Lentinula Edodes 및 Pleurotus Ostreatus 식용 버섯의 수성 추출물의 단백질체 분석 및 시험관 내 항바이러스, 항암 및 항산화 능력

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추상적인: 본 연구에서는 식용버섯인 Pleurotus ostreatus(굴버섯)와 Lentinula edodes(표고버섯)의 물 추출물을 조사하였다. Proteome 분석은 LC-Triple TOF-MS를 이용하여 수행하였으며, Pleurotus ostreatus에 의한 753개 단백질과 Lentinula edodes에 의한 432개 단백질의 발현을 나타내었다. 생리활성 펩타이드: Rab GDP 해리 억제제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 티오레독신 환원효소, 세린 프로테이나제 및 렉틴이 두 버섯에서 모두 확인되었습니다. 추출물은 또한 페놀,플라보노이드, 비타민 및 아미노산. 추출물은 유망한 것으로 나타났습니다항바이러스 활동, 아데노바이러스(Ad7)에 대한 Pleurotus ostreatus의 선택성 지수(SI)가 4.5이고 단순 포진-II(HSV{4}})에 대한 Lentinula edodes의 활성이 약간 있습니다. 추출물은 정상적인 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 대해 세포독성을 나타내지 않았습니다. 이에 반해 다양한 암세포주에 대해 중간 정도의 세포독성을 보였다. 또한 DPPH를 사용하여 항산화 활성을 평가했습니다.라디칼 소거, ABTS 라디칼 양이온 소거 및 ORAC 분석. 두 추출물은 잠재력을 보여주었다항산화 활성, Pleurotus ostreatus에 대한 최대 활성(IC50 ug/mL)=39 DPPH의 경우 .46 ± 1.27, ABTS의 경우 11.22±1.81; 및 ORAC 분석의 경우 21.40±2.20. 이 연구는 항바이러스, 항종양 및 항산화 능력에 비해 정상 PBMC에 대한 세포독성이 낮다는 점에서 이러한 버섯의 의학 사용을 권장합니다.

키워드: 백부병균; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; 표고버섯; 항산화제; 항종양; 항바이러스제

1. 소개

버섯은 의약 및 기능식품 생산에서 큰 전망을 가지고 있습니다. 많은 버섯은 좋은 관능적 특성과 높은 영양가 외에도 수많은 약리학적 활성이 있는 것으로 보고되었습니다[{0}}]. 가장 널리 재배되는 버섯으로는 Lentinula edodes(표고버섯)와 Pleurotus ostreatus(굴 버섯)가 있습니다. 표고버섯은 전 세계적으로 가장 많이 소비되는 식용 버섯으로 Agaricus bisporus에 이어 두 번째입니다[4]. 이 버섯은 항균, 항진균, 항바이러스, 간 보호, 항고혈당 및 면역 조절 효과가 있습니다[5-7]. 생리 활성 분자가 풍부하며, 가장 많이 연구된 것은 박테리아, 바이러스 및 종양에 대한 효과가 있는 다당류인 "렌티난"과 이상지질혈증 및 고혈당증을 조절하는 데 도움이 되는 "렌티난"입니다[8]. 굴 버섯으로도 알려진 Pleurotus[9] 속의 가장 흔한 종인 Pleurotus ostreatus는 목재 분해자이며 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있습니다[10]. 다른 치료용 버섯과 비교하여 굴 버섯은 건강 증진제로 점점 더 대중화되고 있습니다[11]. 굴 버섯에는 렉틴, 다당류, 비타민 및 미네랄과 같은 많은 영양 성분이 존재하여 잠재적인 항암 물질을 보유할 수 있으며,항산화제, 항당뇨병, 항균 및 항고콜레스테롤혈증 특성 [12,13]. 굴, 표고버섯은 다른 식용버섯에 비해 생육기간이 짧고 14년 내내 수확이 가능합니다. 재배 및 시험이 용이하고 영양가가 높고 약효가 우수하여 잠재성이 매우 높습니다. 식품 및 제약 산업 [4,15]. 실제로, 더 높은 담자균류는 유망한 다기능 식품 공급원이 될 수 있습니다.

당, 생리학적 활성 단백질, 불포화 지방산, 페놀(페놀산 및 폴리페놀), 플라보노이드, 테르페노이드, 당단백질, 폴리케타이드, 스테로이드 및 알칼로이드를 포함한 많은 생리활성 화합물이 이 두 버섯에서 발견되었습니다[16,17]. 이들 화합물은 단독으로 또는 상승적으로 작용하여 이들 진균의 광범위한 약리학적 작용을 야기한다. 표고버섯과 느타리버섯은 항균, 항바이러스, 항고혈압, 면역조절, 항산화 활성이 있는 것으로 보고되고 있다[1,18,19]. Seo et al. [20]은 버섯 생체 분자의 항바이러스 활성 메커니즘을 요약하여 바이러스 감염의 감소가 주로 바이러스가 숙주 세포로의 흡수, 복제, 단백질 및 효소 합성을 자극하는 것 외에도 숙주 면역 반응 [21]. 산화 방지제는 많은 건강 문제의 이면에 있는 활성 산소 종에 직면하여 중요한 분자입니다. 합성 항산화제 사용에 대한 많은 적신호가 제기되면서 천연 항산화제에 대한 연구가 의무화되었습니다[22]. 이러한 버섯류 제품의 항종양 효과는 글루칸, 에르고스테롤, 프로테오글리칸 및 아미노산(아르기닌 및 글루타민)을 포함한 생체 분자와 관련이 있습니다[23]. 이 효과의 기저에 있는 가정된 메커니즘은 암세포에 대한 면역 반응을 유발하는 것 외에도 T-림프구의 자극, 신생혈관 생성의 억제, 암세포 사멸의 유도를 포함할 수 있습니다[24,25].

Proteomics는 생물 연구, 특히 농업 연구에서 귀중한 도구 중 하나로 입증되었습니다[26]. Lindequist et al. 식용 버섯 연구에서 proteomics를 사용하는 것의 중요성에 대해 조명한 첫 번째 그룹이었습니다. 그들은 곰팡이 생리활성 분자 연구를 위해 "omics"를 사용할 필요성을 강조했습니다. Proteomics는 병원성 진균에 대한 식용 버섯 연구에서 거의 사용되지 않았습니다[28]. 따라서 본 연구의 목적은 두 가지 식용 버섯인 Pleurotus ostreatus와 Lentinula edodes의 proteome을 분석하고 이들의 잠재성을 조사하는 것이다.항바이러스제, 항종양 및 항산화 활성.

2. 결과

2.1.Proteom1e 분석

Proteome 분석은 LC-Triple TOF-MS 분석을 사용하여 FDR(false discovery rate)을 사용하여 수행했습니다.<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. 총 생리활성 화합물 총 함량

총 함량을 평가할 때 여기에는 총 탄수화물, 단백질, 페놀, 플라보노이드의 평가가 포함됩니다. P. ostreatus 추출물은 L.edodes 추출물에 존재하는 탄수화물 수의 거의 세 배와 단백질 수의 두 배를 함유했습니다. 그럼에도 불구하고 P. ostreatus 추출물보다 L.edodes 추출물에서 더 많은 플라보노이드가 검출되었습니다(표 1).

2.3. 페놀 및 플라보노이드 분자

두 버섯 추출물 모두 카테킨을 함유했습니다(26.48분의 체류 시간에서 검출됨). P.ostreatus는 kaempferol과 apigenin(각각 체류 시간 59.13분 및 59.56분에서 검출됨)을 추가로 포함하는 반면 L.edodes는 퀘르세틴도 포함했습니다(체류 시간=56.86분, 표 2, 그림 에스1).

2.4.비타민

수용성 및 지용성 비타민 함량은 HPLC를 통해 결정되었습니다(표 3 및 그림 S2 및 S3). 두 버섯 모두 비타민 C가 풍부하고 비타민 B3, B6, D가 검출 가능합니다. 두 버섯 모두 보유하고 있는 비타민의 양에는 큰 차이가 없었습니다. 한편, 비타민 B1, B2, B9, A, E는 두 버섯 모두에서 검출되지 않았다.

2.5. 아미노산 분석

아미노산 분석에는 Sykam 아미노산 분석기를 사용했습니다. 총 아미노산 함량은 표 4와 같이 P.ostreatus와 L.edodes가 각각 5.14, 4.35였으며 두 버섯에는 glutamic acid가 풍부하였다. 프롤린은 P. ostreatus 추출물에서 상당한 농도(0.57g/100g 단백질)로 검출되었지만 L.edodes 추출물에서는 검출되지 않았습니다. 히스티딘과 아스파라긴산은 두 버섯 모두에서 검출되지 않았습니다.

2.6. 생물학적 활동

2.6.1.항바이러스 활성

항바이러스 활성은 아데노바이러스와 단순포진-II의 두 가지 바이러스에 대해 평가되었습니다. 표 5에 나타난 바와 같이, P.ostreatus 추출물은 4.5의 높은 선택도 지수로 아데노바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 활성을 나타냈다. 헤르페스 심플렉스-II에 대한 P. ostreatus 추출물과 두 바이러스 모두에 대한 L.edodes 추출물에 대해 유망한 항바이러스 효과가 기록되었습니다. 그림 S4와 S5는 용량-반응 곡선을 나타냅니다.

2.6.2. 정상 인간 PBMC에 대한 세포독성 활성

정상 인간 PBMC에 대해 최소 세포독성(IC50 ug/mL; 66.41±3.7 및 82.81±2.72, 각각 P.ostreatus 및 L. edodes)이 기록되었습니다.

암 세포주에 대항

전립선암(DU{0}} 및 PC3); 간세포 암종(HepG2); 결장직장암(Colo-205); 맹장 암종(LS-513); 자궁경부암(HeLa); 및 유방 선암종(MDA-MB-231 및 MCF-7). 독소루비신은 양성 대조군으로 사용되었습니다(생존율을 HepG2에서 53%로 감소시켰습니다. -7:LS-513에서 25%, HeLa에서 23%, Colo-205 셀에서 19%). 그림 2의 결과는 Ledodes 및 P. ostreatus 추출물이 LS{25}}, HepG2, DU{27}} 및 PC{28}}의 테스트된 암 세포주의 생존력을 약 20만큼 감소시켰음을 보여줍니다. 퍼센트 .

백혈병 및 림프종 세포주에 대항

P.ostreatus와 L.edodes의 버섯 추출물은 백혈병(CCR-CEM, NB{1}}, THP{2}}) 및 림프종(U937) 세포에 대한 세포 독성을 테스트했습니다. 독소루비신은 양성 표준으로 U937, NB4, CCRF-CEM 및 THIP1 세포에서 세포 생존율을 각각 29%, 25.5%, 20.3% 및 19.1%로 감소시켰습니다. L.edodes 추출물은 THP1 세포의 생존율을 66.02%로 감소시킨 반면, P.ostreatus 추출물은 CCRF-CEM 세포의 생존율을 70.64%로 감소시켰습니다(그림 3).

2.6.3. 항산화 활성

항산화 효과의 결과는 3가지 평가 방법, 즉 DPPH로 연구되었습니다.라디칼 소거, ABTS 라디칼 양이온 제거 및 ORAC 분석은 항산화 표준인 Trolox와 비교하여 표 6 및 그림 S6a,b에 나와 있습니다. 결과는 사용된 3가지 항산화 분석에서 알 수 있듯이 P. ostreatus 추출물이 L.edodes 추출물보다 더 강력한 항산화 능력을 가지고 있음을 보여줍니다. 그림 4는 ORAC 분석에서 추출물에 의해 유도된 플루오레세인 신호 감쇠를 보여줍니다.

3. 토론

흰썩음병균은 면역계 조절, 혈당강하 및 항혈전 활성, 항고혈압, 항염, 항균 및 항종양 특성과 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 능력을 포함하는 약학적 특성으로 인해 과학계의 관심을 불러일으켰습니다. 24,36-38]. 두 개의 흰부패균인 P. ostreatus와 L.edodes는 많은 국가에서 가장 많이 소비되는 식용 버섯입니다[39]. 이 두 버섯은 다수의 생리활성 단백질을 생산하며, 현재 프로테옴 분석은 단백질 프로파일링에 가장 효과적인 도구입니다[40]. 현재 연구에서 proteome 분석은 두 시험 버섯에서 Rab GDP 해리 억제제, thioredoxin reductase, serine proteinase, superoxide dismutase 및 lectin을 포함한 생리 활성 단백질의 발현을 보여주었습니다. Rab GDP 해리 억제제(Rab GDI)는 종양 세포에서 막 인신매매에서 중추적인 역할을 하는 Rab GTPase의 기능을 조절합니다. 따라서 Rab GDI를 사용하는 것은 유망한 항암 전략이다[29].

세린 프로테나아제는항바이러스제식용 버섯의 활성 [30,31]. 또한, Yap et al. (2018)은 인간 유방 선암종 세포주(MCF7)에 직면하여 세린 프로테이나제의 강력한 선택적 세포독성을 보고했으며 이 메커니즘이 카스파제의 자극 외에도 외인성 및 내인성 세포 사멸 메커니즘의 협력 효과를 포함한다고 제안했습니다.{{ 4}} 및-9 및 Bcl-2 억제 [41].

의 섭취항산화제활성산소종(ROS) 매개 병태생리학에 대한 상서로운 예방 전략이다[22]. 우리의 결과는 Pleurotus ostreatus와 Lentinula edodes에 의한 항산화 방어 시스템의 효소 발현을 보여줍니다. 이러한 효소에는 ROS 생성을 상쇄시키는 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제가 포함됩니다[32]. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제는 슈퍼옥사이드를 과산화수소로 변환하는 것으로 시작하며, 이는 카탈라아제와 글루타티온 퍼옥시다제에 의해 물로 변환됩니다[33].

2개의 버섯에서도 렉틴의 발현이 검출되었다. 많은 연구자들은 항염증제, 항우울제, 항피임제 및 혈관 확장 활성을 포함하는 광범위한 활성을 갖는 렉틴의 놀랍도록 다양한 생물학적 프로파일을 보고했습니다[34,35,42]. 렉틴은 종양 세포막 또는 그 수용체에 대한 선택적 결합을 통한 시험관내 및 생체내 종양 성장 억제를 비롯한 다양한 세포 기능을 갖는 탄수화물 결합 단백질로, 결과적으로 단백질 키나제의 활성화 또는 인터루킨 생산을 통한 면역 반응의 조절을 초래합니다. [43]. 또한 버섯 렉틴은 세포 사멸, 괴사 및/또는 자가포식을 비롯한 다양한 세포 사멸 경로를 유발하는 역할을 합니다[42].

우리의 데이터는 Pleurotus ostreatus에서 osteolysis와 pleurotolysin의 발현을 보여줍니다. 이들은 고도로 선택적인 항암 활성을 갖는 기공 형성 단백질이다[44,45]. 오스트레오리신은 15kDa 세포용해성 단백질로, 마이크로몰 이하 농도에서 적혈구 및 기타 세포를 투과시킬 수 있습니다. 그것은 콜로이드 삼투 메커니즘을 통해 작용하고 넓은 막 기공의 형성을 유도합니다 |46,47I. Nimri et al. 인간 및 마우스 결장 종양 세포에 대해 강력한 항종양 활성을 갖는 재조합 플루로톨리신을 생산했습니다[48].

L.edodes에서는 valosin 함유 단백질과 래치핀이 발현되었다. Valosin 함유 단백질은 이전에항산화제알츠하이머병, 측삭 경화증 및 치매와 같은 신경 증후군에 도움이 될 수 있는 속성 [49-51]. Latcripin은 잠재적인 항암제입니다[50]. Riaz Ud Din et al.(2020)은 유방암 세포주에 대한 래치 핀의 항암 메커니즘을 조사했습니다. 그들은 이동 및 침입에 대한 억제 효과 외에도 세포 사멸 및 자가 포식을 유도하는 능력을 보고했습니다[52].

다양한 생리활성 화합물이 P.ostreatus 및 L.edodes 추출물에서 정량화되었습니다. 현재 연구에서 P.ostreatus 및 L.edodes에 대해 각각 19.37 ± 0.39 및 24.14 ± 1.{12}}1 mg/g 추출물의 TPN이 검출되었습니다. 이 값은 6.67mg/g 추출물로 P. ostreatus의 총 플라보노이드 함량을 정량화하기 위해 암모늄 및 Shinoda 테스트를 사용한 Rahimah et al.이 기록한 값보다 높습니다[53]. 또한 우리의 결과는 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 L edodes 추출물의 TPC를 분석하고 0.{13}}.5% 건조 중량(DW)을 발견한 Montibus 등이 발견한 것보다 높습니다. 대문자 및 0.{16}}줄무늬의 0.1% dw[54].

카테킨은 P. ostreatus와 L.edodes 추출물에서 모두 검출되었습니다. 카테킨은 강력한 자유 라디칼 소거 특성을 가진 식물 2차 페놀 대사 산물입니다[55]. L.edodes 추출물은 플라보노이드 케르세틴을 함유하는 것으로 밝혀졌습니다. 케르세틴의 항산화 효과는 글루타티온 수치의 조절과 글루타티온 전이효소 및 알도케토 환원효소를 포함한 항산화 효소 생산의 증가를 통해 매개됩니다[56]. 또한 케르세틴은 세포주기를 방해하고 세포사멸을 촉진하여 항종양 활성을 갖는 것으로 보고되고 있다[57,58]. Leeet al. 케르세틴은 PC3, Du145 및 U937 암 세포주에서 세포 정지를 유발한다고 보고했습니다[59]. 우리의 결과는 또한 kaempferol과 apigenin이 P.ostreatus에서 발견되었음을 보여줍니다. Kaempferol과 apigenin은 항산화 및 항증식 활성이 있는 것으로 입증되었습니다[{10}}]. 글루탐산은 두 버섯 추출물 모두에서 가장 풍부한 아미노산으로 밝혀졌습니다. 같은 맥락에서 Chirinang 등은 P. ostreatus와 P. major-caju의 아미노산 함량을 분석한 결과 glutamic acid 함량이 가장 높았고 aspartic acid, arginine 순이었다[63].

P.ostreatus 및 L. edodes는 아데노바이러스 및 단순 포진 바이러스-II에 대해 유망한 항바이러스 활성을 나타내었고, 아데노바이러스에 대한 P. ostreatus 추출물의 경우 SI가 4.5에 도달했습니다. SI는 세포독성과 항바이러스 활성 사이의 창을 추정하므로 추출물의 효능과 안전성을 평가하는 데 사용되었습니다. SI가 높을수록 화합물이 더 안전하고 효율적입니다[64,65]. 관련 데이터는 최근 Urbancikova et al.에 의해 나타났으며, 여기에서 pleuran(P. ostreatus에서 분리된 불용성 -1,3/1,6-D-glucan) 기반 보충제가 단순 포진 바이러스의 기간을 상당히 단축시켰습니다. -I 증상은 호흡기 증상의 중증도가 낮고 위약군에 비해 심각한 부작용 없이 단순 포진 바이러스 I 양성 환자에서 급성 단순 포진 바이러스 치료에 흉막 사용 가능성을 제시합니다[66].

버섯의 항바이러스 효과는 주로 바이러스 흡수, 복제, 효소 활성 및 기능 펩타이드를 방해하고 숙주 면역 체계를 강화하기 때문입니다[67]. Seo and Choi(2021)는 P.ostreatus와 L.edodes의 다당류 분획에 있는 -glucan이 치료 전, 후 효과를 통해 항헤르페스 효과를 나타낼 수 있다고 제안했다[20]. P. ostreatus 및 L.edodes의 수성 추출물의 항 HIV 효과는 각각 유비퀴틴 유사 단백질 및 렙틴에 의한 역전사 효소 억제에 의해 유발될 수 있다[68,69].

버섯의 수성 추출물은 테스트한 암세포주의 생존력을 약 20% 억제하는 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 백혈병 및 림프종 세포주에 대해 유사한 효과를 보았습니다. THP1 백혈병 세포에 대한 L.edodes 추출물의 경우 생존율이 66%로 감소하고 CCRF-CEM 백혈병 세포에 대한 P.ostreatus 추출물의 경우 70.6%로 감소했습니다. L.edodes의 수성 균사체 및 자실체 추출물은 MCF{7}} 유방암 세포[70]에 항증식 및 세포자멸사 작용을 나타내는 것으로 이전에 보고되었습니다. L.edodes의 에틸 아세테이트 분획과 -glucan이 이러한 작용의 대부분을 담당했습니다[71,72]. 같은 맥락에서 P. ostreatus 추출물은 MCF{13}} 및 MDA-MB{15}} 유방 선암종 세포[73] 및 6-연결된 글루칸에 대해 항증식 활성을 나타낼 수 있었습니다. 추출물의 유방암 및 폐암 세포에 대한 자연 살해 세포 독성을 강화했습니다 [74]. 최근 Jakopovic et al. L.edodes 및 P. ostreatus를 포함한 6개 및 10개의 버섯으로 구성된 약용 버섯 제제가 대장(HCT{23}}, SW620) 종양 세포주에 상당한 항증식 및 세포자멸사 효과를 나타냄을 발견했습니다[75]. 반대로, 저자는 인간 섬유아세포주(WI{26}})에 대한 효과가 증식하여 종양 세포주에 대한 이러한 버섯 제제의 특이성을 보여줍니다. 유사하게, 우리는 정상적인 인간 PBMC에 대해 버섯에 의해 배설되는 최소 세포독성을 검출했습니다. 이 발견은 또한 우리 버섯의 안전한 사용을 시사합니다.

버섯의 세포독성은 x- 및 -글루칸, 단백질, 당단백질, 지방산, 뉴클레오시드 길항제, 테르페노이드 및 페놀 화합물을 포함한 광범위한 분자에 기인합니다[76]. Abdellaet al. (2012)는 버섯 추출물이 아로마타제 활성을 억제하여 유방암 세포 증식을 억제한다고 제안했습니다[77]. Imam et al. (2021)은 폐 선암종 세포의 분열을 억제하는 인돌{6}}젖산을 Ledodes에서 분리했습니다[78]. Yukawa et al. (2012)는 HepG2 세포에 대한 L edodes 균사체의 직접적인 세포자멸사 효과가 카스파제{10}} 및 -8사멸 수용체 경로의 활성화를 통한 것이라고 제안했습니다[79]. Wu et al.(2011)은 인간 결장직장 선암종(SW480) 세포와 인간 단핵구 백혈병 THP{15}}(세포)에 대한 P. ostreatus 단백질 추출물의 세포독성 효과를 연구하고 ROS 생성, 탈진을 보고했습니다. 글루타티온의 변화, 미토콘드리아 막 전위의 변화 및 올리고뉴클레오솜 DNA의 분해, SW480 세포의 세포자멸사를 초래한다[80].

항산화제는 단일 기전으로 작용하지 않기 때문에 항산화능의 평가는 일반적으로 여러 가지 방법으로 수행된다[81]. 이 연구에서는 DPPH, ABTS 및 ORAC 분석의 세 가지 평가 방법을 사용했습니다. SET(단일 전자 전달) 항산화 메커니즘은 DPPH 분석을 통해 평가되었으며, ABTS 및 ORAC 분석은 HAT(수소 원자 전달) 반응에 사용되었습니다[81]. ORAC 분석은 억제 시간과 억제 정도를 단일 용어로 결합하므로 보다 정확한 추정치를 제공합니다[82]. 포스포몰리브데이트 분석은 일반적으로 총 항산화능(TAC)을 표현하는 데 사용되지만 세 가지 방법 모두 사용

이 원고에서 TAC를 평가하는 것으로 보고되었습니다. Munteanu와 Apetrei(2021)는 항산화 활성을 결정하는 데 사용된 방법에 대한 검토에서 ABTS 라디칼 소거 분석을 "총 항산화 능력(TAC)을 측정하는 데 사용되는 간단하고 편리한 방법"[83]으로 설명했습니다. 비교 연구에서 Csepregi et al. (2016) TAC 평가에 사용된 4가지 방법인 Trolox 등가 항산화능(TEAC), 철환원 항산화능(FRAP), 2,{4}}디페닐{5}}피크릴히드라질(DPPH) 비교 라디칼 소거 분석 및 FCR(Folin-Ciocalteu 시약 반응성)[84]. 2013년 Ou et al.은 TAC 평가를 위한 새로운 방법으로 ORAC를 도입했습니다[85]. 같은 맥락에서 Rubio et al.(2016) )는 ORAC 분석을 TEAC[{11}}]와 함께 TAC 결정을 위한 직접적인 방법 중 하나로 분류했습니다. ABTS 및 ORAC 분석 결과는 P. ostreatus와 L.edode 추출물이 표준 항산화제인 Trolox보다 높은 항산화 능력을 가지고 있음을 보여줍니다.

두 버섯의 항산화 효과는 다음을 포함한 많은 생리 활성 성분의 존재에 기인할 수 있습니다.플라보노이드, 페놀, 생리활성 펩타이드 및 비타민 C[87]. Gaber et al. 구아바 추출물의 항산화 능력을 평가하기 위해 ABTS, DPPH, 철 환원 항산화력(FRAP) 및 ORAC 분석을 비교하고 네 가지 방법으로 측정한 항산화력과 비타민 C 함량 및 TPN 사이에 양의 상관 관계가 있다고 보고했습니다. 한편, 카로티노이드 함량과는 음의 상관관계를 기록하였다[88]. DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 질소 다리의 한 원자에 짝을 이루지 않은 원자가 전자가 있는 안정한 자유 라디칼입니다. 따라서 DPPH 라디칼의 소거는 인기 있는 DPPH 항산화 분석의 기초입니다[89]. 2,2'-아지노-비스({11}}에틸벤조티아졸린{12}}술포네이트) 라디칼 양이온(ABTS)은 항산화제에 의해 환원될 때 청색을 잃으며 색 변화는 분광광도계로 정량화될 수 있습니다[90]. ORAC 분석은 항산화 물질에 의해 방해받는 자유 라디칼에 의한 형광 프로브의 산화적 분해를 측정합니다. 따라서 항산화 능력이 강할수록 형광을 소멸시키는 데 필요한 시간이 짧아진다[91]. 또한, 위의 방법으로 시험한 시험 추출물이 유망한 항산화 효과를 나타내므로,자유 라디칼 소거. 그러나 시험된 버섯은 상당한 총 플라보노이드 함량을 함유하고 있으며, 플라보노이드는 전사인자 Nrf2의 활성화와 관련이 있어(2017), 이는 추정 기전으로 추가될 수 있다[92].

4. 재료 및 방법

4.1.버섯 종의 준비 및 계대 배양

이전에 확인된 P. ostreatus와 L.edodes 버섯은 이집트 카이로에 있는 농업 연구 센터의 문화 컬렉션에서 종균 및/또는 자실체로 입수했습니다[93,94]. 버섯 자실체에서 계대 배양을 위해 무균적으로 과일을 자르기 위해 수술용 칼날이 사용되었습니다. 내부 균사체는 멸균 바늘을 사용하여 수확하고 멸균 Potato Dextrose Agar(PDA) 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)에서 계대 배양했습니다. 곰팡이 종균을 계대배양하기 위해 멸균 겸자를 이용하여 종자를 따서 멸균된 PDA 플레이트에 무균적으로 옮겨 28도에서 7일간 배양한 후 각 균주의 자실체를 따로 세척하였다. 각 분리물(500g)을 실온에서 48시간 동안 방치하여 공기 건조시키고, 주방 분쇄기에서 수동으로 분쇄하고, 향후 사용을 위해 통풍이 잘 되는 장소에 실온에서 보관했습니다.

4.2. Pleurotus Ostreatus 및 Lentinus Edodes의 수성 추출

각 균주의 말린 과일을 가정용 블렌더를 사용하여 500g 분말로 분쇄한 후 실온에서 7Lof 증류수에 3일 동안 3회 침용한 후 초음파 처리(초음파 세척기, England, UK) 후 여과하였다. 액체가 소진될 때까지 침용 및 여과 과정을 반복하였다. 에탄올은 수율을 저장하는 데 사용되었습니다. 45도에서 에탄올을 증발시킨 후, 총 500mL의 각 분리물을 동결 건조하여 각 추출물의 약 20g의 건조 잔류물을 얻었다[96].

4.3. 단백질 분석

단백질체 분석은 이집트 카이로에 있는 이집트 어린이 암 병원 57,357(CCHE)의 단백질체학 및 대사체학 부서에서 수행되었습니다. 500mM Tris(pH8.5) 및 60uL 완전 울트라프로테아제(Roche , Mannheim, Germany)을 각 샘플에 첨가한 다음 샘플을 세게 흔든 다음 1{43}},{10}} RPM에서 30분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 수집하고 NanoLC 시스템을 사용하여 분획(1 ug/10 μL)을 주입했습니다. 질량 분석기 삼중 TOF 시스템(Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord)은 에 부착된 Eksigent nanoLC400 자동 시료 주입기로 구성된 액체 크로마토그래피(LC)(3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0.3 mm)와 결합되었습니다. 각 샘플에 대해 55분 동안 10μL/min의 유속을 갖는 Ekspert nanoLC425 펌프[97]. 데이터 분석은 ProteinPilot(버전 5.0.1.0,4895) 및 Paragon Algorithm(버전 5.0.1.0,4874)에 의해 수행되었습니다. 단백질 서열은 Swiss-Prot 및 TrEMBL 데이터베이스(P. ostreatus에 대한 14,792개의 항목을 포함하는 Pleurotus sp. 및 L.edodes에 대한 12603개의 항목을 포함하는 Lentinula sp.)의 서열에 대해 정렬되었습니다[98]. 버섯 종 사이에서 일반적으로 확인된 단백질은 Venny2.1.0.BioinfoGP 소프트웨어[99](Kingston on Hull, England, UK)를 사용하여 설명되었습니다.

4.4. 생리활성 화합물의 특성화

이전에 보고된 바와 같이 총 가용성 탄수화물 함량은 페놀 황산 기술을 사용하여 결정되었습니다[100]. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되며 실험은 3회 수행되었습니다.

총 페놀 함량(TPC) 및 총 플라보노이드 함량(TFC)은 Ryan et al. [101]. 샘플은 물에서 20 mg/mL의 농도로 제조되었습니다. 갈산(1 mg/mL 스톡 용액)을 메탄올에서 제조하였다. 루틴(1 mg/mL 스톡 용액)을 메탄올에서 제조했습니다. 갈산 표준 및 샘플을 플레이트의 웰에 6회 반복하여 피펫팅하고 630 nm에서 측정했습니다. 10개의 루틴 표준 및 6개의 반복 샘플 각각은 420nm에서 측정되었습니다.

총 페놀과 플라보노이드의 HPLC 분석은 Singh et al. [102]. 각각의 시료와 1개의 서로 다른 표준용액을 메탄올에 녹이고 0.22um 주사기 필터를 사용하여 여과한 다음, HPLC 컬럼인 Waters 2690 Alliance HPLC를 사용하여 각 시료 100μL와 각 표준액 10uL를 주입했습니다. Waters 996 포토다이오드 어레이 검출기가 장착된 시스템. 컬럼 C18 Inertsil ODS3: 4.6×250 mm, 5 um; 이동상: 완충액(수중 인산 0.1%); 메탄올 용리 모드는 280 nm의 파장에서 1 mL/min의 유속으로 구배였습니다.

수용성 비타민 분석의 경우, 시험한 버섯 추출물(50 mg/mL), 각각의 참조 표준(10 mL0.05 M 수산화나트륨 중 10} mg) 7가지 수용성 비타민(티아민 HCl, 아스코르브산, 리보플라빈, 니코틴산, 니코틴아미드, 피리독신 HCl 및 엽산)[103]과 지용성 비타민의 3가지 버섯 추출물 용액(50mg/mL) 및 세 가지 지방 비타민 E, D3 및 A의 메탄올 표준 용액을 각각 806.2, 114 및 400IU/mL로 준비했습니다. 그런 다음 용액을 100ug/mL로 희석하고 0.22um 주사기 필터를 사용하여 여과하고 100μL를 Waters 996 포토다이오드 어레이 검출기가 장착된 Waters 2690 Alliance HPLC 시스템(Milford, CT, USA)의 HPLC 컬럼에 주입했습니다. 컬럼 Inertsil ODS 3∶4.6×250 mm,5 μm; 이동상: 완충액(1000mL 물 및 오르토인산으로 pH를 3으로 조정한 0.85g 헥산 술폰산 나트륨 염); 메탄올 용출은 210 nm의 파장에서 1 mL/min의 유속으로 구배였다[104].

4.5. 단백질 및 아미노산 분석

버섯 추출물의 아미노산 조성은 용매 전달 시스템 S 2100(유량 범위가 {{ 24}}.{26}}1 ~ 10.{4}} mL/min 및 최대 압력 최대 400bar), 자동 시료 주입기, S5200, 아미노산 반응 모듈, S4300(내장 이중 필터 포함 570 nm의 광도계) 및 냉장 시약 정리기, S4130. 각 버섯 추출물 1g에 5mL의 헥산을 넣고 24시간 동안 침용시킨 후 Whatman no. 1 여과지. 잔류물을 10mL 6N HCl을 함유하는 시험관에 넣고 110도의 오븐에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 Whatman no. 1 여과지, 회전 증발기에서 증발. 잔류물을 2 mL의 희석 완충액(tri-sodium citrate dehydrate 0.06 M, citric acid 0.03 M, phenol 0.02 M, thiodiglycol 1.4%, HCL 32%)에 완전히 용해시키고 동일한 완충액에 1000-배 희석했습니다. 그런 다음 자동 아미노산 분석기(Sykam)가 장착된 암모니아 필터 컬럼(LCA, K04/Na, 4.6 x 100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Germany)에 로드되었습니다[105].

4.6. 세포 배양

자궁경부암(HeLa), 급성 단핵구 백혈병(Thpl), 결장직장암(Colo{0}}) 및 맹장암(LS{1}}) 세포는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지(Lonza, Cologne, Germany) 100mg/mL의 스트렙토마이신, 100단위/mL의 페니실린 및 10%의 열 비활성화 소 태아 혈청으로 보충되었습니다. 기타 세포주: 인간 백혈병(CCRF-CEM); 급성 전골수구성 백혈병(NB-4); 인간 림프종(U937); 전립선암(DU-145 및 PC3); 간세포 암종(HepG2); 유방 선암종(MCF{12}} 및 MDA-MB{14}}); 베로; 및 Hep{15}} 세포를 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM; Invitrogen, California, USA)에서 계대 배양하고 5% CO2의 가습 분위기에서 37도에서 배양을 수행했습니다. 세포주는 Nawah Scientific Inc.(Mokatam, Cairo, Egypt)에서 구입한 반면 1차 말초혈액 단핵 세포(PBMC) 및 정상 인간(ATCC PCS{20}}TM) 세포는 Viscera, Cairo, Egypt에서 구입했습니다. 본 연구는 아인샴스대학교 약학부 윤리연구위원회(승인번호 294)의 승인을 받았습니다.

4.7.항생제 활성

항바이러스 활성아데노바이러스 유형 7(Ad7) 및 단순 포진 바이러스 유형-II(HSV-2)(Nawah Scientific, Mokattam, Egypt)에 대해 테스트되었습니다. 항바이러스 활성은 이전에 설명한 대로 평가되었습니다[106]. Vero 및 Hep{5}} 세포를 감염 하루 전에 96-웰 배양 플레이트에 2×10* 세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. 다음날 세포 배양 배지(섹션 4.6)를 제거하고 인산완충식염수(PBS)를 사용하여 세포를 세척했습니다. 인간 아데노바이러스 및 단순 포진 바이러스 II형의 감염성은 세포변성 효과(CPE)를 모니터링하고 세포 생존율을 계산하는 설포로다민 B(SRB) 방법을 사용하여 결정되었습니다[107]. 항바이러스 활성은 버섯 추출물의 바이러스 CPE 억제 능력을 기반으로 계산되었으며, GraphPad PRISM 소프트웨어(Graph-Pad Software, San Diego)를 사용하여 50% 세포독성 농도(CC50) 및 50% 억제 농도(IC50)를 결정했습니다. , 캘리포니아, 미국). 선택도 지수(SD)는 Dogan et al. [108] 식 (1) 선택성 지수(SI)=CC50/IC50에 따름

4.8. MTT 분석을 사용한 PBMC에 대한 세포독성

세포독성은 MTT assay[109]를 이용하여 평가하였다. 세포 현탁액(세포 밀도 1.{3}}.8×10* 세포/웰)의 분취량(100μL)을 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 완전 배지를 첨가하고 세포를 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 세포를 48시간 동안 버섯 추출물의 연속 희석액으로 처리했습니다. PBS 중 MTT 용액(5 mg/mL)을 웰에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 처리되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하고 독소루비신(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)으로 처리한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.

4.9.암 세포주에 대한 SRB를 이용한 세포독성 활성 평가

전립선암에 대한 세포독성(DU{0}} 및 PC3); 간세포 암종(HepG2); 결장직장암(Colo-205); 맹장암(LS-513); 자궁경부암(HeLa); 유방 선암종(MDA-MB-231 및 MCF-7) 세포주는 설포로다민 B(SRB) 비색 분석을 사용하여 평가되었습니다[110]. 완전 배지(4.6)의 세포 현탁액을 {{11}웰 플레이트에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그 다음 다양한 농도(완전배지에서 0 ~ 100 ug/mL)의 버섯추출물을 첨가하여 72시간 동안 배양하였으며, 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로, 독소루비신을 처리한 세포를 양성대조군으로 하였다.

4.10.WST-1 분석을 사용한 백혈병 및 림프종 세포주의 생존 가능성

Abcamkit( ab155902 WST-1 세포 증식 시약, 영국). 세포 현탁액을 24시간 동안 배양한 다음 다른 농도(완전 배지에서 0~100ug/mL)의 버섯 추출물로 48시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 세포를 10 μL WST{13}} 시약으로 1시간 동안 처리하고 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 A450을 판독했습니다[111]. 처리되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하고 독소루비신(Sigma-Aldrich, Germany)으로 처리한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.

4.11.항산화 활성

4.11.1.DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 분석은 Lu et al. [112]. 생성된 DPPH 색상의 감소는 540 nm에서 측정되었습니다.항산화 활성보정 곡선(R{0}}.9903)을 참조하여 억제 백분율로 표시했습니다. 데이터는 식 (2)에 따라 평균 ± SD로 표시됩니다. (항산화 활성 백분율=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2) 여기서 abs-blank 및 abs-sample은 각각 blank 및 샘플의 흡광도를 나타냅니다. 자유 라디칼(IC50)의 절반을 억제하는 데 필요한 샘플 농도를 추정했습니다.

4.11.2.ABTS(2,2'-아지노비스-(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산))라디칼 양이온 소거 활성

분석은 앞서 설명한 [113]에 따라 수행되었습니다. 버섯 추출물(0 ~ 100ug/mL 용액의 10μL)을 96-웰 플레이트에서 190μL의 갓 준비한 ABTS(Sigma-Aldrich Germany)와 혼합하고 실온의 암실에서 인큐베이션했습니다. 2시간 각 샘플은 4회 반복 테스트되었으며 흡광도는 734nm에서 측정되었습니다. 항산화 활성은 검량선(R{10}}.9948)을 참조하여 억제율(식(1))로 표시했습니다.

4.11.3. 산소 라디칼 흡광도(ORAC) 분석

분석은 이전에 결정된 대로 [62] 약간 수정하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 12.5μL의 버섯 추출물을 3중으로 37도에서 30분 동안 75μL의 플루오레세인(10nm)과 함께 인큐베이션했습니다. 형광 측정(485 EX, 520 EM, nm)은 3주기(사이클 시간=90 s) 동안 수행되었습니다. 이후, 새로 준비된 2,2'-Azobis 2-의 240 mm 용액 12.5 μL 아미디노프로판 디히드로클로라이드(AAPH)(Ab-cam, Cambridge, UK)를 각 웰에 즉시 첨가하고 형광 측정을 2.5시간 동안 계속하였다(85주기, 각 90초). AAPH 분해에 의한 퍼옥실 라디칼 형성 유사체는 용량 의존적 방식으로 플루오레세인 붕괴를 억제하는 양성 대조군으로 사용되었습니다. 항산화 활성은 억제 백분율로 표시되었습니다(검정 곡선(R{32}}.9957)을 참조하여 식(1)).

4.12.통계분석

3중 화학 분석을 수행하고 결과를 평균 ± 표준 편차로 표시했습니다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 의해 수행되었습니다.

평균 간의 차이의 유의성은 Tukey-Kramer 다중 비교 테스트로 평가되었습니다. 0.05 이하의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계적 평가는 GraphPad PRISM 소프트웨어(Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 결정되었습니다.

5. 결론

버섯 P. ostreatus와 L.edodes는 다양한 생리활성 화합물을 함유하고 있습니다. 프로테옴 분석은 수많은 생물학적 활성을 갖는 다중 생리활성 분자의 발현을 보여주었다. 버섯의 수성 추출물은 유망합니다항바이러스제adenovirus type7 및 herpes simplex virus type-II.CPE에 대한 활성은 암세포주에 대해 검출되었지만 정상 인간 PBMC에 대해서는 검출되지 않았습니다. 본 연구는 항바이러스, 항종양 및 항산화 능력 외에도 정상 PBMC에 대한 낮은 세포독성에 비추어 약리학적 목적으로 이러한 버섯의 사용을 권장합니다.

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