존적 방식으로 세포 생존력을 감소시켰다(그림 1C, 1D). 다음과 같은 cistanche의 세포 보호 특성을 평가하기 위해H2O2 및 UVB 노출, 우리는 HS68 세포를다른 농도의 cistanche (10, 20, 30 μM)다음 H2O2- (200 μM) 및 UVB 유도(40mJ/cm²) 손상. 시간2O2 또는 UVB 단독 처리HS68의 생존력을 크게 감소(40%)세포. 그러나 cistanche 처리는 세포 사멸을 예방했습니다.농도 의존적 방식으로(그림 1E, 1F).더 높은 농도의 cistanche (30 μM)가 두드러지게 나타남알레비에이치2O2- UVB에 의한 세포독성.따라서 30 μM cistanche의 용량이후속체외보호 기능을 평가하기 위한 연구HS68 세포에서의 효과.
그림 1. cistanche는 HS68 인간 진피 섬유아세포에서 UVB/H2O2- 유도 세포독성을 억제합니다. (A) cistanche의 화학 구조. (B) 상이한 농도의 시스탄체(10, 20, 30, 40, 50 μM로 처리된 HS68 세포의 세포 생존율 ) 24시간 동안. (C 및 D) 다양한 용량의 H2O2(100, 150, 200, 250, 300 μM)에 노출되거나 24시간 동안 UVB(25, 30, 40, 50, 60 J/cm2)로 조사된 HS68 세포의 세포 생존력. (E 및 F) 1시간 동안 H2O2(200 μM)에 노출되거나 UVB(40 J/cm2)로 조사된 후 23시간 동안 시스탄체(10, 20, 30 μM)로 처리된 HS68 세포의 세포 생존율. cistanche의 세포 보호 효과는 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 대조군 세포에는 100% 생존력이 지정되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; ##P < 0.01, ###P < 0.001 대 H2O2 또는 UVB 처리된 세포.
Cistanche는 H2O2- 유도된 HS68 세포를 약화시킵니다.세포 사멸보다는 노화
Cistanche는 HS68 세포에서 UVB/H2O2- 유도 세포 내/미토콘드리아 ROS 생성 및 MMP 불균형을 약화시킵니다.
cistanche는 H2O2-유도 TGF /Smad를 약화시킵니다.HS68 세포의 콜라겐 합성 경로 장애
Cistanche 처리는 H2O2-유도된 hsa-miR-4535의 상향 조절된 발현을 감소시키며, Smad4를 표적으로 하는 것으로 예측됩니다.
그림 4. cistanche는 HS68 세포에서 H2O2- 유도 TGF /Smad 콜라겐 합성 경로 손상을 약화시킵니다. (A) HS68 세포를 1시간 동안 H2O2(200 μM)에 노출시킨 다음 23시간 동안 시스탄체(30 μM)로 처리했습니다. 콜라겐 합성 관련 경로 성분(TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) 및 콜라겐 분해 관련 단백질(MMP-1)의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 검출하였다. (B) 핵 및 세포질 분획에서 p-smad2/3 및 Smad4의 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 검출하였다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 미처리 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs. H2O2- 처리된 세포. (C) 항-p-Smad2/3, Smad4 항체 및 FITC/PE 접합된 2차 항체를 사용하여 p-Smad2/3(녹색) 및 Smad4(적색) 발현을 검출했습니다. DAPI는 핵 위치(파란색)를 나타냅니다. 형광 현미경(200×)을 사용하여 이미지를 캡처했습니다.
has-miR-4535에 의한 Smad4의 조절은 H2O2-에 노출된 인간 피부 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성에 관여합니다.
및 COL3A1 수준(그림7F). hsa-miR-4535의 과발현(그림 8A–8C) 또는 siRNA에 의한 Smad4의 억제(그림 8D, 8E)는 H2O2 노출 후 시스탕케 처리 하에서 콜라겐 합성을 감소시켰습니다. 놀랍게도, 우리는 H2O2- 처리된 HS68 세포에서 직접적인 Smad4 침묵 및 hsa-miR-4535 모방 역전된 cistanche 유도 콜라겐 합성을 사용한 처리를 발견했습니다. 종합하면, 우리는 cistanche가 H2O2에 노출된 HS68 세포에서 Smad4 신호를 향상시키기 위해 잠재적으로 hsa-miR-4535 수준을 감소시킴으로써 콜라겐 합성을 조절한다고 결론지었습니다.
cistanche는 TGF/Smad 콜라겐 합성 경로를 강화하고 피부 노화를 약화시킬 뿐만 아니라 UVB에 노출된 HS68 세포에서 has-miR-4535 발현을 억제합니다.
Cistanche의 국소 적용은 C57BL6/J 누드 마우스의 등쪽 피부에서 TGF/Smad 신호를 강화할 뿐만 아니라 UVB 유도 피부 증식 및 콜라겐 분해를 약화시킵니다.
그림 6. cistanche는 hsa-miR-4535 수준을 감소시켜 Smad4 발현을 상향 조정합니다. (A, B) HS68 세포를 다양한 농도의 H2O2(0, 100, 20{{30}} μM로 처리했습니다. ) 24시간 동안. (C, D) HS68 세포를 1시간 동안 H2O2(200 μM)에 노출시킨 다음 23시간 동안 시스탄체(30 μM)로 처리했습니다. hsa-miR-4535 및 Smad4의 발현은 qRT-PCR에 의해 검출되었다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; ##P < 0.01, ###P < 0.001 대 H2O2- 처리된 세포.
그림 7. hsa-miR-4535의 과발현 또는 억제는 HS68 세포에서 콜라겐 합성을 조절합니다. (A–C) HS68 세포를 hsa-miR-4535 억제제(40 nM) 또는 억제제 NC(40 nM)로 1시간 동안 형질감염시킨 다음 H2O2(2 00 μM) 23시간 동안. (D–F) HS68 세포를 hsa-miR-4535 mimic(10 nM) 또는 mimic NC(10 nM)로 1시간 동안 형질감염시킨 후 cistanche로 공동 처리했습니다. (30μM) 23시간 동안. hsa-miR-4535 수준은 성공적인 형질감염을 보장하기 위해 qPCR에 의해 검출되었습니다. Smad4, COL1A1 및 COL3A1의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석했습니다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 대 H2O2 또는 시스탄슈 처리된 세포.
그림 8. siRNA 또는 hsa-miR-4535 모방에 의한 Smad4의 억제는 진피 섬유아세포에서 콜라겐 합성의 cistanche 매개 강화를 역전시킵니다. (A–C) HS68 세포를 hsa-miR-4535 mimic(10 nM) 또는 mimic NC(10 nM)로 1시간 동안 형질감염시킨 후 cistanche(3 23시간 동안 {{40}} μM) 및 H2O2(200 μM). Hsa-miR-4535(A) 및 Smad4(B) 수준은 성공적인 형질감염을 보장하기 위해 qPCR에 의해 검출되었습니다. (D-E) HS68 세포를 siRNA Smad4(20nM) 또는 siRNA NC(20nM)로 1시간 동안 형질감염시킨 후, 시스탕(30μM) 및 H2O2(200μM)로 23시간 동안 공동 처리하였다. 성공적인 형질감염을 보장하기 위해 qPCR에 의해 Smad4 수준이 검출되었습니다(D). Smad4, COL1A1 및 COL3A1의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅(C, E)으로 분석했습니다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 표시된 값은 평균 ± SE입니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 처리되지 않은 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01, vs. H2O2- 처리된 세포; $$P < 0.01, $$$P < 0.001 vs. H2O2 + 시스탕슈 처리된 세포
또한, Cistanche 적용은 UVB 손상 피부 조직에서 TGF , p smad2/3 및 Smad4 단백질 발현을 구했습니다(그림 12C). 우리의 발견은 Cistanche가 최종적으로 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 P-smad2/3의 활성화를 위한 Smad4 발현을 향상시키기 위해 hsa miR-4535을 억제함으로써 UVB 유발 손상으로부터 피부를 잠재적으로 보호할 수 있음을 나타냅니다(그림 13).
그림 9. cistanche는 TGF/Smad 콜라겐 합성 경로를 강화하고 피부 노화를 약화시킬 뿐만 아니라 UVB에 노출된 HS68 세포에서 hsa-miR-4535 발현을 억제합니다. HS68 세포를 UVB(40 mJ/cm2 )에 노출시킨 다음 23시간 동안 시스탄체(30 μM)로 처리했습니다. (A) 콜라겐 합성 관련 경로 성분(TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), 콜라겐 분해 관련 단백질(MMP{20}}) 및 노화- 연관된 마커(p16 및 p21)가 웨스턴 블롯에 의해 검출되었습니다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (B 및 C) hsa-miR-4535 및 Smad4의 RNA 발현은 qRT-PCR에 의해 검출되었습니다. 값은 평균 ± SE로 표시됩니다. 결과의 정량화가 표시됩니다(n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, 대 처리되지 않은 대조군 세포; #P < 0.05, ##P < 0.01 대 UVB 노출 세포.
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