정량적 단백질체학 연구를 통해 다낭성 간 질환에서 피브리노겐 경로가 밝혀졌습니다 2
Nov 22, 2023
3. 결과
3.1. 신장과 간은 동일한 낭성 메커니즘을 따르지 않습니다.
이전 연구에 따르면 Pkd1 유전자(p12 이전)의 조기 불활성화는 다낭성 질환(낭성 창)의 급속한 발달을 유발하는 반면, p14 이후의 불활성화는 4~5개월 후 후기 낭종 형성으로 이어지며 경미한 표현형(비낭성 창)을 나타내는 것으로 나타났습니다. [19]. ADPKD(Pkd1cond/cond; Tam-Cre)의 동일한 이종 모델을 사용하여[18,19], 우리는 이 신장 발달 창이 유사한 간 발달 창과 시간적으로 일치하는지 여부를 조사했습니다. 이전 연구와 직접 비교하기 위해[37], 출생 후 14일(p14) 및 12일(p12)에 Pkd1 유전자를 비활성화하기 위해 타목시펜으로 마우스를 유도하고 30일(p30)에 희생시켰습니다. 흥미롭게도 우리는 질병의 정도(경증 및 중증)가 다른 두 시점에서 낭성 표현형을 관찰했는데, 이는 신장과 간이 독립적인 낭성 발달 창(그림 1a) 및/또는 질병의 시기와 진행이 다를 수 있음을 시사합니다. . 두 비활성화 창 사이에서 이 도살 연령에서 수컷과 암컷 사이에는 차이가 발견되지 않았습니다(n{20}}은 각 돌연변이 그룹에 사용되었습니다). p14 돌연변이 동물은 ALP 혈청 값에 따라 낭성 지수, 낭종 수 및 간 기능 값이 낮은 p12 돌연변이 그룹보다 더 온화한 표현형을 나타 냈습니다 (그림 1b-d). 이는 Pkd1 간 및 신장 결핍에 대한 다양한 발달 창/메커니즘을 보여주는 최초의 연구입니다. 이러한 분자적 차이는 향후 연구에서 결정되어야 합니다.
그림 1. 3일차0 p12 및 p14 단계의 낭포성 간 표현형 특성 분석. p12에서의 Pkd1 결실은 더 심각한 방광 형성을 운반합니다. (a) Pkd1cond/cond, Tam-Cre 마우스 야생형(WT, Pkd1cond/cond, Tam-Cre-) 및 돌연변이(KO, Pkd1cond/cond, Tam-Cre+)의 간에서 염색된 헤마톡실린-에오신의 대표적인 거시적 및 현미경 이미지 ) 출생 후 14일(p14 그룹) 및 12일(p12 그룹)에 타목시펜에 의해 유도된 Pkd1 유전자 결실이 있습니다. 모든 마우스는 p30에서 희생되었습니다. 스케일 바, 2mm(상부 패널) 100 µm(하부 패널). n은 그룹당 샘플 수를 나타내고, Bd는 담관을 의미합니다. ( b, c ) 간 낭성 지수 및 다양한 표현형의 낭종 수. ( d, e ) 혈청 ALP 및 ALT 값. 막대는 모든 경우에 평균 ± SEM을 나타냅니다. Student's t-test(two-tail)에 의한 p < 0.05를 유의미한 결과로 간주했습니다. ns는 중요하지 않음을 나타냅니다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
3.2. PLD의 Shotgun 및 SWATH-MS 단백질체학 분석
그림 2에서 볼 수 있듯이, 야생형(WT) 동물과 비교하여 Mutants(KO)의 낭성 단계(p12 - 중증 낭성 질환 및 p14 - 경미한 낭성 질환)에서 감별 프로테옴 분석을 수행했습니다. 간 방광생성과 질병 진행을 겪는 관련 분자 메커니즘을 특성화합니다.
그림 2. 그림으로 표시된 워크플로 구성표. 우리는 출생 후 10일(p10) 및 p11(빠른 질병 진행) 또는 p15 및 p16(지연된 질병 진행)에 타목시펜 투여에 의해 Pkd1의 유전적 불활성화가 유도된 ADPKD 쥐 모델(Pkd1cond/cond; Tam‐Cre 마우스)을 사용했습니다. ) 신장 방광 형성에 대한 발달 스위치에 따라 각각 p12와 p14라는 연구의 두 그룹을 정의합니다 [19]. 두 그룹 모두에 대해 각 조건에서 6마리 이상의 야생형(WT) 및 돌연변이(KO) 개체를 사용했으며 모든 동물은 p30에서 희생되었습니다. 우리는 정량적 단백질체학 SWATH-MS와 샷건 데이터 의존적 획득 DDA-MS 분석을 모두 사용하여 간 낭성 질환의 두 가지 중증도(그림 1)에서 WT와 KO 간의 차등 단백질체를 연구했습니다. 풍부함에 있어 상당한 변화가 있는 단백질 중에서 생물정보학을 사용했습니다. 그림 2. 예시된 작업 흐름 체계. 우리는 출생 후 10일(p10) 및 p11(빠른 질병 진행) 또는 p15 및 p16(지연된 질병 진행)에 타목시펜 투여에 의해 Pkd1의 유전적 불활성화가 유도된 ADPKD 쥐 모델(Pkd1cond/cond; Tam-Cre 마우스)을 사용했습니다. ) 신장 방광 형성에 대한 발달 스위치에 따라 각각 p12와 p14라는 연구의 두 그룹을 정의합니다 [19]. 두 그룹 모두에 대해 각 조건에서 6마리 이상의 야생형(WT) 및 돌연변이(KO) 개체를 사용했으며 모든 동물은 p30에서 희생되었습니다. 우리는 정량적 단백질체 SWATH-MS와 샷건 데이터 의존적 획득 DDA-MS 분석을 모두 사용하여 간 낭성 질환의 심각도(그림 1)에서 WT와 KO 간의 차등 단백질체를 연구했습니다. 풍부함이 크게 변화한 단백질 중에서 우리는 생물정보학 도구를 사용하여 질병과 관련된 새로운 치료 표적과 경로를 탐지했습니다. 마지막으로 우리는 먼저 in silico(DDA 대 SWATH 분석)를 사용하고 마지막으로 in vivo 전략과 RT-qPCR, Western blotting 및 면역조직화학을 사용하여 이러한 표적을 검증했습니다. p는 출생 후의 날을 의미합니다.
간 방광 형성의 단백질 발현 패턴 먼저, 샷건 데이터 의존적 획득 DDA-MS 또는 DDA를 통해 단백질체 질량 분석을 수행했습니다. 이 분석을 통해 전체 샘플과 개별 샘플에서 프로테옴을 특성화할 수 있으며 정량화 없이 단백질의 존재 여부를 높은 감도로 제공할 수 있습니다. 우리는 야생형 및 돌연변이 개체의 p14 및 p12 단계에 대해 총 6개 샘플 중 5개 이상의 독립적 샘플에서 차별적으로 발현된 모든 단백질을 독점적으로 고려했습니다(그림 S1). p14에서는 1개의 WT 독점(또는 질병에 대해 하향 조절) 단백질과 7개의 MUT 독점(상향 조절) 단백질이 확인되었으며, p12에서는 8개의 WT 독점 단백질과 6개의 MUT 독점 단백질이 관찰되었습니다(그림 S1).
다음으로, 차별적으로 발현된 단백질을 정량화할 수 있는 방법을 사용했습니다. 우리는 DDA에 사용한 것과 동일한 샘플에 대해 SWATH-MS 정량적 단백질체학 분석을 수행하여 샘플당 ~1500개의 단백질과 각 연구 그룹에서 2000개 이상의 단백질을 얻었습니다. 먼저, 그림 S2와 S3에 표시된 것처럼 샘플이 정규 분포 패턴을 따르는지 평가하기 위해 TAS(총 면적 합계) 정규화를 수행했습니다. 다음으로 Wild Type과 Mutant 그룹 사이에 유의미한 차이가 있는 단백질을 연구했습니다. 표 1은 WT 대 WT에서 2배 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절) 및 유의미하게 조정된 p-값(파라메트릭 스튜던트 t-테스트에 따라)을 통해 존재비에 상당한 변화가 있는 단백질을 보여줍니다. p14 및 p12의 MUT 샘플. 전체적으로 6개의 단백질은 WT p14 그룹과 MUT-p14 그룹(5개의 상향 조절된 단백질과 1개의 하향 조절된 단백질) 사이의 단백질 풍부도에서 유의미한 차이를 보여주었습니다. WT-p12와 MUT-p12 사이에서 26개 단백질(20개 단백질은 상향 조절되고 6개 단백질은 하향 조절됨)이 유의미한 차이를 보였습니다(그림 3a 및 표 1). 그래픽적으로 이러한 변화는 -log(10) p-값에 대해 식별된 모든 단백질에 대한 로그(2)배 변화를 플로팅하여 생성된 화산 플롯을 통해 관찰할 수 있습니다(그림 3b). 단백질 풍부도 수준 간의 중요한 차이는 스펙트럼 라이브러리의 영역에 따라 개별화된 값과 클러스터 히트 맵 분석의 클러스터링 수준을 사용하여 히트 맵에서 시각화할 수 있습니다(그림 3c 및 S4). SWATH-MS 분석으로 감지된 이러한 클러스터는 정량 분석을 위해 고려되는 정성적으로 분리된 샘플을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 S5). 샘플 간 데이터를 비교하기 위해 주성분 분석(PCA)을 사용하여 감독되지 않은 다변량 통계 분석을 수행했습니다(그림 S6). 히트맵과 PCA 데이터는 두 분석 모두에서 3개의 반복이 밀접하게 클러스터되어 있기 때문에 샘플 3중 반복 사이의 재현성을 입증했습니다. PCA와 히트맵 클러스터 분석(그림 S5 및 S6)에서 일부 샘플이 올바르게 그룹화되지 않고 두 클러스터 간에 겹치는 방식을 관찰할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 야생형 및 돌연변이 클러스터에서는 데이터가 분리되는 경향을 볼 수 있습니다. p14와 p12의 유의미한 차이가 있는 더 적은 수의 단백질은 중증도의 정도에 따라 정당화될 수 있으며(그림 2), 이는 낭포성 표현형의 중증도 및 질병 상태에 따라 단백질 및 경로의 수가 증가함을 시사합니다.
3.3. PLD의 유전자 발현에 대한 클러스터링, 경로 강화 및 단백질-단백질 상호 작용 분석
SWATH-MS 분석으로 식별된 차별적으로 발현된 단백질과 관련된 기능을 확립하기 위해 우리는 여러 생물정보학 도구와 분석 형태를 사용했습니다. Gene Ontology(GO) 용어 및 경로 분석은 FunRich[39,40], String[41] 및 Reactome[42]을 사용하여 수행되었습니다. 단백질은 FunRich 유전자 농축 분석을 통해 분류되었습니다. 생물학적 과정과 관련하여, p14 그룹(경도 낭성)의 가장 풍부한 단백질 그룹은 지방산 수송 및 프로스타글란딘 생합성과 관련이 있었고 p12(심각한 낭성) 그룹의 경우 피브리노겐/피브린 활성, 세포-세포/기질 접착 및 대사가 있었습니다. 프로세스(그림 4a, 상단 패널). ANXA2와 피브리노겐 복합체는 각각 p14와 p12 그룹에서 가장 풍부한 두 가지 세포 구성 요소였습니다. 또한, 세포외 공간은 두 그룹 모두에서 단백질 비율이 가장 높은 세포 구성 요소였습니다(그림 4a, 하단 패널). 마찬가지로, 동일한 분석이 문자열 분석을 통해 확립되었으며, 주요 생물학적 과정으로 다양한 대사 과정을 식별하고 가장 풍부한 세포 구성 요소로 세포외 공간을 식별했습니다. GO 결과와 일치합니다(그림 S7a). 마지막으로 우리는 Reactome 플랫폼을 사용하여 분석을 반복하여 신진대사와 면역 체계가 가장 풍부한 경로임을 확인했습니다(그림 S7b).
가능한 단백질-단백질 상호 작용(실험적 증거와의 상호 작용)을 조사하기 위해 문자열 분석을 기반으로 한 단백질-단백질 또는 클러스터 분석도 수행되었습니다. 수많은 단백질 상호 작용이 다른 그룹에서 확인되었지만 (그림 S8), p14의 한 클러스터와 p12의 다른 클러스터는 단백질 간의 상호 작용 수와 발현 수준을 기준으로 가장 관련성이 높습니다 (그림 4b). p14-클러스터에는 섬유소 용해, 세포 운동성(상피 세포에서), 액틴 관련 단백질과 같은 여러 세포 기능과 관련된 부속서 A2 단백질(ANXA2_P07356)이 포함되어 있습니다. 세포골격 및 세포-기질 상호작용[43], 세포내 지질 수송에 관여하는 두 가지 다른 단백질(FABP{10}}P12710 및 FABP{12}Q05816)과 상호작용합니다. 흥미롭게도, 여러 피브리노겐(FGL{15}}Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{22) 사이에 매우 강한 단백질-단백질 상호작용을 갖는 또 다른 관련 단백질 그룹이 p12-클러스터에서 확인되었습니다. }}E9PV24 및 FIBGG_Q8VCM7). 피브리노겐은 간세포 성장에 관여하며 혈소판 확산, 간질 콜라겐 및 섬유성 병변을 매개합니다[44]. 또한, 혈청 아밀로이드 p 성분(SAMP{31}}P12246), 헤모펙신(HEMO{33}}Q91X72) 또는 하이드록시산 산화효소 2(HAOX{)와 같은 추가 단백질이 피브리노겐(그림 S8)과 상호작용하는 것으로 밝혀졌습니다. {37}}Q9NYQ2). 문자열 결과와 일관되게 ANXA2 및 피브리노겐 복합체는 FunRich 분석에 의해 확인된 가장 풍부한 세포 구성 요소였습니다(그림 4a). 흥미롭게도 DDA와 SWATH 분석으로 얻은 데이터를 비교할 때 피브리노겐 복합 단백질(SAMP/Apcs 및 S10A9/S100a9, 표 S3)과 관련된 여러 단백질을 포함하여 SWATH로 식별된 여러 단백질이 DDA 분석으로도 식별되었음을 확인했습니다.
3.4. SWATH-MS 분석의 검증으로 피브리노겐 복합체가 PLD와 관련된 새로운 분자 메커니즘으로 밝혀졌습니다.
이러한 데이터를 기반으로 우리는 RT-qPCR, Western blotting 및 면역 조직 화학을 통한 생체 내 검증을 위해 p12 및 p14 단계에서 피브리노겐 복합체와 관련된 변경된 단백질을 SWATH-MS 분석 (그림 S9)에서 선택하여 가능한 한 확인을 확립했습니다. 질병의 표적. 선택된 단백질 중 10 중 8개가 RT-qPCR에 의해 mRNA 수준에서 검증되었습니다(그림 5). 하나는 14-단계(ANXA2_P07356) 및 p12-그룹(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{에서 상향 조정되었습니다. 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 및 FIBG_Q8VCM7) 및 아래 1개 p12 그룹(HAOX2_Q9NYQ2)에서 규제됩니다. 흥미롭게도 피브리노겐 그룹(ILK 및 S10A9)과의 거리가 멀거나 상호 작용이 적은 두 단백질의 유전자 발현은 검증되지 않은 유일한 단백질이었습니다(그림 5c).
피브리노겐 복합체(ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG 및 HAOX2 단백질)의 상향 조절은 웨스턴 블롯팅(WB) 분석을 통해 추가로 확인되었습니다(그림 6). 전반적으로 유전자 발현과 WB는 SWATH-MS 단백질체 데이터와 매우 일치했습니다. 마지막으로, 우리는 또한 돌연변이 및 다낭성 간 샘플에서 피브리노겐 복합체의 면역조직화학 검증을 수행했습니다(그림 7). 피브리노겐 염색은 낭종 내벽 상피 세포와 담관 확장에서 강력하게 상향 조절되었습니다 (그림 7a). 이러한 결과는 처음으로 피브리노겐 복합체가 간 방광형성과 관련된 가능한 경로이자 PLD에 대한 미래의 치료 목표가 될 수 있음을 밝혀냈습니다.
그림 5. RT-qPCR에 의한 가능한 PLD 표적의 검증. 8 대 10 선택된 표적의 유전자 발현은 SWATH-MS 데이터와 상관관계가 있습니다. 상향 조절된 선택된 p14 표적 아넥신 A2(Anxa2)(a)의 RT-qPCR; 상향 조절된 p12는 아밀로이드 p 성분, 혈청(Apcs, SAMP 유전자), 피브리노겐 유사 1(Fgl1), 피브리노겐 베타 사슬(Fgb), 헤모펙신(Hpx), 피브리노겐 알파 사슬(Fga), 피브리노겐 감마 사슬(Fgg)을 표적으로 합니다. (b) 인테그린 연결 키나아제(Ilk) 및 S10{{3{32}}}} 칼슘 결합 단백질 A9(S1{34}}0a9)(c); 및 하향 조절된 p12 표적 하이드록시산 산화효소 2(Hao2)(d). n= 6은 각 단백질 그룹에 사용되었습니다. Gapdh는 하우스키핑 유전자로 사용되었습니다. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 양측 꼬리를 사용한 스튜던트 t-테스트가 사용되었으며 p < 0.05 값이 유의미한 것으로 간주되었습니다. ns: 유의하지 않음(p 0.05 이상), * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
그림 7. 피브리노겐 복합체는 낭성 상피에서 상향 조절됩니다. ( a, b ) 담관 (상부 패널)과 간 실질 (하부 패널) ( a ) 및 그 정량화 ( b )의 피브리노겐 면역 조직 화학의 대표 이미지. n 각 그룹에는=6가 사용되었습니다. 면역조직화학 분석에서는 낭포성 상피를 통해 피브리노겐이 상향 조절되는 것으로 나타났습니다. 샘플은 p12 그룹에 해당합니다. 스케일 바는 100 µm를 나타냅니다. Bd는 담관을 의미합니다. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 양측 꼬리를 사용한 스튜던트 t-테스트가 사용되었으며 p < 0.05 값이 유의미한 것으로 간주되었습니다. *** p < 0.001.
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