파킨슨병의 체외 모델 파트 2에서 향상된 정확성과 효율성을 갖춘 신경돌기 변성의 정량화
Aug 28, 2023
결과
PD와 관련된 신경돌기 변성의 세포 배양 모델 확립
PD의 세포 배양 모델에서 신경돌기 변성을 조사하는 방법을 개발하기 위해 조건부 불멸화 인간 중뇌 세포 집단인 배양된 LUHMES 세포를 사용했습니다. 분화 시, LUHMES 세포는 유사분열 후가 되고, 성숙한 도파민성 뉴런의 특징적인 유전자 발현 프로파일을 채택하고, 길이가 최대 500mm까지 확장되는 신경돌기를 갖는 뉴런 형태를 발달시킵니다(그림 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).
신경세포가 돌연변이를 일으키거나 죽는 상태인 신경변성은 기억과 밀접한 관련이 있습니다. 세포 배양 모델에서는 배양 조건을 제어하여 신경퇴행의 발현을 완화하여 기억력을 향상시킬 수 있습니다.
연구에 따르면 신경 세포의 항상성은 세포 생존과 시스템 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 배양액의 영양분, 성장인자 등의 인자를 조절하여 세포의 안정성을 향상시킬 수 있습니다. 동시에, 세포가 환경에 의해 교란되고 손상되는 것을 방지하기 위해 배양 환경의 청결도와 온도 조절을 유지하는 데 주의를 기울이십시오.
또한 세포 배양 모델에서는 특정 화합물이나 약물을 세포에 주입하여 신경 조절 발현을 감소시켜 세포의 생존율과 기억 성능을 향상시킬 수도 있습니다. 이 기술은 신경퇴행성 질환 연구에도 널리 사용됩니다.
즉, 신경퇴행은 세포의 안정성과 시스템 기능에 중요한 영향을 미치며, 세포 배양 기술은 신경퇴행과 기억의 관계에 대한 심층적인 탐색과 연구가 가능한 좋은 모델 연구 방법이다. 환경 조절, 세포에 약물 주입 등을 통해 신경조절 성능을 완화하여 세포 생존 및 기억 성능을 향상시키고, 신경퇴행성 질환 연구에 보다 포괄적인 기반을 제공할 수 있습니다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. Cistanche는 기억력과 학습에 매우 중요한 아세틸콜린과 성장 인자의 수준을 높이는 등 신경 전달 물질의 균형을 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 또한 고기는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양과 에너지를 공급하여 뇌의 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.
플라스틱에 비해 유리의 광학적 품질이 우수하기 때문에 배양은 8개의 배지 챔버가 포함된 유리 슬라이드에 확립되었습니다. 이전 보고서(Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014)에 기초하여, 우리는 처음에 PLO와 피브로넥틴으로 코팅된 챔버 슬라이드에서 배양을 확립하려고 시도했습니다. 그러나 그러한 배양물은 접착력 결핍과 낮은 생존력을 나타냈습니다. 결과적으로 우리는 추가 기판으로 코팅하면 유리 표면에 확립된 LUHMES 세포 배양의 생존 가능성이 향상되는지 여부를 테스트했습니다.
LUHMES 세포 배양은 코팅되지 않았거나 PLO 및 피브로넥틴, PDL 및 라미닌, 또는 네 가지 기질의 조합으로 코팅된 슬라이드에서 확립되었습니다. 형광 현미경으로 생존 핵을 분석한 결과 슬라이드 코팅이 배양균의 생존 가능성에 상당한 영향을 미쳤다는 사실이 밝혀졌습니다[Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001]. 사후 다중 비교 분석을 통해 슬라이드가 앞서 언급한 4가지 기질의 조합으로 코팅한 슬라이드는 PLO와 피브로넥틴만 코팅한 슬라이드와 비교할 때 생존 세포 비율이 훨씬 더 높습니다(p= 0.0437; 그림 1B, C).
유리 슬라이드에서 LUHMES 세포를 배양하기 위한 최적의 코팅 기판을 확인한 후 신경돌기 변성 측정을 위한 배양 적합성에 대한 세포 밀도의 영향을 평가했습니다. LUHMES 세포를 웰당 57,500개 세포, 웰당 115,000개 세포, 또는 웰당 230,000개 세포의 플레이팅 밀도를 갖는 분화 배지에서 배양하였고, 분화 5일째에 세포를 4% PFA로 고정하고 위상차 현미경으로 이미지화했습니다.
웰당 57,500개 세포의 밀도로 인해 신경돌기 네트워크가 제대로 연결되지 않고 신경돌기 형태가 불규칙한 배양물이 생성된 반면, 230000 세포의 플레이팅 밀도로 확립된 배양물은 실행 가능하지만 정확한 신경돌기 측정을 하기에는 너무 높은 신경돌기 밀도를 포함했습니다. 웰당 115000 세포의 중간 세포 밀도는 정확한 신경돌기 변성 측정에 도움이 되는 높은 생존력과 잘 분리된 축삭관을 제공했습니다(그림 1D).
시험관 내에서 PD 관련 신경돌기 퇴화를 모델링하기 위해 우리는 분화된 LUHMES 세포를 산화 스트레스와 카테콜아민성 뉴런의 퇴화를 촉진하는 널리 사용되는 신경독인 6-OHDA에 노출했습니다(Bové and Perier, 2012). 분화된 LUHMES 세포를 6-OHDA에 노출시키면 신경돌기 변성의 용량 의존적 증가가 촉진되었으며, 5.0 mM 6-OHDA와 7.5 mM 6-OHDA는 각각 중등도 및 중증 신경돌기 변성을 유도했습니다(그림 .2F). 6-OHDA에 노출된 LUHMES 세포 배양물에서 신경돌기 변성을 정량화하기 위해 우리는 배양물의 위상차 이미지를 이진화하고 이미지의 세포체를 디지털 방식으로 제거하며 입자 분석기 알고리즘을 사용하여 널리 인용되는 방법을 사용했습니다. ImageJ는 신경돌기 조각의 면적을 측정하는 데 적용됩니다. 그런 다음 단편화된 신경돌기 영역을 합산하고 전체 신경돌기 영역으로 나누어 DI를 결정합니다(그림 2A-E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler 외., 2019).
예상대로, 분화된 LUHMES 세포를 6- OHDA에 노출하면 DI(F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{의 용량 의존적 증가가 발생했습니다. {8}}.9374, 그림 2G). 그러나 6-OHDA에 노출된 세포를 분석하는 동안 DI 측정의 정확성과 효율성에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이는 몇 가지 문제를 관찰했습니다. 따라서 우리는 신경돌기 단편화의 보다 효과적인 측정을 촉진하는 프로토콜을 생성하기 위해 DI 측정을 수행하기 위한 이 일반적인 방법(이후 전통적인 DI 방법이라고 함)을 최적화하려고 했습니다.
현미경 사진 이진화와 관련된 인공 조각화 감소
전통적인 DI 방법을 사용하는 동안 우리는 위상차 이미지의 손상되지 않은 신경돌기가 해당 이진화된 이미지에서 조각화되어 나타나는 문제를 자주 관찰했습니다(그림 3A). 이러한 인공 단편화는 주로 눈에 띄지 않는 신경돌기에 영향을 미쳤습니다. 따라서 우리는 이미지 대비를 향상시키는 절차를 통해 문제를 줄일 수 있는지 조사했습니다. 이미지 대비를 개선하기 위해 먼저 다양한 빛 강도를 사용하여 신경돌기 이미지를 캡처하여 최적의 대비를 생성하는 이미지 밝기 수준을 결정했습니다.
최적의 광 강도로 캡처된 이미지는 ImageJ를 사용하여 최소 및 최대 강도 값이 각각 90과 205인 LUT를 적용하여 대비를 더욱 강화했습니다. 이러한 대비 향상을 통합하면 위상차 이미지에서 생성된 이진화된 이미지에서 신경돌기를 어느 정도 더 정확하게 표현할 수 있습니다(그림 3B). 그럼에도 불구하고 건강한 신경돌기의 이진화된 이미지에 대한 정량적 분석에서는 대비 강화가 인공 단편화를 크게 감소시키지 않는 것으로 나타났습니다(p= 0.9999; 그림 3D). 따라서 우리는 다음으로 면역형광 영상의 사용이 우수한 대비를 가진 영상을 생성하여 인공 단편화가 감소된 보다 정확한 이진화된 신경돌기 영상의 생성을 촉진하는지 여부를 조사했습니다.
다양한 농도의 6- OHDA에 노출된 고정된 LUHMES 세포를 특징으로 하는 그림 2에 설명된 슬라이드는 세포골격 단백질 b III-튜불린에 대해 면역염색되었으며 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었으며 인공 단편화에 대해 맹검 조사관에 의해 분석되었습니다(그림 2). .3C). 형광 현미경 사진과 해당 위상차 현미경 사진에서 얻은 이진화 이미지의 정량 분석을 통해 현미경 유형이 인공 단편화 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . 특히, 형광 현미경 사진은 위상차 현미경 사진과 비교하여 인공 단편화가 크게 감소된 이진화 이미지를 생성했습니다(p= 0.0016; 그림 3D).
결과적으로 건강한 배양 이미지는 위상차 현미경 사진(F(1,8)= 131.4, p=0.{{12}) 대신 형광 현미경 사진을 사용한 경우 DI 점수가 상당히 낮았습니다. }001, R2=0.1442; 그림 3E). 더욱이, 주목할만한 전반적인 경향은 형광 현미경 사진을 사용하여 측정할 때 건강한(차량 처리) 배양과 신경돌기 변성을 나타내는 배양(5.0 또는 7.5 mM 6-OHDA 처리)과 관련된 평균 DI 값 사이의 배수 변화가 더 컸다는 것입니다. 위상차 현미경 사진에서 얻은 것보다 (그림 3E). 이는 인공 단편화의 감소로 인해(p{20}}.0001) 상응하는 위상 이미지보다 DI 점수가 상당히 낮은 중간 정도의 신경돌기 변성(5mM 6-OHDA에 대한 노출로 유발)이 있는 배양의 형광 현미경 사진에도 불구하고 발생했습니다. , d=0.6312).
단편화된 신경돌기 및 전체 신경돌기 검출을 위한 매개변수 최적화
DI 측정을 수행하는 전통적인 방법에는 신경돌기 조각을 감지하기 위해 크기 매개변수가 20 10,000 픽셀인 ImageJ용 입자 분석 플러그인을 사용하는 것이 포함됩니다. 그러나 우리는 널리 인용되는 이러한 매개변수를 사용할 때 입자 분석기에 의해 신경돌기 조각의 상당 부분이 검출되지 않는 것을 관찰했습니다(Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin and Cho, 2020)은 그림 2에 설명된 대로 생성된 6-OHDA에 노출된 LUHMES 세포의 위상차 현미경 사진에서 신경돌기 변성을 측정합니다.
따라서 우리는 신경돌기 조각 식별을 위한 최적의 매개변수를 결정하기 위해 입자 감지에 대한 다양한 최소 크기 제한을 사용하여 해당 데이터 세트의 이미지를 재분석했습니다. 위상차 현미경 사진에서 생성된 이진화 이미지의 정성 평가에서 5~10의 크기 매개변수,000 픽셀은 신경돌기 조각의 감지를 향상시켰지만 배경 잡음, 이미지 아티팩트 또는 기타 작은 오인과도 관련이 있었습니다. 신경돌기 조각과 같은 비신경돌기 물질. 그러나 널리 사용되는 매개변수인 20-10000 픽셀과 비교할 때 매개변수 10-10000 픽셀은 위양성이 눈에 띄게 크게 증가하지 않으면서 신경돌기 단편의 검출을 향상시켰습니다(그림 4A). , 왼쪽).
b III-튜불린에 대해 면역표지된 LUHMES 세포의 형광 현미경 사진에서 얻은 이진화된 이미지를 사용하여 유사한 분석을 수행했습니다. 5-10000 픽셀의 입자 분석기 크기 매개변수는 신경돌기 단편의 가장 민감한 검출을 용이하게 했으며, 형광 현미경 사진은 작은 잔해가 적기 때문에 이러한 매개변수는 신경돌기가 아닌 물질을 신경돌기 단편으로 잘못 식별하는 것을 눈에 띄게 증가시키지 않았습니다. (그림 4A, 오른쪽).
20~10000 픽셀의 입자 분석기 크기 매개변수를 사용하여 DI 측정을 수행하는 기존 방법은 신경돌기 조각 측정에서 20픽셀보다 작은 물체를 제외합니다.
그러나 이러한 작은 물체는 일반적으로 총 신경돌기 면적 측정에 잘못 포함됩니다. 왜냐하면 기존 DI 측정 방법에서는 이진화된 이미지의 모든 검은색 픽셀을 합산하여 총 신경돌기 면적을 계산하기 때문입니다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 ImageJ 개발자 Wayne Rasband가 작성한 ImageJ용 Particle Remover 플러그인을 사용하여 이진화된 이미지에서 작고 신경돌기가 아닌 개체를 제거했습니다. 그림 2에 설명된 대로 생성된 6-OHDA에 노출된 LUHMES 세포의 위상차 현미경 사진을 사용하여 DI 측정을 수행하는 동안 이 플러그인을 적용하면 신경독 노출의 모든 농도에서 DI 측정이 크게 증가했습니다(F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
또한, 중요한 상호작용은 입자 제거제 사용으로 인한 DI 증가가 더 높은 농도(F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{)에서 더 강해지는 것을 나타냅니다. {8}}.0094; 그림 4B, C). 우리는 또한 형광 현미경으로 동일한 세포 슬라이드를 이미지화하고 형광 현미경 사진에서 얻은 DI 측정에 대한 작은 입자 제거 효과를 평가했습니다. 작은 입자 제거는 이론적으로 더 정확한 DI 값을 제공하지만 평균적으로 이러한 값은 형광 현미경 사진(F(1,8)=2을 사용하여 측정할 때 입자 제거 플러그인을 사용하지 않고 얻은 값과 크게 다르지 않았습니다. 613, p=0.1446, R2=0.0013; 그림 4D).
형광 현미경 사진을 통한 DI 측정 자동화
기존 방법을 사용하여 DI 측정을 수행하려면 지루하고 시간이 많이 걸리는 이미지 처리, 개별 세포체를 디지털 방식으로 제거하기 위한 프리핸드 도구 사용, 각 이미지에서 조각난 신경돌기 및 총 신경돌기 영역 측정이 필요합니다. 따라서 우리는 DI 분석을 완전히 자동화하는 매크로를 작성하여 방법의 효율성을 향상시키려고 했습니다. 소마 제거를 자동화하기 위해 ANDI라는 매크로는 핵 얼룩 DAPI를 통해 표지된 세포핵 이미지의 이진화를 실행한 다음 임계값 핵 영역이 소마의 전체 영역을 포함하도록 확대되도록 이진화된 이미지를 수정합니다. 그런 다음 이진화되고 확대된 핵이 있는 이미지를 b III-tubulin에 대해 면역 표지된 뉴런의 해당 형광 현미경 사진에서 제외하여 신경돌기만을 특징으로 하는 이미지를 생성합니다(그림 5A, B).
신경변성과 관련된 핵 수축 또는 단편화로 인한 다양한 핵 크기를 조정하기 위해 핵의 이진화된 이미지는 핵 단편을 결합하고 이진화된 영역을 확장하여 분화된 LUHMES 세포의 체세포보다 더 큰 영역을 차지하도록 확장 및 침식의 조합을 통해 확대됩니다. . 신경돌기만 포함된 이미지는 이진화되고 일련의 자동화된 기능을 통해 DI 분석을 거칩니다(그림 5C, D). 이미지에서 소마 제거와 관련된 매크로 작업의 정확성을 평가하기 위해 ImageJ의 자유형 도구(이전에 그림 4D에 설명된 대로)를 사용하여 형광 현미경 사진에서 세포체를 수동으로 제거한 후 얻은 DI 점수를 DI 점수와 비교했습니다. ANDI Macro에 포함된 세포체 제거 작업을 사용하여 자동 세포체 제거 후 동일한 이미지를 분석하여 생성되었습니다. 우리의 분석에 따르면 자동화된 세포체 제거를 사용하여 계산된 DI 점수는 수동 세포체 제거를 받은 이미지에서 얻은 DI 측정값과 거의 동일한 상관 관계가 있는 것으로 나타났습니다(r(34)=0.980, p, 0.0001; 그림 2. 5E).
분석의 정확성을 높이기 위해 DI 측정을 향상시키는 이전에 설명한 몇 가지 조정 사항을 ANDI에 통합했습니다. 매크로는 대비 향상 작업, 신경돌기 이미지에서 비신경돌기 물질 및 핵 이미지에서 비핵물질을 제거하기 위한 입자 제거기 플러그인 사용, 크기 매개변수 5~10을 사용하여 신경돌기 조각 감지 등의 기능을 제공합니다.000 Analyze Particles 플러그인의 경우.
우리는 형광 현미경 검사법, 대비 강화 작업, 입자 제거제로 작은 물체 제거, 입자 검출을 위한 최적화된 매개 변수를 종합적으로 사용하면 신경돌기 변성의 보다 정확한 측정에 기여할 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 그림 2에 설명된 대로 생성된 다양한 농도의 6-OHDA에 노출된 LUHMES 세포의 위상차 이미지를 0 사이의 값 범위를 사용하여 맹목적이고 주관적인 점수로 분석했습니다. 0 및 1.0, 조각화된 신경돌기 영역의 겉보기 비율을 나타내는 값이 포함됩니다. 그런 다음 주관적 점수와 전통적인 방법을 통해 얻은 DI 측정값 간의 상관관계뿐만 아니라 ANDI Macro를 사용하여 얻은 주관적 점수와 DI 측정값 간의 상관관계를 평가했습니다.
전통적인 방법을 사용하여 얻은 DI 측정은 주관적 점수(r{0}}.7850, p,0.0001; 그림 5F)와 상관 관계가 있지만 ANDI 매크로는 주관적 평가와 훨씬 더 강한 상관관계가 있는 측정값입니다(r2=0.978, p, 0.0001; 그림 5G). 직접 통계 비교를 통해 ANDI Macro를 통해 얻은 점수는 기존 방법을 통해 얻은 점수보다 주관적 평가와 훨씬 더 강한 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다(z{10}}.626, p, 0.0001; 그림 5F, G). 추가 분석에 따르면 매크로는 시간 효율성을 강력하고 크게 향상시켜 DI 측정 성능을 촉진하는 것으로 나타났습니다. ANDI Macro를 사용하여 수행된 DI 분석에는 분석된 이미지당 평균 12.75초가 필요했는데, 이는 기존 방법을 통해 분석된 이미지당 평균 5.27분의 시간과 비교됩니다. [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. 전체적으로, 이러한 결과는 ANDI가 전통적인 방법을 통해 얻은 점수와 비교하여 연구자가 신경돌기 이미지의 질적 분석에서 인식하는 퇴행에 더 가깝게 접근하는 DI 측정의 신속한 생성을 나타냅니다.
6-OHDA에 노출된 분화된 LUHMES 세포에서 신경돌기 변성을 측정하기 위한 ANDI 매크로의 정확성과 효율성을 확인한 후, 다른 세포 배양 모델과 관련된 실험에 대한 매크로의 적합성을 평가했습니다. b III-튜불린 및 DAPI에 대해 면역표지된 1차 교감신경 배양의 현미경 사진을 사용하여 DI 측정을 수행할 때 ANDI의 정확성을 평가하기 위해 파일럿 연구가 처음 수행되었습니다. 그러나 흥미롭게도 교감 신경 세포의 세포체는 분화된 LUHMES 세포의 세포체보다 크기 때문에 자동화된 체세포 제거와 관련된 ANDI의 작업은 체체 전체를 제거하지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음).
이 문제를 극복하기 위해 우리는 핵의 이진화된 현미경 사진이 확장되는 횟수를 제어하여 사용자가 체세포 제거 크기를 선택할 수 있는 대화 상자 기능을 제공하도록 ANDI를 개정했습니다. 이 버전의 ANDI 버전 1.1은 건강한 차량 처리 교감 뉴런 또는 과산화수소에 노출된 퇴화 교감 뉴런을 묘사하는 현미경 사진에서 DI 측정을 수행하는 데 사용되었습니다. 과산화수소에 노출된 뉴런의 이미지는 차량 처리된 뉴런의 이미지에 비해 훨씬 더 높은 DI 점수를 나타냈습니다(F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301, 그림 6A, C). 또한 ANDI를 사용하여 얻은 DI 점수를 ImageJ의 자유형 도구를 사용하여 형광 현미경 사진에서 세포체를 수동으로 제거한 후 동일한 이미지 세트에서 얻은 DI 측정과 비교했습니다. ANDI(F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0를 사용하여 얻은 점수와 비교하여 수동 소마 제거 후 계산된 DI 점수에는 큰 차이가 없었습니다. 0000; 그림 6A–C). 사후 테스트에서는 ANDI를 사용하여 얻은 DI 점수가 처리되지 않은 뉴런의 경우(p= 0.0972)와 과산화수소에 노출된 뉴런의 경우(p{24}}) 모두 크게 다르지 않은 것으로 확인되었습니다. 9986).
또한 ANDI에서 생성된 DI 점수는 해당 현미경 사진에서 세포체를 수동으로 제거한 후 얻은 DI 점수와 거의 동일하게 상관관계가 있었습니다(r(34)=0.991, p, 0.0001). 이러한 데이터는 ANDI가 사용자가 다양한 뉴런 유형에 맞게 맞춤화할 수 있는 체세포 제거 작업을 통해 일차 뉴런 배양에서 신경돌기 변성을 측정하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 또한, 과산화수소에 노출된 배양물에서 신경돌기 단편의 검출은 6-OHDA 이외의 소스에 의해 유도된 신경돌기 변성과 관련된 실험에 사용하기 위한 매크로의 적용 가능성을 보여줍니다. 다양한 원인과 관련된 신경돌기 변성을 검출하는 데 ANDI의 사용을 추가로 검증하기 위해 우리는 매크로를 사용하여 건강한 교감 신경 배양 또는 NGF 중단을 받은 배양의 현미경 사진에서 신경돌기 변성을 측정했습니다. 예상한 대로, NGF 중단을 받은 문화의 이미지는 건강한 문화의 이미지에 비해 훨씬 더 높은 DI 값을 나타냈습니다(F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958, 그림 6D, E). 종합적으로, 이러한 발견은 ANDI가 다양한 생물학적 맥락과 관련된 신경돌기 변성을 검출하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
TH에 대한 염색은 일반적으로 카테콜아민성 뉴런을 시각화하는 데 사용되므로 ANDI를 사용하여 신경돌기 변성을 측정하기 위한 TH 염색을 묘사하는 현미경 사진의 적합성도 평가했습니다. 비히클 용액으로 처리된 건강한 교감 신경 세포 또는 과산화수소에 노출된 변성 교감 신경 세포의 배양물을 고정하고 TH 및 b III-튜불린에 대한 면역형광 표지뿐만 아니라 DAPI에 대한 대조염색을 실시했습니다. 그런 다음 TH 또는 b III-튜불린에 대한 염색을 묘사하는 신경돌기 이미지와 DAPI 라벨링을 특징으로 하는 해당 핵 이미지를 유사한 시야에서 캡처했습니다. ANDI를 시행하여 TH 염색이나 b III-tubulin 염색이 나타나는 영상을 신경돌기 영상으로 선정하였다. 우리의 분석에 따르면 TH 염색 이미지를 사용하여 얻은 DI 점수는 b III-tubulin 염색 이미지에서 얻은 점수와 매우 강한 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다(r(28)= 0.962, p, 0.0001; 그림 .6F, G). 이러한 데이터는 TH에 대한 면역 라벨링과 같이 신경돌기 전체를 라벨링하는 대체 염색 절차를 사용하여 ANDI에서 정확한 DI 측정값을 얻을 수 있음을 나타냅니다.
과학 실험에서 DI 측정을 수행하기 위한 향상된 방법의 유용성을 입증하기 위해 우리는 인간 중뇌 세포에서 산화 스트레스로 인한 신경돌기 변성에서 JNK의 역할을 평가하는 새로운 방법을 사용했습니다. 분화된 LUHMES 세포를 JNK 억제제 SP600125 또는 비히클 용액으로 1시간 동안 전처리했습니다. 그런 다음 세포를 6- OHDA로 24시간 동안 처리하여 산화 스트레스를 유도하거나 운반체 용액을 처리했습니다. 고정된 세포는 b III-tubulin 및 DAPI 염색을 위해 면역표지를 실시하고 ANDI를 사용하여 형광 현미경 사진에서 DI 측정값을 얻었습니다. JNK 억제제를 사용한 전처리가 결여된 배양물은 6-OHDA에 노출된 후 신경돌기 변성을 보인 반면, JNK 억제는 6- OHDA로 유발된 신경돌기 변성을 현저히 감소시켰습니다(p= 0.0001 , d= 2.0209; 그림 7). 이러한 발견은 인간 중뇌 세포의 산화 스트레스에 의해 유발된 신경돌기 퇴행에서 JNK 신호 전달의 핵심 역할을 뒷받침하며, 중요하게는 신경돌기 퇴행의 빠르고 정확한 측정을 촉진함으로써 과학적 발견을 생성하는 새로운 방법의 유용성을 입증합니다.
논의
신경돌기 퇴행은 다양한 신경병리학적 상태와 연관되어 있지만, 신경돌기 퇴화의 기초가 되는 분자 메커니즘은 아직 불완전하게 이해되어 있습니다. 신경돌기 변성의 정확하고 효율적인 분석을 촉진하는 방법은 이 중요한 세포 사건을 조절하는 새로운 요인을 성공적으로 식별하는 데 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 신경돌기 변성을 정량화하기 위해 일반적으로 사용되는 방법과 관련된 여러 가지 오류 원인을 밝힙니다. 우리는 DI 분석 오류를 줄이기 위해 구현할 수 있는 절차적 수정을 지원하는 실험 데이터를 보고하며, 이러한 수정 사항은 새로운 ImageJ 매크로에 통합되어 오픈 소스 및 무료 소프트웨어를 사용하여 빠르고 정확하며 객관적인 DI 분석을 위한 도구를 제공합니다. 또한, 우리는 개선된 방법을 적용하여 PD의 세포 배양 모델에서 신경돌기 변성을 측정할 수 있는 방법을 입증합니다. 이 질환은 도파민성 뉴런의 축삭 단편화가 최종 신경 세포 손실에 앞서는 초기 단계 사건입니다(Tagliaferro 및 Burke, 2016). .
본 연구에서는 6-OHDA에 노출된 분화된 LUHMES 세포로 구성된 PD의 세포 배양 모델에서 신경돌기 변성을 측정하는 데 ANDI Macro의 유용성을 입증했습니다.
우리는 배양이 확립되어야 하는 최적의 기판을 뒷받침하는 실험 결과를 보고할 뿐만 아니라 신경돌기 변성 분석에 가장 적합한 도금 밀도를 보여줍니다. 신경돌기 변성을 연구하기 위해 이 모델 시스템을 사용하면 몇 가지 장점이 있습니다. 세포는 잘 네트워크화되어 있고 일반적으로 길이가 0.500mm인 신경돌기를 발달시키며, 배양물은 6-OHDA, 1-메틸{4과 같은 PD의 고전적인 신경독소 모델에 의해 유도된 신경변성에 취약합니다. }}페닐피리디늄 이온(MPP1) 및 로테논(Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). 더욱이, LUHMES 세포의 인간 기원은 모델과 관련된 발견의 번역 가능성을 증가시키고, 조건부 불멸화는 배양의 신속한 생성 및 전파를 촉진합니다(Scholz et al., 2011). 따라서 ANDI를 사용하여 수행된 자동화된 분석과 결합하여 LUHMES 세포를 사용하여 PD 관련 신경돌기 변성과 관련된 새로운 발견을 수행하는 동시에 1차 신경 배양으로 수행된 비자동 분석에 비해 상당히 높은 처리량을 촉진할 수 있습니다.
수많은 연구 그룹에서는 신경돌기 변성을 조절하는 요인에 대한 통찰력을 얻기 위해 위상차 이미지를 사용하여 DI 분석을 수행했습니다(Press and Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano 외, 2015; Hill 외, 2018; Geisler 외, 2019). 여기에서는 신경돌기 변성을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법과 관련된 중요한 단점을 보고합니다. 위상차 이미지의 이진화로 인해 손상되지 않은 신경돌기의 상당 부분이 조각난 것처럼 보입니다. 현미경 사진을 캡처할 때 달성할 수 있는 대비 수준은 연구자가 사용할 수 있는 현미경 시스템에 따라 다르지만, 이 문제는 다양한 연구 그룹에 만연해 있습니다. DI 0.2는 일반적으로 배양이 퇴화되는 것으로 간주되는 임계값으로 받아들여지기 때문입니다. 축삭 및 위상차 현미경 사진의 DI 측정을 특징으로 하는 대부분의 과학 보고서에서는 건강한 뉴런에 대한 DI 점수가 0.1에서 0.3 사이인 것으로 보고되었습니다(Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; 로레토 외., 2020). 맹검 조사자의 주관적 점수뿐만 아니라 형광 현미경 사진에서 얻은 DI 분석은 10-20% 신경돌기 단편화가 건강한 뉴런 배양에서 흔하지 않음을 나타냅니다. 오히려, 그러한 배양은 평균 2.5%의 신경돌기 단편화만을 나타냅니다. 따라서 우리의 연구 결과는 측정 오류의 일반적이고 중요한 원인을 줄여 신경돌기 변성 분석의 정확성을 향상시키는 방법의 필요성을 강조합니다.
DI 측정과 관련된 대부분의 연구에서는 신경돌기 변성 분석을 수행하기 위해 위상차 이미지를 사용했지만, 몇몇 연구 그룹에서는 최근 신경필라멘트 매체 폴리펩티드 또는 b-b-튜불린과 같은 세포골격 필라멘트에 대해 면역 표지된 뉴런의 이미지를 사용하여 DI 측정을 수행했습니다(Wakatsuki). 등, 2011, Li 등, 2017, Pease-Raissi 등, 2017, Hernandez 등, 2018, Sundaramoorthy 등, 2020). 그러나 신경돌기 변성 동안 이러한 세포골격 단백질의 국소화 변화가 신경돌기 형태의 전체 변화를 적절하게 모델링하는지 여부를 이해하고 형광 현미경 사진으로 얻은 DI 측정값이 위상차 현미경 사진에서 얻은 유사한 측정값과 상관관계가 있는 정도. 여기에서 우리는 b III-tubulin 염색을 묘사하는 형광 현미경 사진이 신경돌기 단편화를 정확하게 나타낼 뿐만 아니라 뛰어난 대비와 이진화 시 인공 단편화에 대한 민감성 감소로 인해 보다 정확한 DI 측정을 용이하게 한다는 것을 보여줍니다. 따라서 우리의 결과는 신경돌기 변성을 측정하기 위해 b III-tubulin 염색을 사용하는 유용성을 강조합니다.
신경돌기 변성을 측정하기 위한 DI 분석과 관련된 발표된 연구 중에서, 신경돌기 단편을 검출하는 데 사용되는 보고된 크기 및 원형 매개변수는 상당히 다양했습니다. 예를 들어, 배양된 해마 뉴런의 신경돌기 변성 평가와 관련된 최근 연구에서는 4~9{3}}0 픽셀의 크기 매개변수를 사용한 반면(Li et al., 2017), 배양된 DRG 뉴런과 관련된 연구에서는 다음과 같은 검출 매개변수를 사용했습니다. 0–10,000 픽셀(Wakatsuki 외, 2011). 이러한 변화의 한 가지 잠재적인 이유는 입자 감지를 위한 크기 매개변수가 픽셀 단위와 연관되어 있기 때문에 신경돌기 조각을 감지할 때 입자 분석 크기 매개변수의 효능이 이미지의 해상도에 따라 달라지기 때문입니다. 불행하게도 DI 분석과 관련된 대부분의 출판된 연구에는 분석에 사용되는 이미지 해상도에 대한 설명이 포함되어 있지 않습니다. 따라서 권장되는 이미지 해상도와 같은 중요한 세부 사항을 완전히 공개하는 프로토콜을 통한 표준 분석 매개변수의 설정이 필요했습니다. 여기서 우리는 신경돌기 단편 검출을 위해 가장 일반적으로 인용되는 매개변수인 20–10,000 픽셀을 보고합니다(Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin and Cho, 2020), 그 결과 뉴런 조각의 상당 부분이 감지되지 않습니다. 신경돌기 단편 검출을 위한 최소 크기 기준을 줄이면 단편 검출의 민감도가 향상되는 동시에 신경돌기 단편으로 잘못 검출되는 이미지 아티팩트 및 비신경돌기 잔해의 수가 증가합니다. 감지 민감도와 위양성 비율의 균형을 가장 잘 맞출 수 있는 매개변수를 찾기 위해 우리는 위상차 현미경 사진에서 얻은 이진화된 이미지에서 신경돌기 단편을 가장 정확하게 감지하는 것으로 10-10의 분석 매개변수를 식별했습니다.000 5~10의 매개변수000는 형광 현미경 사진에서 얻은 이진화된 이미지에서 신경돌기 조각을 가장 정확하게 감지하는 데 도움이 됩니다. 이러한 결정은 1280 1024의 이미지 해상도를 사용하여 이루어졌지만 이러한 매개변수는 일반적인 전체 화면 해상도인 {{ 27}}, 그러한 이미지에 묘사된 뉴런은 비슷한 픽셀 크기를 갖기 때문입니다.
수많은 연구 그룹에서는 신경돌기 조각 측정에 작은 비신경돌기 파편이 포함되는 것을 방지하기 위해 입자 분석 매개변수를 구성할 때 최소 크기 기준을 사용해 왔습니다(Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki 외, 2016; Li 외, 2017; Loreto 외, 2020; Shin 및 Cho, 2020; Sundaramoorthy 외, 2020). 그러나 이러한 연구에서는 전체 신경돌기 영역의 측정에 작은 비조각 물질이 잘못 포함되었습니다. 왜냐하면 이러한 측정은 이미지의 모든 검은색 픽셀 영역을 합산하여 얻어지기 때문입니다. 여기에서는 DI 분석 전에 이미지에서 조각이 아닌 작은 잔해를 제거하는 Particle Remover 플러그인의 유틸리티를 보여줍니다. 플러그인을 활용하면 위상차 이미지에서 얻은 신경돌기 변성 측정의 감도가 크게 향상되었습니다. 따라서 우리의 결과는 위상차 현미경 사진을 사용하여 DI 분석을 수행하는 연구자를 위한 Particle Remover 플러그인의 가치를 강조합니다. 흥미롭게도, 형광 현미경 사진은 덜 작고 비신경돌기 잔해를 특징으로 하므로 단편 검출에 5픽셀이라는 더 낮은 크기 기준을 사용할 수 있습니다. 크기가 5픽셀 미만인 비신경돌기 파편의 입자 제거는 형광 현미경 사진에서 얻은 DI 측정에 큰 영향을 미치지 않았지만 이러한 작업은 이론적으로 더 정확한 값을 제공하므로 ANDI에 포함되었습니다.
DI 분석은 신경돌기만을 특징으로 하는 이미지를 사용하여 수행되어야 하기 때문에 분석 방법의 적용은 주로 세포체를 물리적으로 절제할 수 있는 체외이식편 배양과 같이 세포체 제거가 가능한 배양 시스템과 함께 사용하는 것으로 제한되었습니다(Catenaccio et al. , 2017; Shin and Cho, 2020) 또는 체세포와 축삭 구획의 분리를 촉진하는 미세유체 장치에서의 배양(Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). 또는 해리된 배양물을 사용하여 DI 분석을 수행하는 것은 현미경 사진에서 세포체를 디지털 방식으로 제거하는 것과 관련된 지루하고 시간 소모적인 노동을 통해 달성할 수 있습니다(Kraemer et al., 2014). 현재 연구에서 우리는 ANDI가 2D 배양 시스템에 걸쳐 해리되고 모자이크 방식으로 분포된 LUHMES 세포를 특징으로 하는 현미경 사진에서 DI 측정 성능을 가능하게 한다는 것을 밝힙니다. 우리의 연구 결과는 또한 ANDI가 분석을 수행하는 데 필요한 시간을 24-배 단축시키고, 체세포 제거와 관련된 ANDI의 작업이 다음을 사용하여 수동 체세포 제거 후 수행된 유사한 분석과 98% 상관관계가 있는 DI 분석 결과를 제공한다는 것을 보여줍니다. ImageJ의 자유형 도구입니다. 따라서 매크로는 정확성을 희생하지 않는 프로세스를 통해 자동화된 소마 제거를 수행하여 분석의 효율성을 실질적으로 높이고, 이러한 작업은 모자이크로 분포된 세포체로 해리된 배양물을 분석하는 방법의 적합성을 확장합니다.
ANDI는 이미지에서 자동 세포체 제거를 용이하게 하는 것 외에도 형광 현미경 사진 사용, 입자 분석 매개변수 수정, 작은 비신경돌기 잔해 제거를 위한 입자 제거제 활용 등 DI 분석을 수행하는 기존 방법에 대한 몇 가지 수정 사항을 제공합니다. 이미지에서. 우리의 연구 결과는 이러한 최적화가 맹검 및 대상 채점을 통해 얻은 값에 더 가까운 DI 값을 집합적으로 생성한다는 것을 나타냅니다. 따라서 분석을 수행하는 데 필요한 시간을 크게 줄이는 것 외에도 ANDI는 기존 방법에 비해 연구자가 정성적 이미지 분석에서 관찰한 신경돌기 변성을 더 정확하게 반영하는 DI 측정을 용이하게 합니다.
DI 분석을 수행하는 기존 방법의 한 가지 단점은 사용자가 지루한 ImageJ 작업 세트에 익숙해지도록 ImageJ 사용에 대한 교육이 필요하다는 것입니다. 또한 분석을 효율적으로 수행하려면 사용자가 일괄 분석을 수행하거나 특정 단계의 실행을 반자동화하는 스크립트를 작성하는 데 대한 추가 교육이 필요합니다. 분석을 완전히 자동화함으로써 ANDI는 매크로 다운로드 및 실행과 관련된 몇 가지 단계만으로 DI 측정을 용이하게 합니다. 사용자 편의성을 높이기 위해 매크로에는 분석할 이미지가 포함된 디렉터리를 선택하기 위한 인터페이스를 제공할 뿐만 아니라 사용자가 선택한 디렉터리에 대한 결과 이미지 및 데이터 테이블의 출력을 용이하게 하는 코드가 포함되어 있습니다. 또한 스크립트에는 이전 ImageJ 결과의 자동 삭제를 포함하여 측정 부정확성이나 사용자 실수를 방지하도록 설계된 다양한 기능이 포함되어 있습니다. 픽셀 단위를 사용하여 측정이 정확하게 수행되도록 이미지 스케일 정보를 제거합니다. ImageJ 색상 설정, 측정 설정 및 입자 분석기 매개변수의 적절한 구성 사용자가 b III-튜불린 염색 및 DAPI 염색을 묘사하는 동일하지 않은 수의 이미지가 포함된 디렉토리를 잘못 선택한 경우 오류 메시지 표시 분석 진행 상황을 나타내는 로그 설명 Windows 10의 자동화된 .ini 파일 생성과 관련된 버그를 방지하기 위한 코딩. 전체적으로 이러한 기능은 DI 분석을 더욱 사용자 친화적으로 만들어 신경돌기 변성과 관련된 연구에 대한 관심을 불러일으킬 수 있습니다.
실험에서 그 유용성을 입증하기 위해 ANDI를 사용하여 6-OHDA에 노출된 LUHMES 세포 배양에서 신경돌기 변성에 대한 JNK의 기여도를 평가했습니다. JNK는 비영장류 기원의 말초 뉴런에서 신경돌기 변성의 핵심으로 보고된 스트레스 활성화 키나제이지만(Shin et al., 2012), 중뇌 인간 세포의 신경돌기 변성에 있어서 키나제의 역할을 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. . 여기에서 우리는 JNK의 억제가 산화 스트레스와 관련된 신경돌기 변성으로부터 인간 중뇌 세포를 크게 보호한다는 것을 입증합니다. 이러한 발견은 인간 질병 모델과 관련된 신경돌기 변성에서 JNK의 중요한 역할을 밝힐 뿐만 아니라 새로운 과학적 발견을 위해 자동화되고 객관적인 이미지 분석을 수행하는 ANDI의 유용성을 예시합니다.
ANDI는 처음에 6-OHDA에 노출된 분화된 LUHMES 세포 배양에서 신경돌기 변성의 신속하고 정확한 측정을 용이하게 하도록 설계되었지만, 우리의 연구 결과에 따르면 이 매크로는 다음과 같은 다른 원인에 의해 유발된 신경돌기 변성을 감지하는 데에도 사용될 수 있습니다. 과산화수소 노출 또는 뉴로트로핀 금단. 또한 매크로 버전 1.1에는 조사자가 특정 크기의 뉴런에 대한 소마 제거 작업을 사용자 정의할 수 있는 대화 상자가 있습니다. 우리의 데이터는 또한 b III-tubulin에 대한 면역 표지 이외의 염색 방법이 신경돌기 변성의 정확한 측정에 사용될 수 있음을 뒷받침합니다. 이전에 테스트되지 않은 세포 유형 또는 염색 방법과 함께 ANDI를 사용할 때 DI 측정의 정확성을 확인하기 위해 파일럿 연구를 사용하는 것이 좋지만, 이러한 발견은 매크로가 배양된 뉴런에서 신경돌기 변성을 측정하기 위한 일반적으로 다용도 도구임을 뒷받침합니다. ANDI는 조직의 신경돌기 변성을 측정하는 데 최적화되어 있지 않기 때문에 현재 배양된 세포와 관련된 신경돌기 변성을 분석하는 데에만 사용을 권장합니다. 그러나 ANDI용 코드는 공개적으로 사용 가능하므로 생체 내 연구 또는 기타 응용 프로그램에 맞게 스크립트를 수정하는 데 관심이 있는 조사자에게도 유용할 수 있습니다.
결론적으로, 이 기사는 신경돌기 퇴행을 정량화하기 위해 널리 사용되는 방법과 관련된 일반적인 오류 원인을 밝히는 데이터를 제시합니다. 방법을 개선하기 위해 실험적 접근법이 사용되었으며, 이러한 개선 사항은 신경돌기 변성에 대한 형광 현미경 사진의 신속하고 정확하며 객관적인 분석을 수행하는 데 사용할 수 있는 무료 오픈 소스 ImageJ 매크로에 통합되었습니다. 우리의 연구 결과는 PD의 세포 배양 모델을 묘사하는 현미경 사진에서 신경돌기 변성을 정량화하기 위한 ANDI의 효능을 밝힐 뿐만 아니라 매크로가 다른 생물학적 맥락과 관련된 신경돌기 변성을 검출할 수 있다는 원리에 대한 증거를 제공합니다. 사용자 친화적인 매크로는 조사자가 신경돌기 단편화를 정량화하는 방법을 배우는 데 필요한 시간을 줄이는 동시에 신경돌기 변성의 기본 요인을 평가하는 연구의 처리량과 정확성을 높일 것입니다. ANDI 매크로는 다음 URL에서 사용할 수 있습니다: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.
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