새로운 Wenshen Shengjing 달인이 테스토스테론 합성 및 정자 생성 세포 사멸의 Cyclosporine 유발 손상에 대한 보호 효과

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

XIAOYAN PAN , XYAN WANG , XUENAN WANG , WANSHENG ZHANG4 , ZHANXUAN SUN1 , XUAN XUAN LIANG , XUE ZHANG , WENJUN LI 및 ZHIXIN LI

추상적인

본 연구는 새로운 Wenshen Shengjing Decoction(신형 WSSJD, Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax 인삼, Cynomorium solarium,시스탄체 데저티콜라, Radix Astragali, Epimedium brevicornum 및 Angelica Sinensis)에서 사이클로스포린으로 유발된 테스토스테론 합성 장애 및 생쥐의 정자 형성 세포 사멸에 대해 설명합니다. 총 90마리의 성인 수컷 Kunming 마우스를 다음 6개 그룹으로 나누었습니다: 대조군(개입 없음), 디메틸설폭사이드(DMSO, DMSO만 제공), 사이클로스포린 A(CSA), 클로미펜 시트레이트(CC, CsA + CC, 15 mg/kg /일), WSSJD(CsA + WSSJD, 생약 12g/kg/일) 및 새로운 WSSJD(CsA + 새로운 WSSJD, 생약 12g/kg/일). 모든 마우스는 경구 위관 영양법을 통해 30일 동안 치료되었습니다. 정소 상피의 발달을 평가하기 위해 고환을 고정하고 hematoxylin & eosin으로 염색했습니다. 면역조직화학 기술을 사용하여 고환 Leydig 세포에서 황체형성 호르몬 수용체(LHR) 및 P450 측쇄 절단(P450scc)의 발현을 검출했습니다. 또한, 말단 deoxynucleotidyl transferase에 의한 dUTP nick-end labeling assay를 이용하여 고환에서 정자형성세포의 세포사멸을 검출하였고, 유세포분석기를 이용하여 부고환에서 정자의 생존율과 조기 세포사멸을 분석하였다. CsA 및 CC 그룹과 비교하여 새로운 WSSJD 투여는 혈청 테스토스테론 수준과 고환 Leydig 세포에서 LHR 및 P450scc의 발현을 유의하게 증가시켰습니다(P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">

시스탄체 데저티콜라

소개

Cyclosporine A(CSA)는 T 세포를 특이적으로 표적화하고 인터루킨의 분비를 억제하는 일반적으로 사용되는 면역억제제입니다{0}}, 간, 신장 및 각막 이식의 성공률과 생존율을 극적으로 증가시킵니다. 수신자(1-3). 그러나 장기간의 CsA 사용으로 유도된 면역 억제는 심혈관 질환, 감염 및 악성 종양의 위험을 상당히 증가시킵니다(4). Eid 등(5)은 정자의 농도와 운동성이 남성 신장 이식 수혜자의 혈청 CsA 농도와 음의 상관관계가 있다고 보고했으며, 이는 CsA가 남성 수혜자의 생식계 기능 장애를 유발할 수 있음을 시사합니다. 또한, CsA가 정자 생성 장애와 남성 생식 기관 손상의 원인이 될 수 있다는 것이 문서화되었습니다(6).

이전 연구에서는 CsA가 고환에서 테스토스테론 생합성 및 분비에 영향을 미침으로써 혈청 테스토스테론 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 그는 40mg/kg/day CsA로 처리된 쥐가 혈청 내 황체 형성 호르몬(LH) 수치가 상당히 높고 테스토스테론 수치가 현저히 낮아 고환 발달 장애를 초래한다는 것을 관찰했습니다. Ali et al(8)은 CsA 처리가 Leydig 세포막에서 LH 수용체(LHR)의 발현을 감소시켰고, 이는 결과적으로 Leydig 세포로부터 LH 매개 테스토스테론 합성 및 분비를 감소시켰다고 보고했습니다. Seethalakshmi et al(9)의 또 다른 연구에 따르면 CsA는 테스토스테론 생합성 동안 17 alpha-hydroxylase의 활성과 17 -hydroxysteroid dehydrogenase 활성을 경쟁적으로 억제하여 테스토스테론 수치를 감소시켰으며 CsA 억제의 주요 부위는 순환 아데노신을 중단했습니다. 일인산 자극. 또한, 이 보고서는 Leydig 세포에서 CsA에 의해 유도된 테스토스테론 분비 감소가 남성 생식 기관의 발달과 생식 능력의 유지에 직접적인 영향을 미친다는 것을 나타냈습니다. Seethalakshmi 등(10)은 내인성 테스토스테론 수치를 증가시키기 위해 CsA 처리된 쥐에 외인성 테스토스테론을 주입했습니다. 외인성 테스토스테론의 증가된 용량이 생식 기관 중량, 난포 자극 호르몬(FSH)의 혈청 수준을 유의하게 회복시키고 생식 세포 수를 증가시키는 것으로 관찰되었으며, 따라서 CsA에 의해 유발된 정자 형성 장애는 외인성 호르몬에 의해 부분적으로 예방될 수 있음을 나타냅니다. 테스토스테론 투여(10). 그러나 외인성 테스토스테론은 테스토스테론 분비와 정자 형성이 여전히 CsA의 영향을 받고 정자와 정자 형성 세포에서 높은 비율의 세포 사멸이 관찰되기 때문에 손상된 고환 조직을 복구하는 데 불충분 한 것으로 밝혀졌습니다 (10).

Wenshen Shengjing Decoction(WSSJD)은 주로 Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax 인삼, Cynomorium solarium,시스탄체 데저티콜라, 기수 황기, Epimedium brevicorneum 및 Angelica Sinensis (11). WSSJD는 사이클로포스파미드에 의해 유도된 정자형성 세포자멸사를 완화시키는 것으로 입증되었습니다(11). WSSJD의 치료 효과를 더욱 향상시키기 위해 본 연구에서는 WSSJD 성분의 투여량을 조절하여 CsA에 의해 유발된 고환 조직 손상의 메커니즘을 기반으로 하는 새로운 WSSJD를 개발했습니다. 현대 약리학 연구에 따르면 WSSJD의 녹용 벨벳이 성 호르몬으로 작용할 수 있음이 입증되었습니다(12). Radix Astragali는 고환 Sertoli 세포의 증식과 영양 공급을 개선할 수 있으며(13), Panax 인삼은 고환 과산화물 수준을 감소시키고 정자 형성 세포자멸사를 억제할 수 있습니다(14). 위에서 언급한 약물은 또한 신장 기능을 증가시키고 정자 생성 세포의 발달을 촉진할 수 있습니다(12-14). 클로미펜 구연산염(CC)은 이전 임상 연구에서 남성 불임에 치료 효과를 발휘하는 것으로 입증되었습니다(15,16). 또한 CC는 개선된 테스토스테론 및 정액 매개변수와 관련이 있으며 CC의 보호 메커니즘은 WSSJD의 보호 메커니즘과 유사할 수 있습니다(15,16). 또한 Wang et al(17)의 연구에서 CC는 한약인 Shengjing이 쥐의 정자 형성 장애에 미치는 영향을 조사하기 위한 치료 대조군으로 사용되었습니다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 CC를 양성대조군으로 사용하였다.

본 연구에서는 수정된 약의 치료 효능을 결정하기 위해 고환 조직에서 새로운 WSSJD의 보호 효과의 기본 메커니즘을 조사했습니다. 보호 메커니즘을 설명하면 CsA로 인한 정자 생성 손상을 개선하는 데 새로운 WSSJD를 사용할 수 있는 기반을 제공할 수 있습니다.

Cistanche Deserticola의 효과: 예방정자 손상

재료 및 방법

동물. Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd.(Changchun, China)에서 총 90마리의 수컷 Kunming 마우스(8-주령; 35-40 g)를 제공했습니다. 본 연구는 길림의과대학 윤리위원회(중국 창춘)의 승인을 받아 수행되었습니다. 마우스는 12시간 암광 주기에서 21±3˚C 및 55-65% 상대 습도에서 수용되었습니다. 마우스에게 표준 실험실 마우스 식이 및 멸균수를 무료로 제공했습니다.

WSSJD의 준비. Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax 인삼, Cynomorium solarium,시스탄체 데저티콜라, Radix Astragali, Epimedium brevicornum 및 Angelica Sinensis(11)는 Tongrentang(중국 베이징)에서 구입했습니다. 이 재료는 중국 약용 달인의 전통적인 방법에 따라 달렸습니다(18). 즉, 레시피에 따라 재료를 칭량하고 총 250ml의 증류수를 첨가하여 허브가 잠기도록 하였다. 허브를 30분 동안 담갔다가 가열했습니다. 허브를 먼저 10분 동안 끓인 다음 열을 줄여 20분 동안 끓입니다. 30분 가열 후, 액체 달인을 허브에서 분리하고 80˚C에서 200ml의 증류수를 추가로 30분 동안 달인다. 이 과정을 반복하고 4-5 거즈 층을 통해 달인 액체의 최종 부피를 여과했습니다. 액체는 또한 허브에서 여과된 달인으로 짜내었습니다. 달인은 농도가 2g 생약물/ml에 도달할 때까지 6-7시간 동안 수조에서 80°C로 가열하고 달인물은 사용하기 전에 4°C에서 보관했습니다. 새로운 WSSJD는 Panax 인삼, Cynomorium solarium, Radix Astragali 및 Epimedium brevicornum의 복용량을 약간 조정하여 WSSJD의 공식화를 기반으로 준비되었습니다. 달인 방법은 WSSJD와 동일합니다. 새로운 WSSJD는 다음으로 구성됩니다: Panax 인삼, 6g; 시노모리움 일광 욕실, 9g; 기수 황기, 12g; Epimedium brevicornum, 6g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1g;시스탄체 데저티콜라, 9g; 안젤리카 시넨시스, 6g; Flatstem Milkvetch 종자, 9g; Rhizoma Dioscoreae, 15g; 큰 머리 Atractylodes Rhizome, 6g; Ligusticum wallichii, 3g; Radix Paeoniae Alba, 6g; 계피 카시아, 1g; Costustoot, 1.5g 및 Fructus Foeniculi, 3g.

조 약물 추출물의 농도는 하기와 같이 결정하였다: 조 물질의 중량/최종 부피. 이 계산 방법은 중국 전통 의학(19-21)의 연구에서 널리 사용됩니다. 약물 투여. 마우스를 무작위로 6개 그룹(그룹당 15마리 마우스)으로 나누고 위내로 약물을 투여하였다. 그룹은 다음과 같습니다: 대조군(정상 식염수); 디메틸설폭사이드(DMSO); CSA; CC; WSSJD; 그리고 새로운 WSSJD. CsA, CC, WSSJD 및 새로운 WSSJD 그룹의 마우스는 이전에 설명한 대로 30일 동안 15mg/kg/day CsA(Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, China)를 복강 내(ip) 주사했습니다(8 ). 대조군 및 DMSO 그룹의 마우스는 30-일 실험 기간 동안 각각 동일한 부피의 생리 식염수 또는 DMSO 용매를 매일 복강내 주사했습니다. 생리 식염수에 희석된 DMSO의 농도는 3.25%(v/v)였습니다. CC 그룹은 앞서 설명한 대로 21.6mg/kg/day CC(GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China)를 투여했으며(13), 3.25%(v/v) DMSO(pH{14} }.2). WSSJD 및 새로운 WSSJD 그룹의 마우스에는 각각 WSSJD 및 새로운 WSSJD의 12g 조약/kg/일을 투여하였다.헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색. 마우스 고환을 채취하여 실온에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(pH{1}}.2)에 즉시 고정한 다음 에탄올 탈수, 에탄올 제거를 위한 크실렌 처리, 왁스 포매 및 절편을 수행했습니다. 회전식 마이크로톰을 사용하여 조직학적 절편(5 μm)을 얻었다. 이들은 H&E 염색을 위해 유리 슬라이드에 부착되었습니다. 정세관의 발달을 평가하고 조직 측정 데이터를 얻기 위해 하이라이트 조직 병리학 현미경을 사용하여 고환 섹션을 관찰했습니다. 정세관의 발달은 Johnsen 점수 체계를 사용하여 평가되었습니다(22).

엘리사. 처리 3일0에 마우스를 CO2로 안락사시키기 전에 체중 0.004ml/g의 10% 염소 수화물(Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd)로 복강내 마취시켰다. 간혈을 채취하고 혈청을 분리하여 -20˚C에 보관했습니다. 간단히 말해서, 혈액을 1.5ml 튜브에 수집하고 4˚C에서 밤새 보관했습니다. 그런 다음 튜브를 4˚C에서 6분 동안 1,300 xg로 원심분리하고 혈청을 수집했습니다. ELISA 키트(Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China)를 사용하여 테스토스테론(카탈로그 번호 EIA{13}}) 및 LH(카탈로그 번호 EIA-2385 ) 제조업체의 프로토콜에 따라. 광학 밀도(OD)는 Model 680 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정하였고, 테스토스테론과 LH의 수준은 표준 곡선에 기초하여 결정하였다.

면역조직화학. 고환 조직을 실온에서 4% 포름알데히드에 24시간 동안 고정하고 파라핀에 포매하였다. 파라핀 절편은 5μm 절편으로 절단된 후 탈랍되었습니다. 항원 검색은 섹션을 0.095‑98˚C에서 5분 동안 1M 시트레이트 완충액(pH=6.{31}})에서 배양하여 달성했습니다. 섹션은 이후 실온에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany; A3675)으로 차단되었습니다. 차단 후 섹션을 LHR(카탈로그 번호 L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) 또는 P450 측쇄 절단(P450scc; 카탈로그 번호 ab75497; Abcam, Cambridge, UK)에 대한 토끼 다클론 항체와 함께 배양했습니다. ; 1:200) 4˚C에서 밤새 어둠 속에서. 제조업체의 프로토콜에 따라 SABC 키트(SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 스트렙타비딘-비오틴 복합체(SABC) 방법을 사용하여 LHR 및 P450scc의 발현을 검출했습니다. 음성 대조군 마우스로부터 분리된 조직의 경우, 1차 항체를 PBS로 교체하였다. 막 또는 혈장에 노란색 또는 갈색으로 염색된 Leydig 세포는 LHR 양성 세포로 간주되었습니다. 각 샘플에서 5개의 슬라이드를 얻었고 Leydig 조직 영역의 5개 필드를 무작위로 선택하고 형광 현미경(배율, x400)으로 평가했습니다. Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)를 사용하여 Leydig 조직 영역에서 양성 세포의 평균 OD를 얻었습니다. LHR 및 P450scc의 발현은 OD 값에 비례하였으며, OD 값이 높을수록 단백질 발현이 높음을 나타냅니다.

말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 매개 dUTP 닉엔드 라벨링(TUNEL) 분석. 쥐의 고환을 해부하고 왁스에 묻힌 후 절단했습니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 TUNEL 분석 키트(MK1024; Boster Biological Technology)를 사용하여 섹션({0}}μm 두께)을 염색했습니다. 간단히 말해서, 대조군(정상 식염수), DMSO, CsA, CC, WSSJD 및 새로운 WSSJD 그룹의 고환 조직을 37˚C에서 30분 동안 비오틴 표지 디곡신 항체의 1:100 희석액을 사용하여 염색했습니다. 염색된 쥐의 간질 상피 조직(키트에 제공)을 양성 대조군으로 사용하였고, 비오틴 표지 디곡신 항체 대신 PBS로 배양한 시료를 음성 대조군으로 사용하였다. 녹색 핵 염색을 나타내는 TUNEL 양성 세포의 빈도는 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 평가되었습니다. 총 10개의 무작위 필드를 고배율(x400)로 평가하고 양성 세포를 계수했습니다. 필드당 평균 양성 세포 수를 계산했습니다.

Propidium iodide(PI) 또는 Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC) 염색 및 유세포 분석. 미상 부고환을 다음 희생으로 수확하고 블레이드로 표피를 절단하여 부고환에서 정자를 37˚C에서 2 ml PBS로 방출하여 부고환 현탁액을 얻었다. 현탁액을 이후 37˚C에서 10분 동안 배양하여 정자가 헤엄칠 수 있도록 하였다. 정자의 응집체를 버리고 나머지 정자 샘플을 분리하고 PBS에 재현탁하여 106개 세포/ml의 농도를 제공하였다. 정자 세포 사멸은 제조사의 프로토콜에 따라 Annexin V-FITC Apoptosis Detection 키트 (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China)를 사용하여 분석되었습니다. 간단히 말해서, 정자 현탁액 1ml를 실온에서 10분 동안 암실에서 10μl PI 또는 500μl 결합 완충액 및 5μl Annexin V-FITC로 염색했습니다. 세포는 즉시 Epics XL 유세포분석기(Beckman Coulter, Inc.) 및 TetraONE™ 시스템(6915050; Beckman Coulter, Inc.)을 사용하여 분석되었습니다. 아폽토시스 초기 단계의 세포는 Annexin V-양성 염색으로 확인하고 괴사 세포는 PI-양성 염색으로 확인했습니다.

통계 분석. 데이터 분석은 SPSS 13.{1}} 소프트웨어(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었으며 표시된 대로 평균 플러스 또는 ± 표준 편차로 표시됩니다. 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석을 사용한 후 Tukey의 사후 검정을 사용하여 유의성을 평가했습니다. 피<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

시스탄체 데저티콜라

결과

고환 정세관의 발달에 대한 새로운 WSSJD의 효과. 새로운 WSSJD가 마우스 고환 정세관의 발달에 미치는 잠재적인 보호 효과를 조사하기 위해 H&E 염색된 마우스 고환의 형태를 광학 현미경으로 비교했습니다. CsA 및 CC 그룹 마우스의 정세관은 대조군과 비교하여 세뇨관 프린지의 수축, 감소된 세관 직경 및 고환 정세관 상피층 감소를 나타냈다. 또한 정자 생성 세포는 무질서한 배열을 보였고 정자 ​​생성 세포의 수는 감소했으며 내강에는 성숙한 정자가 거의 보이지 않았습니다 (그림 1). DMSO, WSSJD 및 새로운 WSSJD 그룹의 마우스에서 더 많은 층이 고환 정소 상피층을 볼 수 있었고 정세관 프린지가 수축 또는 붕괴 없이 통합되었습니다(그림 1). Johnsen 점수는 DMSO 그룹과 대조군, 또는 CC와 DMSO 그룹 간에 유의한 차이가 없었습니다. 그러나 Johnsen 점수는 대조군에 비해 CsA군과 WSSJD군에서 유의하게 감소하였고, WSSJD와 새로운 WSSJD군의 점수는 CC 또는 CsA군에 비해 유의하게 증가하였다(P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">

혈청 테스토스테론과 LH에 대한 새로운 WSSJD의 효과. 혈청 내 테스토스테론과 LH의 수준은 이후에 측정되었습니다. 테스토스테론과 LH의 혈청 수준은 DMSO 투여 후 영향을 받지 않았습니다. 대조적으로, 혈청 테스토스테론은 대조군에 비해 유의하게 하향조절되었고 LH는 CsA 처리된 마우스에서 유의하게 상향조절되었다(P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">

새로운 WSSJD가 LHR과 P450scc의 표현에 미치는 영향. P450scc 및 LHR의 발현은 고환 Leydig 세포에서 면역조직화학에 의해 평가되었다(도 3 및 4). 대조군에서는 LHR이 정세관 사이의 Leydig 세포 외막에서 발현되었고(Fig. 3A), P450cc는 고환 Leydig 세포의 세포질에서 발현되었다(Fig. 4A). DMSO 처리는 LHR과 P450scc의 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, CsA 처리는 대조군 마우스에 비해 LHR 및 P450scc의 발현을 유의하게 감소시켰다(P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">

정자 생성 세포 사멸에 대한 새로운 WSSJD의 효과. 마우스 고환에서 정자 생성 세포의 세포 사멸은 TUNEL 분석에 의해 분석되었습니다. 세포사멸 세포의 핵은 주로 정자세포와 일차 정자세포에서 관찰되었다(Fig. 5A). 정자 세포는 정자 세포보다 크며 기저막에 더 가깝습니다(23). DMSO 처리는 고환의 세포자멸사 정자형성 세포의 수에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. 대조적으로, CsA 처리는 대조군 및 DMSO 그룹과 비교하여 세포자멸사 정자형성 세포의 수를 유의하게 증가시켰다(P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">

정자의 생존과 조기 세포사멸에 대한 새로운 WSSJD의 효과. 새로운 WSSJD가 CsA에 의해 유도된 정자 세포자멸사에 대한 보호 효과를 확인하기 위해 부고환에서 정자의 생존 및 조기 세포자멸사를 결정했습니다. 부고환 정자를 PI 또는 Annexin V로 염색하고 유세포 분석법으로 분석했습니다(그림 6 및 7). 앞서 언급한 결과에 따라 CsA 처리는 살아있는 정자의 비율을 유의하게 감소시켰고 초기 세포자멸사 정자의 비율을 유의하게 증가시켰습니다(P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">

논의

면역억제제로 CsA를 장기간 사용하면 생식 능력에 영향을 미친다는 것이 이전에 문서화되었습니다(6). Xu(24)는 다양한 용량의 CsA로 치료받은 26명의 신장 이식 환자와 12명의 건강한 지원자의 정액 샘플에서 관찰된 바와 같이 CsA로 치료받은 환자의 정자의 형태와 활력이 치료받지 않은 그룹보다 현저히 낮았다고 보고했습니다. 또한 정자의 머리 기형 비율이 CsA 치료를 받은 사람들에서 유의하게 더 높은 것으로 관찰되었습니다(24). 이러한 결과는 CsA가 정액 매개변수에 용량 의존적 영향을 미친다는 것을 시사했습니다. 따라서 CsA로 인한 고환 손상을 완화하고 장기 이식 후 남성의 생식 능력을 향상시킬 수 있는 새로운 약리학적 제제를 확인하기 위한 연구가 필요합니다.

고환의 특정 미세 환경은 정자 생성을 촉진하므로 고환 구조와 기능의 손상은 정자 생성 정지로 이어질 수 있습니다(25). Monteiro 등(26)은 Wistar 쥐에게 56일 동안 1일 15 mg/kg의 용량으로 CsA를 처리한 결과 CsA 처리 쥐에서 결합 조직의 부피 비율이 증가하고 Leydig 세포의 부피 비율이 감소하는 것을 관찰했습니다. 또한 CsA는 정소 상피 변성을 유발하여 Sertoli 세포 공포화, 비정상적 원형 및 길쭉한 정자, 내강에 인접한 상피 경계에 잔류 세포질 축적을 유발하는 것으로 관찰되었습니다(26). 현재 연구에서 Kunming 마우스는 30일 동안 매일 15mg/kg CsA를 처리했는데, 이는 정세관의 수축 및 직경 감소, 정소 상피층의 감소, 정자 세포의 무질서한 배열, 성숙 세포의 감소로 이어졌습니다. 내강에 정자가 있고 Johnsen 점수가 크게 감소했습니다.

또한 CsA 처리로 고환 구조가 심하게 손상되었습니다. 본 연구는 또한 새로운 한약으로서 새로운 WSSJD가 CsA 처리된 마우스의 고환에 대한 보호 효과를 평가했습니다. 새로운 WSSJD로 치료한 후 고환의 정유상피층과 정세포의 배열이 회복되었음을 관찰하였다. 또한, 새로운 WSSJD 그룹의 마우스는 수축 또는 붕괴 없이 통합된 세뇨관을 나타내었고 CsA 처리 마우스와 비교하여 훨씬 더 높은 Johnsen 점수를 보였습니다. 이러한 결과는 WSSJD가 CsA로 인한 고환 손상을 유의하게 복구했음을 시사하며, 이 한약 화합물이 CsA로 인한 고환 손상 예방에 효과적인 치료제가 될 수 있음을 나타냅니다. 이 세포 복구가 상피 내의 틈새에 의존하는지 여부도 중요한 질문이며, 이는 향후 연구에서 조사되어야 합니다.

시상하부-뇌하수체-고환 축은 생식기 활동 조절에 중요한 역할을 합니다(27). 남성 생식기의 발달과 기능은 시상하부와 뇌하수체의 호르몬에 의해 조절됩니다(28). Krueger 등(29)은 Sprague Dawley 쥐에게 6일 동안 25mg/kg/day CsA 또는 40mg/kg/day CsA를 처리한 결과 LH와 FSH의 혈청 수준이 2-4배 증가하는 반면 P450scc 발현은 대조군의 30%로 감소했습니다. 또한, 혈청 테스토스테론 수준은 CsA 처리된 마우스에서 유의하게 감소하여 정자 형성 장애를 초래했습니다(29). 본 연구에서는 CsA 처리가 Leydig 세포에서 LHR의 발현을 유의하게 감소시키는 것으로 입증되었다. 혈청 LH가 증가했지만 LHR의 발현 감소는 테스토스테론 생합성의 LH 매개 회복을 손상시키고 테스토스테론 생합성의 속도 제한 효소인 P450scc의 발현을 감소시켜(30), 따라서 Leydig 세포에 의한 테스토스테론 생합성에 영향을 미칠 수 있습니다. 녹용과 같은 새로운 WSSJD의 새로운 성분은 성 호르몬과 유사한 효과를 나타내며(12), 이는 혈청 테스토스테론 수준을 개선하고 혈청 LH 수준을 감소시켜 Leydig 세포에서 LHR 및 p450scc 발현을 증가시킬 수 있습니다. 특히, 현재 결과는 새로운 WSSJD가 Leydig 세포에서 테스토스테론 생합성 및 분비를 자극하여 정자 생성을 촉진함을 나타냅니다.

CSA 유발 산화 스트레스 및 고환 손상은 정자 및 정자 형성 세포의 형성 장애를 유발합니다 (31). 장기간 CsA 치료는 동물의 고환 조직에서 항산화 시스템을 손상시켜 글루타티온, 글루타티온 퍼옥시다제 및 과산화수소 수준을 감소시키고 고환에서 말론 디알데하이드 수준을 증가시키는 것으로 보고되었습니다(31). 따라서 고환 조직에서 과도한 수준의 활성 산소 종을 제거할 수 없어 정자막 지질의 과산화, DNA 손상 및 정자 활력 감소를 초래합니다. 본 연구에서 CsA 처리는 정세관에서 DNA 파손과 정자 생성 세포의 세포 사멸 속도를 유의하게 증가시키는 것으로 관찰되었습니다. 부고환에서 정자의 생존율도 감소한 반면, 초기 세포사멸 정자의 비율은 증가하여 고환의 정자 생성 활성이 크게 손상되었음을 나타냅니다. Türk et al(32)은 CsA로 인한 고환 손상에 대한 엘라그산의 보호 효과가 수컷 쥐의 산화 스트레스와 관련이 있다고 문서화했습니다. 현재 연구에 사용된 새로운 WSSJD는 고환에서 과산화물 수준을 현저히 감소시키는 것으로 이전에 입증된 한약인 인삼을 포함하여 다양한 항산화 성분을 함유하고 있습니다(14).

본 연구에서는 새로운 WSSJD가 CsA에 의해 유발된 테스토스테론 합성 장애 및 정자형성 세포자멸사에 미치는 영향을 조사한 결과, 새로운 WSSJD가 정자형성 세포와 정자의 세포자멸사율을 유의하게 감소시켜 고환 정자의 손상을 복구하는 것으로 관찰되었습니다. 상피. 고환 정세관의 형태와 정자 형성 세포 및 정자의 세포 사멸을 조직 화학 및 유세포 분석을 사용하여 조사했습니다. 세포주기 분포와 일일 정자 생산은 조사되지 않았지만 우리 그룹의 향후 연구의 초점이 될 것입니다.

WSSJD는 고환에서 테스토스테론 수치를 크게 증가시키고 정자 세포와 정자의 세포 사멸을 감소시켜 CsA로 인한 고환 손상을 효과적으로 복구했습니다. 이러한 결과는 새로운 WSSJD가 CsA 유발 고환 손상의 치료 및 예방에 유용한 약리학적 제제가 될 수 있음을 나타냅니다.

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