파킨슨병의 체외 모델에서 향상된 정확성과 효율성을 갖춘 신경돌기 변성의 정량화 1부

추상적인

신경돌기 퇴행은 알츠하이머병, 파킨슨병(PD), 근위축성 측삭 경화증과 같은 신경퇴행성 장애의 초기 단계와 관련이 있습니다. 신경돌기 변성을 분석하는 데 일반적으로 사용되는 한 가지 방법은 배양된 세포의 현미경 사진에서 신경돌기 조각을 감지하기 위해 ImageJ의 입자 분석 도구를 활용한 후 퇴행 지수(DI)를 계산하는 것입니다. 그러나 DI 분석은 여러 유형의 측정 오류가 발생하기 쉽고 수행하는 데 시간이 많이 걸리며 적용이 제한됩니다.

신경변성은 뉴런 내부 또는 주변에서 일어나는 변화를 말하며, 이는 인간의 인지 기능, 지능, 감정, 행동 등에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 사람들은 신경변성이 기억력 저하와 밀접한 관련이 있다고 생각하지만 그렇지 않을 수도 있습니다.

첫째, 신경퇴행이 반드시 나이가 들수록 기억력이 감퇴된다는 의미는 아닙니다. 어떤 사람들은 좋은 기억력을 유지하고 심지어 정의를 이해할 수도 있습니다. 사람의 기억력은 운동, 식습관, 생활습관 등의 요인들이 복합적으로 영향을 미치기 때문입니다.

둘째, 인간의 뇌는 새로운 신경 연결을 재설정하고 새로운 기억을 형성할 수 있는데, 이를 가소성이라고 합니다. 나이에 관계없이 뇌는 끊임없이 학습하고 새로운 기억을 형성합니다. 따라서 신경변성은 단순히 뇌의 자연스러운 변화일 뿐 반드시 기억력이 저하된다는 의미는 아닙니다.

마지막으로, 낙관적인 태도를 유지하는 것도 사람의 기억력을 향상시킬 수 있습니다. 걱정과 스트레스는 뇌에 부정적인 영향을 미쳐 기억 상실로 이어질 수 있습니다. 긍정적인 태도는 뇌 건강을 촉진하고 기억력과 인지 능력을 향상시킬 수 있습니다.

요약하면, 신경퇴행이 반드시 기억 상실로 이어지는 것은 아니며, 삶에 대한 낙관적인 태도는 우리가 좋은 기억력과 인지 능력을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러므로 우리는 뇌 건강과 기억력을 유지하기 위해 낙관적인 태도를 유지하고 운동, 식습관, 생활습관 관리를 강화해야 한다. 기억력을 향상시켜야 함을 알 수 있습니다. Cistanche는 또한 아세틸콜린 및 성장 인자 수치를 높이는 등 신경 전달 물질의 균형을 조절할 수 있기 때문에 기억력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 물질은 기억과 학습에 매우 중요합니다. 또한 고기는 혈류를 개선하고 산소 전달을 촉진하여 뇌에 충분한 영양과 에너지를 공급하여 뇌의 활력과 지구력을 향상시킬 수 있습니다.

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여기에서는 DI 분석을 수행하는 향상된 방법을 설명합니다. 신경돌기 단편 검출을 위한 선택 기준 수정, 영상에서 영상 아티팩트 및 비신경돌기 물질 제거, 영상 대비 최적화를 통해 측정 정확도가 향상되었습니다. 이러한 향상된 기능은 여러 이미지에 대한 신속하고 완전 자동화된 DI 분석을 가능하게 하는 ImageJ 매크로에 구현되었습니다. 매크로는 현미경 사진에서 세포체를 자동으로 제거하는 작업을 제공하므로 해리된 배양과 관련된 실험에 사용할 수 있도록 DI 분석의 적용 범위가 확대됩니다.

우리는 기존 방법과 비교하여 향상된 분석 방법이 향상된 정확도로 측정을 수행하고 수행하는 데 훨씬 적은 시간이 필요하다는 것을 뒷받침하는 실험 결과를 제시합니다.

또한 인간 중뇌 세포의 산화 스트레스에 의해 유발된 신경돌기 변성에 대한 c-Jun N 말단 키나제(JNK)의 효과를 밝히는 실험을 수행하여 PD의 세포 배양 모델에서 신경돌기 변성을 조사하는 방법의 유용성을 입증합니다. 이 개선된 분석 방법은 신경돌기 변성과 신경변성 장애의 진행을 뒷받침하는 요인에 대한 새로운 통찰력을 얻는 데 사용될 수 있습니다.

키워드:

축삭 변성; 퇴행지수; 신경돌기 변성; 신경변성; 산화 스트레스; 파킨슨 병.

의의 설명

신경돌기 퇴행은 여러 유형의 신경퇴행성 장애의 초기 단계와 관련된 세포 사건입니다. 신경돌기 변성을 조절하는 분자적 요인은 여전히 잘 이해되지 않고 있으며, 신경돌기 변성을 연구하는 기존 방법은 적용 및 효율성이 제한되어 있습니다. 여기에서는 측정 오류를 줄이는 신경돌기 변성을 분석하기 위해 널리 사용되는 절차에 대한 수정 사항을 식별합니다.

이러한 방법론적 향상은 ImageJ 매크로에 통합되어 대규모 현미경 사진 세트를 사용하여 신경돌기 변성의 신속하고 완전 자동화된 분석을 촉진했습니다. 파킨슨병(PD)의 세포 배양 모델을 사용하여 매크로가 해리된 배양과 관련된 실험에 대한 분석 방법의 적합성을 확장하면서 보다 정확하고 효율적인 신경돌기 변성 측정을 촉진한다는 것을 보여줍니다.

소개

신경돌기 변성은 축색돌기 또는 수상돌기가 점진적인 기능 장애 및 형태학적 변화를 겪어 신경돌기 완전성이 상실되는 세포 과정입니다. 신경돌기 변성은 중추신경계 발달 중 신경망의 적절한 확립에 중요한 진화적으로 보존된 과정입니다(Neukomm and Freeman, 2014).

그러나 이 과정은 기계적 손상이나 화학요법에 사용되는 약물에 대한 노출과 같은 다양한 형태의 부상에 반응하여 촉발되기도 합니다(Salvadores et al., 2017). 더욱이, 신경돌기 변성은 알츠하이머병, 파킨슨병(PD), 헌팅턴병 및 근위축성 측삭 경화증을 비롯한 다양한 연령 관련 신경퇴행성 장애의 진행과 관련이 있습니다.

흥미롭게도, 이러한 모든 신경퇴행성 장애에 대해 축적된 증거는 신경돌기 퇴행이 신경 세포 사멸이나 임상 증상의 시작에 앞서 핵심적인 초기 단계 사건임을 시사합니다(Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert and Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). 따라서, 이 세포 과정을 조절하는 요인을 탐구하는 연구는 다양한 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 새로운 목표를 밝힐 수 있습니다.

신경돌기 변성을 조사하는 것은 α-시누클레인을 함유한 단백질 응집체의 축적, 흑색질 치밀부(SNpc)의 도파민성 뉴런의 점진적인 손실, 다양한 운동 및 인지 증상의 발생을 특징으로 하는 질병인 PD를 이해하는 데 특히 중요합니다. (Aarsland 외, 2017).

사후 및 인간 영상 연구의 증거에 따르면 α-시누클레인 응집체는 세포체보다 신경 섬유에 더 풍부하고 도파민 축삭의 분해는 임상 발병으로 이어지는 기간 동안 SNpc의 도파민 신경 세포의 손실보다 더 많이 발생합니다 (Tagliaferro 및 Burke, 2016).

도파민성 신경돌기의 진행성 악화에 기여하는 분자 상호작용은 불완전하게 이해된 채로 남아 있지만, 최근 증거에 따르면 신경돌기 퇴행은 신경세포 사멸의 기초가 되는 신호 전달 계통과 무관한 사건에 의해 매개될 수 있음이 나타납니다(Fukui, 2016; Geden 및 Deshmukh, 2016). 따라서 신경돌기 변성의 생리학적 토대를 직접 평가하는 연구는 초기 PD 진행을 방해하는 치료법 개발에 중요합니다.

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신경변성 질환의 진행에서 신경돌기 변성이 중심 역할을 한다는 증거에 대응하여, 배양된 뉴런의 현미경 사진을 사용하여 신경돌기 변성을 측정하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 예를 들어, 감소된 신경돌기 수 또는 길이를 감지하는 소프트웨어를 사용하여 신경돌기 변성을 측정하기 위한 여러 가지 방법이 확립되었습니다(Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

그러나 이러한 방법은 신경돌기 단편화를 직접 평가하지 않기 때문에 신경돌기 변성에 대한 변수의 영향을 결정하기 위한 결과의 해석은 신경돌기 성장에 대한 변수의 잠재적 영향으로 인해 혼란스러울 수 있습니다. 특정 연구 그룹에서는 형태학적 특징과 명백한 단편화 정도를 기반으로 신경돌기의 이미지를 주관적으로 점수를 매김으로써 신경돌기 변성을 측정했습니다(Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). 그러나 이 대체 방법은 시간이 많이 걸리고 조사자 오류가 발생할 수 있습니다.

신경돌기 단편화의 객관적이고 직접적인 측정을 용이하게 하는 한 가지 방법은 ImageJ의 입자 분석 알고리즘을 사용하여 배양된 세포의 현미경 사진에서 신경돌기 단편의 면적을 측정하는 것입니다. 측정값은 신경돌기 변성 정도를 반영하는 {{0}}.0과 1.0 사이의 척도인 퇴화 지수(DI)를 계산하는 데 사용됩니다(Sasaki et al., 2009).

DI 분석은 다양한 정도의 신경돌기 단편화를 감지하는 데 사용될 수 있지만 측정의 정확도는 일반적으로 여러 오류 원인에 의해 제한되며 이 방법의 적용은 주로 구획화된 미세 유체 장치에서 성장한 이식편 배양 또는 세포로 제한되었습니다. 더욱이 DI 분석은 대규모 이미지 세트로 추정할 때 시간이 많이 걸립니다. 따라서 우리는 DI 분석 절차를 수정하여 정확성과 효율성을 높이고 적용성을 확대함으로써 이러한 한계를 극복하려고 했습니다.

본 연구에서 우리는 DI 분석과 일반적으로 관련된 몇 가지 오류 원인을 식별하고 다양한 형태의 오류를 줄이는 방법론적 개정을 보고합니다. 우리는 ANDI(자동 신경돌기 퇴화 지수)라는 ImageJ 매크로에 절차적 개선 사항을 통합하여 대규모 이미지 세트에서 DI 분석을 완전히 자동화했습니다. ANDI 매크로를 작동하려면 오픈 소스이고 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어와 파일만 필요합니다. ANDI를 사용하여 얻은 측정값은 분석 수행에 필요한 시간을 크게 줄이면서 정확도를 높이는 이점을 제공합니다.

또한 구획화 없이 성장한 해리된 세포를 포함하는 PD의 세포 배양 모델에서 신경돌기 변성의 정확하고 신속한 측정을 수행하기 위해 새로운 분석 방법을 적용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 종합적으로, 이러한 방법론적 향상은 신경퇴행과 관련된 중요한 세포 과정의 기초가 되는 요인에 대한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다.

재료 및 방법

세포 배양

Lund 인간 중뇌(LUHMES) 세포의 배양은 폴리-L-오르니틴(PLO) 및 피브로넥틴, 폴리-D-라이신(PDL) 및 라미닌으로 코팅된 Lab Tek II 8웰 챔버 슬라이드에서 확립되었습니다. 4개의 기질 모두 또는 전혀 코팅되지 않았습니다. 표시된 대로 기판. PLO 및 피브로넥틴으로 코팅하기 위해 슬라이드를 200mg/ml PLO(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #P3655)가 포함된 용액과 함께 실온에서 밤새 배양했습니다.

멸균수(Avantor)로 세척한 후 슬라이드를 2 mg/ml 피브로넥틴(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #F0895)과 함께 37도에서 3시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 멸균 PBS(Corning Life Sciences, 카탈로그 #21-040-CV)로 세척하고 공기 건조시켰습니다. PDL과 라미닌으로 코팅하기 위해 슬라이드를 100ng/ml PDL(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #P7280) 및 10mg/ml 라미닌(Corning, 카탈로그 #354232)을 함유한 용액과 함께 실온에서 배양했습니다.

밤새 인큐베이션한 후, 슬라이드를 멸균 PBS로 세척하고 공기 건조시켰습니다. 4개의 기판을 모두 코팅하기 위해 앞서 언급한 절차를 순차적으로 수행했습니다. LUHMES 세포(ATCC, RRID: CVCL_B056)를 2mM 글루타민(VWR)이 보충된 DMEM/F12(Invitrogen, 카탈로그 #11330057)로 구성된 분화 배지에 표시된 밀도로 코팅된 챔버 슬라이드에 플레이팅했습니다. 1%(v/v) N-2 보충제, 1 mg/ml 테트라사이클린(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #87128-25G), 1 mM N6,29-오디부티릴아데노신 cAMP(db-cAMP ; Enzo Life Sciences, 카탈로그 #BML-CN125-0100) 및 2ng/ml 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF; R&D Systems, 카탈로그 #212-GD-010).

달리 명시하지 않는 한, 모든 배양물은 웰당 115,{1}} 세포의 밀도로 플레이팅되었습니다. 치료 전까지 48시간마다 50% 용량의 배지 교체를 수행했습니다. 유전적 부동을 방지하기 위해 모든 실험에는 6회 이하로 계대된 세포 스톡을 사용했습니다.

교감 신경 세포의 일차 배양과 관련된 실험은 이스턴 켄터키 대학교 또는 버지니아 대학교의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 출생 후 0-6 C56Bl/6 마우스로부터 상부 경추 신경절을 해부하고, 효소 해리 완충액에서 37도에서 배양하고, 성장 배지로 세척하여 단백질 분해 효소를 제거하고 분쇄했습니다.

세포 현탁액은 Lab Tek II 8웰 챔버 슬라이드에 웰당 7{21}}00개 세포의 밀도로 플레이팅되었습니다. 체외(DIV) 1일에 미디어를 교체한 후 격일로 미디어를 교체했습니다. 비뉴런 세포의 성장을 방지하기 위해 DIV1-DIV3에 시토신 아라비노푸라노사이드(Ara-C, Millipore-Sigma)를 배지에 보충한 다음, 표시된 대로 처리 전 최소 24시간 동안 배지에서 Ara-C를 제거했습니다. 과산화수소 처리와 관련된 Eastern Kentucky University에서 수행된 실험의 경우 챔버 슬라이드를 200mg/ml PLO(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #P3655), 2mg/ml 피브로넥틴, 100ng/ml PDL(Sigma-Aldrich, 카탈로그)로 코팅했습니다. #P7280) 및 10 mg/ml 라미닌(Corning, 카탈로그 #354232)을 사용 전 사용하고, 0.025%가 함유된 DMEM(ThermoFisher, 카탈로그 #11960- 044)으로 구성된 완충액에서 30-분 배양을 통해 해리를 수행했습니다. 트립신(Corning Life Sciences, 카탈로그 #25-053-CI) 및 0.3% 콜라게나제(Worthington Biochemical, 카탈로그 #LS004176).

이러한 실험을 위한 성장 배지는 10% 소 태아 혈청(Invitrogen, 카탈로그 #26140-079), 2mM L-글루타민(Corning, 카탈로그 #25-005-CI) 및 40ng/ml가 보충된 DMEM으로 구성되었습니다. 신경 성장 인자(Fisher Scientific, 카탈로그 번호13-257-019); 5mM Ara-C(Sigma-Aldrich)를 비뉴런 세포 제거에 사용했습니다.

NGF 철수와 관련된 버지니아 대학교에서 수행된 실험의 경우, 세포를 100ng/ml PDL(Millipore Sigma) 및 10mg/ml 라미닌(Invitrogen)으로 코팅된 챔버 슬라이드에 플레이팅하고 해리를 20-분을 통해 수행했습니다. BSA(10mg/ml, Sigma-Aldrich), 콜라게나제 유형 2(4mg/ml, Worthington Biochemical), 데옥시리보뉴클레아제 1(Millipore Sigma) 및 히알루로니다제(Sigma-Aldrich)를 함유한 DMEM/F12로 구성된 완충액에서 배양. 이러한 실험을 위한 성장 배지는 10% 소 태아 혈청(Invitrogen), 1U/ml 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen) 및 45ng/ml NGF(타액선에서 정제됨)가 보충된 DMEM으로 구성되었습니다. 비뉴런 세포 제거를 위해 10mM Ara-C를 사용했습니다.

세포치료

분화된 LUHMES 세포를 분화 배지에서 5일째에 지시된 농도의 {{0}}히드록시도파민(6-OHDA; Sigma-Aldrich, 카탈로그 #162957) 또는 비히클 용액에 노출시켰습니다. 6- OHDA 스톡은 0.02% 아스코르베이트(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #A5960)를 함유한 냉각된 PBS에서 준비되었으며, 분취량은 80도의 불활성 가스 하에서 차광된 바이알에 보관되었습니다. 24시간 처리 후, 세포를 실온에서 25분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)가 함유된 PBS에서 인큐베이션하여 고정시켰다.

산화 스트레스에 의해 유발된 신경돌기 변성에서 c-Jun N-말단 키나제(JNK)의 역할을 확인하기 위해 배양물을 10mM SP600125(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #S5567) 또는 비히클 용액으로 1시간 동안 전처리했습니다. 7.5mM 6-OHDA, 7.5mM 6-OHDA 및 10mM SP600125 또는 차량 솔루션을 포함하는 미디어로 미디어를 완전히 교체하기 전에. SP600125 스톡은 억제제를 멸균 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 제조하고, 냉동 분취량을 불활성 가스로 채워진 차광 바이알에 20도에서 보관했습니다. 세포가 0.1% 이하의 DMSO에 노출되도록 처리를 수행했습니다.

교감 신경 세포의 일차 배양물을 DIV5에서 처리했습니다. 과산화수소에 의해 유발된 신경돌기 변성과 관련된 실험의 경우, 배양물을 500mM 과산화수소(Sigma-Aldrich, 카탈로그 #H{3}}ML) 또는 멸균수로 구성된 비히클 용액(Cytiva, 카탈로그 #SH30529.02)에 노출시켰습니다. 24시간 동안.

NGF 철수와 관련된 실험의 경우, SCG 배양물은 성장 배지로 배지 교체를 받았거나 NGF 박탈을 겪었습니다. NGF가 제거된 SCG 배양물을 NGF가 없는 성장 배지로 3회 헹구고 나서 배지 변경 없이 NGF가 없는 성장 배지에서 80시간 동안 배양했습니다. 처리 후, PBS 중 4% PFA에서 30분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정시킨 다음, PBS로 헹구어 PFA를 제거했습니다.

염색 및 형광 현미경

LUHMES 세포를 사용한 실험과 과산화수소로 처리된 교감 신경 세포를 포함하는 실험의 경우 고정 세포가 포함된 8웰 챔버 슬라이드를 PBS 중 0.1% Triton X-100로 투과화하고 차단했습니다. 0.1% Triton X-100를 함유한 PBS에 10% 정상 염소 혈청을 첨가하여 1시간. 그런 다음 슬라이드를 차단 용액에서 b I 튜불린(Covance; 1:1000, RRID: AB{11}})에 특이적인 1차 항체와 함께 4도에서 밤새 배양했습니다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 세척하고 Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB{16}})에 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 90분 동안 배양한 후 추가 세척을 실시했습니다.

티로신 수산화효소(TH) 염색과 관련된 실험을 위해 슬라이드를 10% 정상 염소 혈청, 0.1% Triton X-100, TH에 특이적인 항체(Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) 밤새 4도에서. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 Alexa Fluor 568(Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB{12}})에 결합된 2차 항체와 함께 배양하고 추가 PBS 세척을 실시했습니다.

b III-튜불린 또는 TH에 대한 면역표지 완료 후, 슬라이드를 PBS 중 5 mg/ml 49,69-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 카탈로그 #D9542)과 함께 5분 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고, Fluoromount G 장착 매체(Southern Biotech, 카탈로그 #0100-01)를 사용하여 커버슬립을 장착했습니다.

NGF를 중단한 교감 뉴런과 관련된 실험의 경우 슬라이드를 5% 일반 염소 혈청(Life Technologies)과 0로 구성된 완충액에서 실온에서 인큐베이션하여 1시간 동안 차단했습니다.0005% PBS에 있는 Triton X-100를 마우스 항-마우스 Tuj1(1:1000, Covance)을 포함하는 1차 항체 용액에서 밤새 4도에서 배양합니다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 헹구고 염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 488(1:800, Invitrogen) 및 차단 완충액 중 0.1 mg/ml Hoechst 33342(Invitrogen)에서 1시간 동안 배양한 다음 추가로 PBS로 헹구고 허용했습니다. 말리다. 슬라이드를 Fluoromount-G(Southern Biotech, 카탈로그 번호0100-01)로 장착하고 실온에서 보관했습니다.

LUHMES 세포가 포함된 슬라이드는 Lumencor Mira 4-채널 LED 광원을 갖춘 Nikon Eclipse II Ti-U 도립 현미경 시스템의 20개 대물렌즈로 시각화되었습니다. 1280 1024-픽셀 이미지는 Nikon DSQi1Mc 5MP CCD 카메라 및 NIS Elements 3.22.15(빌드 738)를 사용하여 캡처되었습니다. 달리 표시된 경우를 제외하고 모든 위상차 이미지는 8-비트 이미지에서 평균 배경 강도 165를 생성하는 광도 및 노출 시간 설정을 사용하여 캡처되었습니다.

배경 음영 또는 기타 불일치를 줄이기 위해 각 현미경 검사 세션 전에 빈 웰의 이미지를 캡처하여 LUHMES 세포 이미징 중에 배경 보정에 사용했습니다. Eastern Kentucky University 또는 University of Virginia에서 배양한 교감 뉴런이 포함된 슬라이드를 각각 Zeiss LSM 800 현미경 시스템 또는 Zeiss LSM 980 현미경 시스템을 사용하여 이미지화했습니다. 이미지는 Zen 소프트웨어(Carl Zeiss Microscopy)를 사용하여 20배율 및 1024 1024 해상도로 캡처되었습니다.

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세포 생존율 분석

다양한 기질로 표시된 대로 코팅된 Lab Tek II 8웰 챔버 슬라이드에서 분화된 LUHMES 세포 배양물을 확립했습니다. 48시간마다 50% 배지 교체를 수행하였고, 분화 6일째에 PBS 중 4% PFA로 세포를 고정시켰다. 고정된 세포가 포함된 슬라이드를 DAPI로 염색하고 Nikon Eclipse II Ti-U Inverted Microscope System 및 Nikon DS-Fi1 5 MP CCD 카메라를 사용하여 핵 염색 이미지를 캡처했습니다.

눈이 먼 조사관은 핵의 모양을 기준으로 세포의 건강 여부를 점수로 매겼습니다. 핵 면적이 감소하거나 핵 분열이 있는 세포는 건강에 해로운 것으로 채점되었습니다. 이미지당 건강한 세포의 수는 각 실험에서 조건당 최소 5개의 시야에 대해 점수가 매겨졌습니다.

DI 측정

기존 DI 측정은 DI 분석을 위해 널리 인용되는 매개변수를 포함하는 방법을 통해 ImageJ 1.52p가 포함된 FIJI(Fiji Is Just ImageJ) 패키지를 사용하여 수행되었습니다(Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020). 잘 분리된 축색 돌기가 있는 차별화된 LUHMES 세포의 8비트 이미지는 기본 이진화 알고리즘을 사용하여 이진화되었으며, 이진 옵션은 전경에 검은색 세포가 있고 흰색 배경에 있는 이미지를 생성하도록 구성되었습니다.

자유형 그리기 도구를 사용하여 세포체가 포함된 모든 이미지 영역을 수동으로 추적했으며 추적된 영역에서 모든 검은색 픽셀이 흰색으로 변환되었습니다. ImageJ의 측정 도구를 적용하여 신경돌기만을 특징으로 하는 이진화된 이미지의 전체 검은색 영역을 측정했습니다. 그런 다음 신경돌기 조각을 감지하기 위해 20-10,000 픽셀의 크기 설정과 0.2-1.0의 원형도 설정을 사용하여 입자 분석 도구를 적용했습니다. 그런 다음 모든 신경돌기 조각의 합산된 영역을 전체 검은색 영역으로 나누어 이미지의 DI를 계산했습니다.

신경돌기 조각 식별을 위한 크기 매개변수의 최적화와 관련된 실험에서는 모든 입자 측정에 {{0}}.2–1.00의 원형 기준을 사용했습니다. Wayne Rasband가 개발한 Particle Remover 플러그인(버전 20{{10}}4/02/09)은 https://imagej.nih.gov/에서 얻었습니다. 표시된 경우, 위상차 현미경 사진에서 얻은 이진화된 이미지에서 작고 신경돌기가 아닌 물체를 제거하기 위해 0-9 픽셀의 크기 매개변수와 0.0-1.0의 원형 매개변수를 사용하는 입자 제거제 플러그인을 적용했습니다.

유사하게, {{0}-4 픽셀의 크기 매개변수와 0-1.0의 원형 매개변수를 사용하여 b III-튜불린 면역염색을 나타내는 형광 현미경 사진에서 얻은 이진화된 이미지에서 작은 물체를 제거했습니다. 달리 명시하지 않는 한, DI 분석 전에 모든 위상차 이미지는 ImageJ를 사용하여 최소 90에서 최대 205의 LUT(Lookup Table)를 적용하여 대비 향상을 거쳤습니다.

인공 단편화 측정

건강한 LUHMES 세포를 포함하는 배양물을 분화 6일째에 4% PFA로 고정하고 b III-튜불린에 대해 면역표지했습니다. 20개 대물렌즈를 사용하여 각각 동일한 시야를 나타내는 1280 1024-픽셀 위상차 현미경 사진과 형광 현미경 사진을 무작위로 샘플링된 영역에서 캡처했습니다. 9개의 개별 문화권에서 총 10개의 이미지 세트가 캡처되었습니다.

ImageJ는 원본 위상차 및 형광 현미경 사진의 이진화된 복사본뿐만 아니라 최소 90 및 최대 205의 LUT 적용을 통해 대비 강화 후 이진화된 위상차 현미경 사진의 복사본을 생성하는 데 사용되었습니다. 각 세트에 대해 이미지 중에서 눈이 먼 조사관은 건강하고 손상되지 않은 신경돌기를 특징으로 하는 원본 위상차 현미경 사진의 작은 150 150-픽셀 영역을 식별했습니다.

그런 다음 영역 크기와 좌표를 ImageJ의 관심 영역(ROI) 관리자에 저장하고 동일한 이미지 세트의 이진화된 이미지의 유사한 영역에서 DI 측정을 수행하는 데 사용했습니다. DI 측정은 20 -10,000 픽셀의 조각 크기 매개변수를 특징으로 하는 전통적인 방법을 사용하여 수행되었습니다. 측정된 모든 영역에는 손상되지 않은 뉴런만 포함되어 있으므로 감지된 모든 조각은 인공 조각으로 간주되었습니다.

ANDI 매크로

ANDI 매크로는 ImageJ 매크로 언어를 사용하여 작성되었습니다. 매크로에는 사용자가 세 개의 디렉터리에 대한 경로를 선택할 수 있는 일련의 작업이 포함되어 있습니다. 하나의 디렉터리에는 b III-tubulin과 같은 신경 마커에 대해 면역 표지된 뉴런의 이미지가 포함되어 있고, 두 번째 디렉터리에는 핵 염색을 묘사하는 해당 이미지가 포함되어 있으며, 세 번째 디렉터리에는 결과 파일을 저장하도록 지정되었습니다. 선택한 디렉터리에 있는 이미지의 조각 영역과 총 신경돌기 영역은 일련의 ImageJ 작업을 통해 계산됩니다. 간단히 말해서, 핵 라벨링을 묘사한 이미지가 열리고 대비 향상이 적용되어 이진화됩니다. 입자 제거 플러그인은 이진화된 이미지에서 핵이 아닌 작은 아티팩트를 제거하는 데 사용되며, 이진화된 이미지는 일련의 팽창과 침식을 받습니다.

b III-튜불린(또는 다른 신경 마커)에 대해 면역 표지된 세포의 해당 이미지가 열리고 대비 강화가 적용됩니다. 확대된 세포 핵을 묘사하는 이진화된 이미지는 b III-튜불린에 대해 면역 표지된 세포를 특징으로 하는 이미지에서 제외되어 신경돌기만을 특징으로 하는 이미지를 생성합니다. 그런 다음 신경돌기 이미지를 이진화하고 0와 4픽셀 사이의 입자를 제거합니다. 신경돌기 조각 영역은 원형도가 0.2에서 1.0 사이이고 크기가 5에서 10,0000 픽셀 사이인 입자를 측정하기 위해 Analyze Particle 알고리즘을 적용하여 계산됩니다. 총 신경돌기 면적은 측정 도구를 적용하여 총 검은색 면적을 계산하여 계산됩니다. 강조 표시된 조각으로 이진화된 신경돌기 영역을 묘사한 이미지는 조각화된 신경돌기 영역 및 전체 신경돌기 영역 측정값을 보고하는 .csv 파일과 함께 사용자가 지정한 디렉터리에 저장됩니다.

앞서 언급한 작업 외에도 사용 편의성을 지원하고 사용자 오류를 제한하기 위해 몇 가지 추가 작업이 매크로에 포함되어 있습니다. 여기에는 이미지에서 크기 정보를 제거하고 측정값이 픽셀 단위로 얻어지도록 하는 기능이 포함됩니다. 적절한 이미지 빼기 및 이진화를 위해 ImageJ 색상 설정 및 이진 옵션을 구성합니다. b III-tubulin 염색 및 DAPI 염색 이미지용으로 선택한 디렉터리에 동일한 수의 이미지가 포함되어 있는지 확인합니다. 처리 시간을 향상시키기 위해 이전에 사용된 이미지를 닫습니다. 새로운 분석을 수행하기 전에 이전 분석의 명확한 결과; Windows 10에서 .ini 파일 생성과 관련된 오류를 방지합니다.

교감 뉴런 분석과 관련된 실험의 경우 ANDI 매크로는 사용자가 핵의 이진화 이미지가 확장되는 횟수를 제어할 수 있는 대화 상자를 제공하는 작업을 포함하도록 수정되었습니다. 이 개정판을 포함하는 ANDI 버전을 ANDI v1.1이라고 합니다. 대화 상자의 값을 높은 숫자로 변경하면 체세포 제거 크기가 증가하고, 값을 낮은 숫자로 변경하면 체세포 제거 크기가 감소합니다. 기본값은 12이며, 이는 LUHMES 세포와 관련된 모든 실험에 사용되는 확장 횟수입니다. 교감 신경 세포를 분석하는 동안 더 큰 세포체 영역을 제거하기 위해 값 16이 사용되었습니다.

ANDI 매크로는 오픈 소스이며 다음 URL을 통해 무료로 사용하거나 수정할 수 있습니다: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. ANDI의 정확한 작동은 Windows 10 운영 체제를 갖춘 여러 대의 개인용 컴퓨터를 사용하여 검증되었습니다. 다양한 정도의 신경돌기 변성을 나타내는 LUHMES 세포 배양을 특징으로 하는 이미지 세트도 앞서 언급한 웹 주소에서 사용할 수 있으며 다른 유형의 컴퓨터에서 매크로의 정확한 실행을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 웹 주소는 매크로 사용 방법을 설명하는 프로토콜에 대한 액세스도 제공합니다.

예상 시간

DI 측정을 수동으로 수행하는 데 필요한 시간을 평가하기 위해 비히클 용액, 2.5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA 또는 7.5mM 6-OHDA에 대해 이전에 확립된 방법을 사용하여 DI 점수를 매겼습니다(Kraemer et al., 2014). 각 이미지에는 대비 향상 및 이진화가 적용되었습니다. 그런 다음 ImageJ의 자유형 도구를 사용하여 이진화된 이미지에서 묘사된 모든 세포체를 디지털 방식으로 제거했습니다. Analyze Particle 도구는 원형도가 0.2~1.0이고 크기가 20~10,000 픽셀인 조각을 측정하는 데 사용되었으며, 측정 도구를 사용하여 전체 신경돌기 영역을 결정했습니다.

단편화된 신경돌기 영역과 총 신경돌기 영역에 대한 값을 Microsoft Excel의 스프레드시트로 전송하고 Excel의 수학적 연산을 사용하여 DI 점수를 계산했습니다. ImageJ를 사용하여 이미지를 연 후 이러한 각 절차를 수동으로 수행하는 데 필요한 시간을 측정했습니다. 평균 분석 시간은 총 36개의 이미지에서 계산되었습니다. 이미지는 9개의 독립적인 세포 배양 준비물에서 얻었으며, 각 세포 배양 준비물에서 처리 조건당 하나의 이미지를 사용하여 분석을 수행했습니다. ANDI 매크로를 사용하여 수행된 DI 측정 속도를 결정하기 위해 동일한 이미지 세트를 사용하여 ImageJ에서 매크로를 열고, 매크로 작업을 실행하고, 데이터를 Excel 스프레드시트로 전송하고, DI를 계산하는 데 필요한 시간을 결정했습니다.

통계

정량적 비교는 상자 및 수염 플롯으로 표시됩니다. 여기서 중간 선은 중앙값을 나타내고 상자는 25번째 및 75번째 백분위수까지 확장되며 수염은 5번째 및 95번째 백분위수를 나타냅니다. 평균은 GraphPad Prism 9.1.2에서 Sidák 보정을 사용한 사후 비교를 통한 반복 측정 ANOVA를 통해 통계적으로 비교되었습니다. 정량적 데이터의 정규성은 IBM SPSS 26의 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 테스트되었습니다.

정규성 가정이 위반된 경우(그림 1C, 3D), 그룹 비교는 비모수 프리드먼 테스트를 통해 수행되었으며 Dunn 테스트는 사후 비교를 위해 수행되었습니다. 상관 분석은 산점도로 표시되며 가장 적합한 선을 포함합니다. 이러한 관계는 정규성 가정이 위반되는 경우 Pearson product-moment 상관관계 또는 Spearman의 r을 사용하여 분석되었습니다. 상관 분석을 위한 잔차의 정규성은 해당 QQ 플롯의 육안 검사를 통해 평가되었습니다.

Pearson 곱적률 상관계수는 Steiger의 점근적 z-검정을 사용하여 서로 비교되었습니다(Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). 이상값은 제외되지 않았습니다. 통계적 유의성은 p, 0.05에서 인정되었습니다. P-값은 소수점 네 자리까지 반올림되어 본문 전반에 걸쳐 보고됩니다. 모수적 분석을 위해 효과 크기와 95% 신뢰 구간도 보고되며, 효과 크기는 본문 전체에 설명되어 있으며 신뢰 구간은 표 1에 나열되어 있습니다.

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